, 饶志明 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122
收稿日期：2019-12-25；接收日期：2020-03-17；网络出版时间：2020-05-08
基金项目：国家重点研发计划(No. 2018YFA0900304)，“****”科技创新领军人才，宁夏回族自治区重点研发计划(No. 2017BY069)资助
摘要：2-O-α-D-甘油葡糖苷是一种在食品、化妆品、保健品及医药领域有着重大应用前景的高附加值产品，但国内仍未实现2-O-α-D-甘油葡糖苷的工业化生产，且鲜有关于2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的相关报道。文中旨在开发一种利用食品安全级重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法，通过构建一株异源表达肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase，SPase)的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-gtfA，并将其用作全细胞催化剂合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，通过优化培养温度、时间及全细胞转化条件，提高其转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的产量。结果表明，重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA在30 ℃下培养20 h，菌体裂解物酶活力最大达1.43 U/mL，并且在1 mol/L蔗糖、2.5 mol/L甘油、pH 7.0、菌体OD600为40、30 ℃下全细胞转化反应48 h，共生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3 g/L，平均转化速率为15.6 mmol/(L·h)，蔗糖转化率约为75.1%，是目前报道的利用重组枯草芽孢杆菌催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的最高产量，这为2-O-α-D-甘油葡糖苷的工业化生产及应用奠定了理论和实验基础。
关键词：2-O-α-D-甘油葡糖苷异源表达枯草芽孢杆菌蔗糖磷酸化酶全细胞催化
Whole-cell biosynthesis of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol by recombinant Bacillus subtilis
Peifeng Duan, Jiajia You, Meijuan Xu, Taowei Yang, Minglong Shao, Xian Zhang
, Zhiming Rao Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Received: December 25, 2019; Accepted: March 17, 2020; Published: May 8, 2020
Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0900304), Scientific and Technological Innovation Leading Talents of National "Ten Thousand Talent Program", Key Research and Development Program of Ningxia Hui Autonomous Region (No. 2017BY069)
Corresponding author: Xian Zhang. E-mail: zx@jiangnan.edu.cn;
Zhiming Rao. Tel: +86-510-85916881; E-mail: raozhm@jiangnan.edu.cn.
Abstract: 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol is a high value-added product with prospective application in food, cosmetics, health products and pharmaceutical industries. However, industrial scale of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol has not yet been applied in China, and there are few related reports on 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol synthesis. The purpose of this experiment is to develop a method for catalyzing the synthesis of food-grade 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol using whole cells of "Generally Recognized as Safe" (GRAS) recombinant Bacillus subtilis. In our work, a recombinant B. subtilis 168/pMA5-gtfA that heterologously expressing Leuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase was constructed and used as a whole-cell catalyst to synthesize 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol. Optimizing the culture temperature, time and whole cell transformation conditions has increased the yield of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol. The results showed that 1.43 U/mL of sucrose phosphorylase was achieved in B. subtilis 168/pMA5-gtfA after culturing for 20 h at 30 ℃ in fermentation medium. The highest conversion rate reached 75.1%, and the yield of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol was 189.3 g/L with an average transformation rate of 15.6 mmol/(L·h) after 48 hours whole-cell transformation with the sucrose concentration of 1 mol/L and the glycerol concentration of 2.5 mol/L at 30 ℃, OD600 40 and pH 7.0. This is the highest yield of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol synthesized catalytically by recombinant B. subtilis that was ever reported, and this study provides the theoretical and experimental basis for the industrial production and application of 2-O-α-D-glu- copyranosyl-sn-glycerol.
Keywords: 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerolheterologous expressionBacillus subtilissucrose phosphorylasewhole cell catalysis
2-O-α-D-甘油葡糖苷(2-O-α-D-glu-copyranosyl- sn-glycerol)是一种由一个葡糖基和一个甘油基通过糖苷键连接的糖苷类物质[1]，在自然界广泛存在，特别是在耐盐的蓝细菌[2]和南非密罗木中，它是密罗木能在极端环境中生存和重新激活复生的最主要的活性物质[3]；另外，在日本清酒中也发现含有活性成分2-O-α-D-甘油葡糖苷[4]。2-O-α-D-甘油葡糖苷对生物体具有保护作用，当细胞处在高渗透压、强紫外线或干旱等恶劣条件下时，它能在细胞表面形成保护膜，从而有效防止蛋白质分子变性、失活[5]，因此，2-O-α-D-甘油葡糖苷可作为蛋白质和酶的稳定剂[6-7]。此外，由于其高保湿性、低吸水性的特点，2-O-α-D-甘油葡糖苷常被用作化妆品原料，以提高皮肤的保湿效果[8-9]；2-O-α-D-甘油葡糖苷还可以作为一种无致龋性的甜味剂添加到食品中[10]。因此，2-O-α-D-甘油葡糖苷在化妆品、食品、医药[11-12]、保健品[13]等领域发挥着重要作用，具有广阔的应用和市场前景；但截至目前，德国的Bitop AG公司是唯一一家在工业规模上实现了2-O-α-D-甘油葡糖苷生产的公司[14]，而国内关于2-O-α-D-甘油葡糖苷的产业化仍处于起步、探索阶段。
2-O-α-D-甘油葡糖苷具有多种合成方式，主要包括化学法合成、微生物合成和酶转化合成[15]。化学法合成的产物中由于存在多种同分异构体[4]，需多步纯化，2-O-α-D-甘油葡糖苷产率较低，工艺复杂[10]，一般不在工业上采用。微生物合成法[2]是指利用经基因改造后的蓝细菌等微生物在盐胁迫条件下进行光合作用合成2-O-α-D-甘油葡糖苷[16]，Martin等曾经报道了利用嗜根寡养单胞菌Stenotrophomonas rhizophilastrain DSM14405合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，但产量仅约为29 mg/L[17]。近些年一些****通过分子改造和胁迫培养条件的优化[18]，提高了生物体内合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的产量，但据报道最高产量也仅约为0.3 g/L[19]，仍不具工业应用价值。酶转化法包括α-葡糖苷酶转化法和蔗糖磷酸化酶转化法[15]。α-葡糖苷酶转化法是以麦芽糖和甘油为底物，通过α-葡糖苷酶的转糖基化，进行体外酶促合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法，转化产物是包括2-O-α-D-甘油葡糖苷在内的3种不同立体异构体的混合物[10]，分离纯化较为困难，生产成本高，不利于大规模生产；蔗糖磷酸化酶转化法是奥地利****Goedl等将蔗糖磷酸化酶基因在大肠杆菌中克隆表达，以蔗糖和甘油为底物，建立的一种酶促合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法[20]，这种方法具有底物原料低廉、产物简单的优点，但也存在转化时间长、体外条件下酶的稳定性差、容易失活等问题，同时大肠杆菌作为宿主菌的安全性问题[21-22]，这都限制了2-O-α-D-甘油葡糖苷在食品、药品领域的工业化应用。
本研究首先将来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides的蔗糖磷酸化酶基因(gtfA)在大肠杆菌Escherichia coli中克隆表达，然后通过Ni-NTA亲和柱对目标产物进行纯化，收集SPase纯酶并测定其酶学性质，再将gtfA基因导入食品安全级枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中，构建重组菌株B. subtilis 168/pMA5-gtfA，通过优化培养条件，改善重组酶在胞内的表达水平，并将重组枯草芽孢杆菌作为全细胞催化剂以蔗糖和甘油为底物合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，反应式如图 1所示。这也是首次将枯草芽孢杆菌全细胞催化的方法应用于2-O-α-D-甘油葡糖苷的合成，同时通过全细胞转化条件优化，获得了较高的蔗糖转化率和2-O-α-D-甘油葡糖苷产量，这为2-O-α-D-甘油葡糖苷的工业化生产提供了实验基础。
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| 图 1 蔗糖磷酸化酶催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷[23] Fig. 1 Synthesis of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol catalyzed by sucrose phosphorylase[23]. |
| 图选项 |
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168、大肠杆菌E. coli BL21(DE3)及质粒pMA5、pET-28a均为本实验室保藏。
1.1.2 酶和试剂BamHⅠ、XhoⅠ等限制性核酸内切酶与DNA聚合酶购于TaKaRa公司；小量质粒提取试剂盒、同源重组试剂盒和胶回收试剂盒购于南京诺维赞生物科技有限公司；2-O-α-D-甘油葡糖购于德国Bitop AG公司；蔗糖、甘油和果糖等分析纯试剂均购于上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.3 培养基LB培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L。
发酵培养基：葡萄糖60 g/L，酵母粉20 g/L，蛋白胨20 g/L，七水合硫酸镁2 g/L，尿素3 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，硫酸锌0.143 g/L，柠檬酸钠5 g/L；pH 7.0–7.2。
1.2 方法1.2.1 引物设计通过NCBI数据库获得编码肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的基因序列，选择合适的酶切位点，设计并合成两对同源臂引物，序列参见表 1。
表 1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study
| Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Size (bp) |
| pET-28a-SP-F | TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATGGAAATTCAAAATAAAGCAA | 42 |
| pET-28a-SP-R | AGCAAATGGGTCGCGGATCCTTACAATTGTTGCTTATCAGCT | 42 |
| pMA5-SP-F | AAGTGAAATCAGGGGGATCCATGGAAATTCAAAATAAAGCA | 41 |
| pMA5-SP-R | CTGGTACGTACCAAGCTAGCTTACAATTGTTGCTTATCAGCT | 42 |
| The italic sequences are the restriction enzyme cutting sites. | ||
表选项
1.2.2 构建重组表达菌株以肠膜明串珠菌基因gtfA为模板，pET-28a-SP-F和pET-28a-SP-R为引物，PCR扩增，并用BamHⅠ和XhoⅠ酶切质粒pET-28a，胶回收酶切产物和PCR产物后用同源重组试剂盒进行连接，然后将连接产物转化入E. coli BL21感受态细胞，涂布浓度为50 μg/mL卡那霉素的LB抗性平板过夜培养，挑取阳性转化子，送苏州金唯智生物科技有限公司测序，若测序正确，即重组菌株E. coli BL21/pET-28a-gtfA构建成功。以基因gtfA为模板，pMA5-SP-F和pMA5-SP-R为引物，PCR扩增，并用BamHⅠ和NheⅠ酶切质粒pMA5，将酶切产物与PCR产物经同源重组连接后转化入E. coli BL21感受态细胞，涂布浓度为100 μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板过夜培养，挑选测序正确的菌株，抽提质粒pMA5-gtfA，转化到B. subtilis 168感受态细胞中，涂布浓度为50 μg/mL卡那霉素的LB抗性平板过夜培养，挑取阳性转化子，送苏州金唯智生物科技有限公司测序，若测序正确，即重组菌株B. subtilis 168/pMA5-gtfA构建成功。
1.2.3 Spase在大肠杆菌中的表达和纯化挑重组菌E. coli BL21/pET-28a-gtfA于10 mL LB培养基中，37 ℃培养11–12 h后，以3% (V/V)的接种量转接100 mL LB培养基，培养至OD600达0.8–1.0时，加入IPTG诱导后，25 ℃培养11–12 h，离心收集菌体，缓冲液悬浮后进行超声破碎，将裂解液低温离心，所得上清即重组菌粗酶液。将粗酶液用0.2 μm滤膜过滤处理，经Ni-NTA亲和柱纯化后收集SPase纯酶，测定其酶学性质。
1.2.4 Spase在枯草芽孢杆菌中的表达挑重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA于10 mL LB培养基中，37 ℃培养11–12 h后，以2% (V/V)的接种量转接100 mL发酵培养基中，30 ℃培养20 h后离心收集菌体，超声破碎后进行SDS-PAGE分析。
1.2.5 酶活测定酶活测定体系为1 mL，其中蔗糖0.4 mol/L，甘油1 mol/L，MES缓冲液(pH 7.0) 50 mmol/L，50 μg纯酶，35 ℃下反应30 min，煮沸10 min终止反应。将反应液用0.2 μm滤膜过滤，稀释后进行HPLC检测。检测条件为[20]：Agilent Hi-Plex Ca色谱柱，RID检测器，超纯水作流动相，柱温85 ℃，流速0.6 mL/min。酶活定义为：每1 min生成1 μmol 2-O-α-D-甘油葡糖苷所需的酶量为1个酶活单位(U)。
1.2.6 酶的最适温度的测定将酶反应体系分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的条件下测定酶活，确定酶反应的最适温度，设置酶活最高组为100%对照。
1.2.7 酶的最适pH的测定将酶反应体系分别在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的条件下测定酶活，确定酶反应的最适pH，设置酶活最高组为100%对照。其中3种不同的缓冲体系：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0–6.0)、MES缓冲液(pH 6.0–8.0)和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.0–10.0)。
1.2.8 酶的温度稳定性的测定取纯酶分别置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的条件下保温，定时取样测定残余酶活，设置初始酶活为100%对照。
1.2.9 酶的pH稳定性的测定取纯酶分别置于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液中，保持2 h后，测定残余酶活，以测得残余酶活最高组为100%对照。
2 结果与分析2.1 肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因gtfA的克隆与表达从NCBI数据库中检索到肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的序列，长度为1 479 bp，合成该序列并作为模板，进行PCR扩增，电泳结果如图 2A所示，可见特异性条带位置与目标基本一致。按照方法1.2.2构建重组菌株E. coli BL21/pET-28a-gtfA，细胞破碎后，SDS-PAGE分析结果见图 2B，重组菌裂解物上清在约56 kDa位置表达有明显的蛋白质特征条带，与报道中的分子量一致[24]，且经Ni-NTA亲和柱纯化后的重组蛋白在相应大小位置也有单一条带，这表明基因gtfA在大肠杆菌中成功表达。
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| 图 2 gtfA基因的克隆(A)、表达及纯化分析(B) Fig. 2 The result of gtfA gene cloning (A), expression and purification (B). (A) Lane M: DL 10 000 marker; lane 1–2: Gene gtfA. (B) lane M: protein marker; lane 1: E. coli BL21/pET-28a crude enzyme; lane 2: E. coli BL21/pET-28a-gtfA crude enzyme; lane 3: purified SPase. |
| 图选项 |
2.2 温度和pH对SPase酶活力和稳定性的影响2.2.1 温度对SPase酶活力和稳定性的影响在不同温度下测定SPase的酶活力，结果如图 3A所示，酶的最适反应温度为35 ℃，在20–45 ℃之间时具有较高酶活力，当温度超过45 ℃时，酶活力开始迅速下降。研究温度对SPase稳定性的影响，结果见图 3B，可以看出，SPase在30 ℃、35 ℃保温120 min后的残余酶活力仍然高于80%，而在45 ℃保温80 min后的残余酶活力几乎为零，这表明它在30–35 ℃范围内有较好的稳定性。
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| 图 3 SPase的最适温度(A)和温度稳定性(B) Fig. 3 Optimal temperature (A) and the temperature stability (B) of SPase. |
| 图选项 |
2.2.2 pH对SPase酶活力和稳定性的影响在不同pH下测定SPase的酶活力，结果见图 4A。可以看出，酶的最适反应pH为7.0，在pH处于6.0–8.0之间时具有较高酶活力。研究pH对SPase稳定性的影响，结果见图 4B，SPase在pH 6.0–7.0下保持2 h后的残余酶活力仍在90%以上，表明其在此pH范围内有较好的稳定性。
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| 图 4 SPase的最适pH (A)和pH稳定性(B) Fig. 4 Optimal pH (A) and the pH stability (B) of SPase. pH 3.0–6.0: citric acid-sodium citrate buffer; pH 6.0–8.0: MES buffer; pH 8.0–10.0: glycine-sodium hydroxide buffer. |
| 图选项 |
2.3 SPase在枯草芽孢杆菌中的表达枯草芽孢杆菌通常被认为是一种食品安全级菌种，因此我们选择枯草芽孢杆菌作为宿主，用来开发2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的全细胞生物催化方法。按照1.2.2中的方法构建重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA，加入溶菌酶后超声破碎，SDS-PAGE分析结果如图 5所示，重组菌破壁上清在约56 kDa大小处表达有清晰的蛋白条带，即表明SPase在宿主B. subtilis 168中成功表达。
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| 图 5 SPase在枯草芽孢杆菌中的表达 Fig. 5 Expression of SPase in B. subtilis. M: protein marker; lane 1: B. subtilis 168/pMA5 crude enzyme; lane 2: B. subtilis 168/pMA5-gtfA crude enzyme; lane 3: B. subtilis 168/pMA5-gtfA fermentation broth. |
| 图选项 |
2.4 优化SPase在枯草芽孢杆菌中的表达为了后续利用构建的重组枯草芽孢杆菌作为全细胞催化剂来合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，通过优化菌株培养温度和培养时间，改善SPase在宿主枯草芽孢杆菌的表达水平，以提高重组菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的能力。
2.4.1 培养温度的优化本研究所用pMA5质粒搭载的是一种组成型的启动子[25]，不需要其他因子的诱导，外源基因即可稳定表达，但其在宿主菌中表达水平的高低，会受环境因素的影响。按方法1.2.4接种重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA，转接100 mL发酵培养基，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下培养16 h后，破碎细胞进行酶活力测定。结果显示(图 6A)，在30 ℃下培养时，测得菌体裂解物的酶活力最高，为1.31 U/mL；温度低于30 ℃时，菌株的生长代谢速度过慢，表达量较低；而培养温度高于35 ℃时，由于酶的热稳定性不佳，在较高温度下，酶活性会逐渐丧失，所以测得的酶活也较低。
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| 图 6 培养温度(A)及培养时间(B)对枯草芽孢杆菌中SPase表达的影响 Fig. 6 Influence of culture temperature (A) and time (B) on SPase expression in Bacillus subtilis. |
| 图选项 |
2.4.2 培养时间的优化按方法1.2.4接种重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA，转接100 mL发酵培养基后，30 ℃分别培养12、14、16、18、20、22、24 h后，破碎细胞进行酶活力测定。结果显示(图 6B)，培养20 h时菌体裂解物酶活力达到最高，为1.43 U/mL；继续延长培养时间，酶活力并没有提高，可能是因为在发酵后期，其他代谢副产物的大量积累，影响了目的酶的表达。
2.5 重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的条件优化2.5.1 温度对全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影响温度通过影响菌体状态和酶促反应的效率而影响2-O-α-D-甘油葡糖苷的合成。按方法1.2.4接种重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA，转接发酵培养基，30 ℃培养20 h后离心收集菌体，进行全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷。控制初始反应pH 7.0，蔗糖1 mol/L，甘油1 mol/L，菌体OD600为20，反应温度分别为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的条件下进行全细胞转化反应。结果如图 7A所示，全细胞转化反应温度为30 ℃时，蔗糖转化率最高，达到53.2%，2-O-α-D-甘油葡糖苷产量为134.8 g/L；在45 ℃时，蔗糖转化率较低，仅为28.4%。
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| 图 7 温度(A)、pH (B)、菌体密度(C)及底物浓度(D)对重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影响 Fig. 7 Influence of temperature (A), pH (B), cell density (C) and substrate concentration (D) on the transformation of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol in recombinant B. subtilis 168/pMA5-gtfA whole cells. |
| 图选项 |
2.5.2 初始pH对全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影响按方法1.2.4接种重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA，转接发酵培养基，30 ℃培养20 h后离心收集菌体，进行全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，理论上转化反应过程中pH无明显变化，探究初始pH对全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影响。控制反应温度为30 ℃，蔗糖浓度1 mol/L，甘油浓度1 mol/L，菌体OD600为20，初始pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的条件下进行全细胞转化反应。结果如图 7B所示，在pH小于7.0时，蔗糖转化率随pH的升高而增加，在pH 6.5–7.5时，产率较高，其中，pH 7.0时最高为53.5%。
2.5.3 菌体量对全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影响在转化反应中将菌体浓度控制在适宜的水平，对满足生产需要和降低生产成本是至关重要的。按方法1.2.4接种重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA，转接发酵培养基，30 ℃培养20 h后离心收集菌体，进行全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷。控制反应温度为30 ℃，初始pH 7.0，蔗糖浓度1 mol/L，甘油浓度1 mol/L，菌体OD600分别为10、20、30、40、50、60、70、80的条件下进行全细胞转化反应。结果如图 7C所示，转化体系菌体OD600为40时，蔗糖转化率最高，达到61.7%，2-O-α-D-甘油葡糖苷产量为156.5 g/L；菌体量继续增加，转化率并没有随之提高，可能是因为转化体系中，小部分的蔗糖被菌体自身用于维持基本的生命活动所消耗。
2.5.4 底物浓度对全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影响当反应体系中没有磷酸盐的情况下，蔗糖磷酸化酶催化蔗糖分解为果糖和葡糖基-酶中间体，并以甘油为受体催化转糖基反应合成2-O-α-D-甘油葡糖苷。理论上，蔗糖和甘油合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的摩尔比为1︰1，但以甘油为受体的转糖基反应是一个可逆反应，反应中使甘油过量，可能会促使蔗糖得到较高的转化率。所以，控制反应温度30 ℃，初始pH 7.0，菌体OD600为40，蔗糖浓度1 mol/L，设置不同浓度蔗糖和甘油的摩尔配比的条件下进行全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，结果如图 7D所示，转化体系中的蔗糖和甘油的摩尔配比为1︰2.5时，蔗糖转化率达76.3%，继续增大甘油浓度，转化率并没有随之提高。
2.6 5 L发酵罐全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷为验证重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA在大体系中的转化水平，在实验室5 L发酵罐进行初步测试。用1 L 50 mmol/L的MES缓冲液悬浮B. subtilis 168/pMA5-gtfA菌体，控制反应温度30 ℃，初始pH 7.0，蔗糖1 mol/L，甘油2.5 mol/L，菌体OD600为40的条件下于5 L发酵罐上进行转化，HPLC分析检测转化液中各组分含量。结果如图 8所示，前期的转化速率较快，在24 h后反应逐渐减慢，至48 h转化率基本达到最大，共生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3 g/L，平均转化速率为15.6 mmol/(L·h)，蔗糖转化率约为75.1%。可以发现，反应后期继续延长转化时间，转化率变化不明显，出现这种情况的原因，一方面可能是由于反应趋于平衡，另一方面可能是因为转化时间较长，酶活力逐渐丧失。
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| 图 8 重组菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA在5 L发酵罐全细胞转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷 Fig. 8 The recombinant B. subtilis 168/pMA5-gtfA whole cells catalyze the synthesis of 2-O-α-D-glu- copyranosyl-sn-glycerol in 5 L fermenter. |
| 图选项 |
3 讨论本研究将肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因gtfA在大肠杆菌中进行克隆表达，研究其酶学性质，再将gtfA基因导入食品安全级枯草芽孢杆菌，用来开发2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的全细胞生物催化方法。成功构建重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA，通过优化培养条件，实现了蔗糖磷酸化酶在重组枯草芽孢杆菌胞内的高效表达，并将重组菌用作全细胞生物催化剂合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，利用优化后的全细胞转化条件，在30 ℃、pH 7.0、菌体OD600为40、底物蔗糖浓度1 mol/L、甘油浓度2.5 mol/L的条件下，在5 L发酵罐进行全细胞转化48 h后，生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3 g/L，平均转化速率为15.6 mmol/(L·h)，蔗糖转化率约为75.1%，这是目前报道的利用重组枯草芽孢杆菌催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的最高产量。2-O-α-D-甘油葡糖苷是一种在食品、化妆品、保健品及医药领域有着重大应用前景的高附加值产品，本研究首次利用枯草芽孢杆菌全细胞转化的方法应用于合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，与酶法合成相比，全细胞催化发生在胞内，反应更稳定，可重复利用率高，而且省去了酶法催化前期所需破碎细胞的过程，工艺流程更简便，经济效益更高；另外，将食品安全级菌株用作表达宿主，也拓宽了产品在食品、医药领域的应用。然而，在合成2-O-α-D-甘油葡糖苷上，不管是酶法合成，还是全细胞催化方法，最终转化液中都有一定浓度的蔗糖和果糖存在，虽然有研究报道过一种从转化液中分离纯化出2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法，但也仅有63%的产品收率[20]。所以，仍需要通过改进下游分离纯化工艺[26]，以进一步提高2-O-α-D-甘油葡糖苷收率。总之，本研究所构建的重组枯草芽孢杆菌全细胞催化方法及其相关研究结果，为2-O-α-D-甘油葡糖苷的工业化生产及应用奠定了理论和实验基础。
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