李晨星, 侯晓冬, 郭保党, 饶义剑
江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122
收稿日期：2019-11-28；接收日期：2020-02-04
基金项目：国家重点研发计划(No. 2018YFA0901700)资助

摘要：细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases)是一种广谱催化剂，可以催化多种类型反应而参与生物体外源物质代谢与天然产物的合成。为丰富P450作为合成生物学的酶元件库，并探索新型催化反应，利用生物信息学手段从争论贪噬菌Variovorax paradoxus S110中挖掘出一种新型电子自供体细胞色素P450_VpMO单加氧酶，属于CYP116B家族，它可以在大肠杆菌Escherichia coli异源可溶表达。酶学性质研究表明P450_VpMO最适pH和最适温度分别为8.0和45 ℃，并且在温度低于35 ℃时具有良好的稳定性，K_m值为0.458 mmol/L，k_cat为2.438 min^–1；重要的是重组P450_VpMO可以催化一系列包含污染物的含甲氧基底物进行脱甲基反应，其中对4-甲氧基苯乙酮的脱甲基反应转化率高达91%。相比于其他CYP116B家族的P450酶，P450_VpMO表现出较强的酶活性，这为后期进一步研究P450_VpMO提供了基础。
关键词：P450单加氧酶P450_VpMO争论贪噬菌一氧化碳示差法酶学性质脱甲基反应
Expression and characterization of a novel cytochrome P450 enzyme from Variovorax paradoxus S110
Chenxing Li, Xiaodong Hou, Baodang Guo, Yijian Rao
Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Received: November 28, 2019; Accepted: February 4, 2020
Supported by: National Key R & D Program of China (No. 2018YFA0901700)
Corresponding author: Yijian Rao. Tel: +86-510-85912322; E-mail: raoyijian@jiangnan.edu.cn.

Abstract: Cytochrome P450 monooxygenases as powerful biocatalysts catalyze a wide range of chemical reactions to facilitate exogenous substances metabolism and biosynthesis of natural products. In order to explore new catalytic reactions and increase the number of P450 biocatalysts used in synthetic biology, a new self-sufficient cytochrome P450 monooxygenase (P450_VpMO), belongs to CYP116B class, was mined from Variovorax paradoxus S110 genome and expressed in Escherichia coli. Based on characterization of the enzymatic properties, it shows that the optimal pH and temperature for P450_VpMO reaction activity are 8.0 and 45 ℃, respectively. P450_VpMO is relatively stable at temperatures below 35 ℃. The K_m and k_cat of P450_VpMO toward 4'-Methoxyacetophenone are 0.458 mmol/L and 2.438 min^-1, respectively. Importantly, P450_VpMO was able to catalyze the demethylation reaction for a range of substrates containing methoxy group. Its demethylation reactivity is reasonably better than other P450s belongs to CYP116B class, particularly, for 4-methoxyacetophenone with a great conversion efficiency at 91%, showing that P450_VpMO could be used as a great biocatalyst candidate for further analysis.
Keywords: P450_VpMOVariovorax paradoxusCO-difference spectroscopyenzymatic propertydemethylation
合成生物学的基础是对各种生物元件进行人工设计并经过有序组装，以实现复杂的、新的生物功能，从而建立药物、功能材料或能源替代品等的绿色生物制造；而其中催化元件，即功能酶分子的挖掘和应用是合成生物学研究的核心^[1]。细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases，EC: 1.14.14.1)是一类广泛存在于自然界中的含有亚铁血红素-硫醇盐(Heme-thiolate)的超家族氧化酶^[2-3]。它可在温和条件下，立体选择性地催化各种类型的化学反应，如C-H羟基化、烯烃环氧化和O-脱烷基化等^[4-5]，而参与生物体一系列初级和次级代谢产物的生物合成，如类固醇、萜类、生物碱、类黄酮等^[6]，因此，P450酶已成为一类重要的合成生物学催化元件，并用于一系列的绿色生物催化有机合成反应^[7-9]。并且由于P450酶的氧化功能较化学氧化反应而言优势明显^[10]，因而被广泛应用于药物、维生素、杀虫剂、香料等产品的生产^[11]；特别是能在抗癌药物紫杉醇合成过程中起重要作用^[12]。此外，P450酶也可以参与外源性难降解有机物的生物氧化，在环境污染物的降解和生态修复等方面也发挥着重要的作用^[13-14]。
基于电子传递系统的不同，P450酶在传统上可以分为2大类^[15-16]：ClassⅠ为利用铁硫簇(Fe₂S₂)的铁氧还蛋白(Ferredoxin，Fdx)与FAD的铁氧还蛋白还原酶(Ferredoxin reductase，FdR)进行分子间电子传递；ClassⅡ为通过含有FAD/ FMN的细胞色素P450酶还原酶(Cytochrome P450 reductase，CPR)进行分子间电子传递，然而它们通常是以独立的蛋白存在来催化各种化学反应。近些年来，随着P450酶元件的不断挖掘，发现P450酶分子可以与电子供体蛋白天然融合成一体，而实现分子内的电子自给自足高效传递(Self-sufficient electron transfer systems)。比如，来自巨大芽孢杆菌Bacillus megatherium的P450BM3 (CYP102A)融合了双黄素(FAD/FMN)氧化还原伴侣结构域(CPR)和P450结构域^[17-18]；红球菌Rhodococcus NCIMB9784的P450_RhF (CYP116B2)融合了Fe?S簇铁氧还蛋白(Fe/S)、黄素单核苷酸(FMN)氧化还原伴侣结构域以及P450催化结构域^[19]。由于这类P450酶分子具有高效的电子传递效率，可以实现P450酶催化反应的快速发生。因此，对于该类P450酶分子的挖掘、改造和定向进化已成为研究热点。
前期的研究发现争论贪噬菌Variovorax paradoxus可以有效地降解环境中的蒽、对酞酸二甲酯等污染物，且发现在对酞酸二甲酯的降解过程中发生脱甲基反应^[20]。由于细胞色素P450酶清除环境污染物的主要功能之一为脱甲基^[21]，因而推测V. paradoxus的此功能与其体内所含有的P450酶相关。为此，本研究从基因库中检索了一个来源于V. paradoxus S110的细胞色素P450单加氧酶基因^[22]，经过系统命名属于CYP116家族，CYP116B256V2，简称为P450_VpMO，之后经密码子优化后实现在大肠杆菌Escherichia coli BL21中异源表达。重组P450_VpMO经过纯化后，以4-甲氧基苯乙酮为模式底物测定其酶学性质，同时对其他多种含甲氧基底物进行底物谱拓展分析(图 1)，发现其对这些底物均有较高的酶催化活性。

图 1 P450VpMO脱甲基反应方程式 Fig. 1 The proposed demethylation reaction by P450VpMO

图选项

1 材料与方法1.1 菌株、质粒和培养基大肠杆菌E. coli TOP10和BL21 (DE3)由本实验室保存，分别用于质粒抽提和蛋白表达；载体pET-21b由本实验室保存，用于重组质粒的构建。LB培养基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L氯化钠；2×YT培养基：16 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，5 g/L氯化钠。
1.2 主要试剂及仪器异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、5-氨基乙酰丙酸(ALA)和质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；标准分子量蛋白购自大连TaKaRa公司；葡萄糖脱氢酶(GDH)由本实验室制备保存；4-甲氧基苯乙酮(1)、6-甲氧基喹啉(2)、7-甲氧基香豆素(3)、4-甲氧基苯甲腈(4)、6-甲氧基-1-萘满酮(5)、2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮(6)、7-甲氧基-1-萘满酮(7)和4-甲氧基二苯甲酮(8)、甲氧苄啶(9)购置于萨恩化学技术有限公司。
?KTA pure蛋白纯化仪购自美国GE公司；安捷伦1260高效液相色谱(HPLC)购自美国安捷伦公司。
1.3 P450_VpMO基因的克隆在UniProt上检索并获得来源于V. paradoxus S110细胞色素P450家族的氨基酸序列(UniProt: C5CTM5)及基因序列(GenEMBL: ACS20213或GenBank: WP_012748691)。基于E. coli密码子偏好性对基因序列优化，并在5′端加入6×His-tag核酸序列用于后期的纯化，之后由天霖生物科技(上海)有限公司合成，并连接至pET-21b表达载体上获得重组质粒pET-21b-P450_Vpmo，导入至E. coli Top10感受态中，提取质粒进行DNA测序验证。正确的pET-21b-P450_Vpmo转化至E. coli BL21表达菌株中得到重组菌E. coli/P450_Vpmo。
1.4 重组P450_VpMO在E. coli中的表达与纯化挑取重组菌E. coli/P450_Vpmo转接到含100 μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中于37 ℃、200 r/min振荡培养10 h，以2% (V/V)接种量转接至500 mL的2×YT培养基中，37 ℃、200 r/min下培养至OD₆₀₀在0.8–1.0时加入终浓度均为0.2 mmol/L的IPTG和ALA (其中IPTG为诱导剂，ALA为P450辅酶因子血红素前体物质5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid))于16 ℃诱导培养16 h后，离心收集菌体^[23]。湿菌体用缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，10%甘油，pH 8.0)重悬制备100 mg/mL菌悬液。高压匀浆机破碎细胞后于4 ℃、40 000×g离心30 min，收集上清液。上清液采用镍柱进行纯化，用含100 mmol/L咪唑缓冲液(pH 8)对目的蛋白洗脱收集；用脱盐柱(Histrp^TM 5 mL Desalting)脱盐，脱盐缓冲液(25 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，10%甘油)，脱盐后超滤浓缩至10 mg/mL，?80 ℃保存。
1.5 重组P450_VpMO的光谱特性分析采用一氧化碳示差法对重组P450_VpMO进行光谱鉴定^[24-25]。首先，在玻璃比色皿中加入150 μL 10 mg/mL P450_VpMO纯酶液和2.85 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L，pH 8.0，含1 mmol/L EDTA，20%甘油和1 μg/mL藏红T)混合均匀，采用紫外可见型分光光度计(日立U-3900)在400–500 nm的波长范围内扫描。然后，在玻璃比色皿中加入适量连二亚硫酸钠将氧化态P450_VpMO还原后，在400–500 nm的波长范围内扫描。最后，通入一氧化碳30 s使得一氧化碳与还原态P450_VpMO充分结合后，在400–500 nm的波长范围内扫描，观察3种状态P450_VpMO特征吸光值的变化。以磷酸钾缓冲液作为空白对照。
1.6 重组P450_VpMO的酶活力测定方法以4-甲氧基苯乙酮为模式底物，测定重组P450_VpMO的酶活力。构建200 μL Tris-HCl (50 mmol/L，pH 8.0)反应体系：2 mmol/L底物、5 mmol/L葡萄糖、0.5 mmol/L辅酶NADP⁺、0.24 mg/mL GDH和1.3 mg/mL的P450_VpMO纯酶，于30 ℃下反应10 min后，加入等体积甲醇终止反应，样品使用HPLC检测。酶活力单位(U)定义为每分钟生成1 μmol的产物所需的酶量。
HPLC检测条件：色谱柱为XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温为30 ℃；检测波长为280 nm，流动相为甲醇(A)和水(B)，梯度洗脱程序为：0–20 min由20% A线性变化至100% A。4-甲氧基苯乙酮及其产物的出峰时间分别为13.3 min和9.4 min。
1.7 重组P450_VpMO的酶学性质分析1.7.1 pH与温度对重组P450_VpMO酶活力的影响配制不同pH缓冲液(50 mmol/L醋酸-醋酸钠pH 5.5–6.0；磷酸二氢钠-磷酸氢二钠pH 6.0–7.5；Tris-HCl pH 7.5–9.0)。按照方法1.6，测定P450_VpMO在不同pH条件下的酶活力。在最适pH下，按方法1.6测定P450_VpMO在不同温度下(20–55 ℃)的酶活力。最适反应pH和温度分别定义为最高酶活力(以相对酶活力100%计)所对应的pH值和温度。
1.7.2 重组P450_VpMO的温度稳定性将P450_VpMO酶液分别置于20–45 ℃条件下孵育1 h后于冰上冷却，按照方法1.6测定P450_VpMO的残余酶活力。将P450_VpMO分别置于35 ℃、40 ℃和45 ℃温度下孵育不同时间，按照方法1.6测定P450_VpMO的残余酶活力。半衰期t_1/2指在不同温度下处理后残余酶活力为50%时所对应的时间。以未经处理的酶液作为对照。
1.7.3 重组P450_VpMO的动力学参数测定以不同浓度(0.2–3.0 mmol/L)的4-甲氧基苯乙酮作为底物，按方法1.6测定P450_VpMO的初始反应速率，利用GraphPad Prism8按米氏方程进行非线性拟合，计算P450_VpMO的动力学参数K_m与V_max值。
1.8 重组P450_VpMO的底物谱分析选定8种含甲基底物进行P450_VpMO底物谱分析。构建200 μL Tris-HCl (50 mmol/L，pH 8.0)反应体系：0.5 mmol/L底物，5 mmol/L葡萄糖，0.5 mmol/L NADP⁺，0.24 mg/mL GDH和1.3 mg/mL P450_VpMO纯酶，于30 ℃条件下反应3.5 h，加入等体积甲醇终止反应，样品采用HPLC检测。
HPLC检测条件：底物1–8除检测波长(1：280 nm，2：232 nm，3：232 nm，4：254 nm，5：280 nm，6：280 nm，7：254 nm，8：280 nm)差异外，其他工作条件为通用条件；色谱柱为XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温为30 ℃；流动相为甲醇(A)和水(B)；梯度洗脱程序为：0–20 min由20% A线性变化至100% A。底物9的液相检测条件为：色谱柱为XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温为30 ℃；流动相为0.1%磷酸水和0.1%磷酸-乙腈溶液；等度洗脱程序为：88%的0.1%磷酸-乙腈溶液与12%的0.1%磷酸水溶液等度洗脱15 min；检测波长为240 nm。
2 结果与分析2.1 重组P450_VpMO的一级结构分析P450_VpMO的一级结构分析表明，该酶含782个氨基酸(aa)，由P450催化结构域(15–439 aa)、黄素单核苷酸(FMN)还原酶结构域(475–682 aa)和Fe?S簇铁氧还蛋白结构域(698–781 aa)组成。根据电子传递分类规则，表明P450_VpMO为电子自供体类型的P450s^[26]。将P450_VpMO氨基酸序列提交细胞色素P450国际命名委员会(http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html)，被命名为CYP116B256V2，进一步采用MEGA5.0构建已报道15种CYP116B亚家族P450s的系统发育进化树(图 2)，结果显示P450_VpMO与其他15种P450s相似度为51.2%–75.2%，为一种新型CYP116B亚家族P450s成员，其性质和功能值得进一步探索。

图 2 已报道的CYP116B亚家族P450s与P450VpMO的系统发育进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree of the reported P450s from CYP116B subfamily and P450VpMO. CYP116B1 (Q1LDI2)[27], CYP116B2 (Q8KU27)[19], CYP116B3 (Q52TE7)[28], CYP116B4 (A0P0F6)[23], CYP116B5 (G9BWN9)[29], CYP116B29 (D6Y814)[30], CYP116B46 (A0A0K6ITW2)[31], CYP116B49 (A5VAX9), CYP116B62 (A0A2P1MAG0)[32], CYP116B63 (A0A1H5TZK0)[26], CYP116B64 (A0A1G8Z9C6)[26], P450SMO (C7SFP5)[33], P450RpMO (H0JTW1)[26], P450ArMO (D0T4J7)[26], P450CtMO (H1RWRO)[26] and CYP116B256V2 (C5CTM5, this study). The UniProt numbers are in brackets

图选项

2.2 重组P450_VpMO的表达与纯化重组菌E. coli/P450_Vpmo经IPTG诱导P450_VpMO表达，SDS-PAGE结果如图 3A所示，与E. coli/P450_Vpmo未诱导全细胞相比比较，E. coli/P450_Vpmo破碎上清液和Ni柱纯化后重组P450_VpMO中均在87 kDa处有明显的条带，其表观分子量与理论分子量符合；此外，纯化的该酶样品与其他类型酶如葡萄糖脱氢酶GDH相比呈现出P450酶分子特有的结合血红素带来的浅红色(图 3B)，表明P450_VpMO在E. coli中实现了可溶表达。

图 3 重组P450VpMO表达纯化的SDS-PAGE分析以及纯化后P450VpMO与GDH颜色对比图 Fig. 3 Characterization of P450VpMO. (A) SDS-PAGE analysis of the expression and purification of P450VpMO. M: protein marker, lane 1: the cell-free extract of E. coli/P450Vpmo without induction; lane 2: the supernatant of E. coli/P450Vpmo with IPTG induction; lane 3: purified P450VpMO. (B) The special color of P450VpMO in contrast with GDH

图选项

2.3 重组P450_VpMO的光谱特性分析由于细胞色素P450单加氧酶都具有特定的光谱学特征^[24]。首先应用一氧化碳示差法来测定重组P450_VpMO是否有相关特性。经过测定，当使用纯化后重组P450_VpMO直接进行光谱特性分析时，重组P450_VpMO在420 nm处有特定的吸收波长如图 4A，然后用连二亚硫酸钠将其还原后其特征峰如图 4B所示，最后通入一氧化碳，其吸收波长会偏移至450 nm处(图 4C)。这一特殊的光谱特性，进一步证实该酶为细胞色素P450单加氧酶。

图 4 重组P450VpMO的吸收光谱图 Fig. 4 UV/Vis absorption spectra of purified P450VpMO. A: the oxidized enzyme. B: the dithionite-reduced enzyme was shown. C: the reduced P450VpMO CO-bound complex

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2.4 pH与温度对重组P450_VpMO酶活力的影响如图 5A所示，当pH为8.0时P450_VpMO酶活力最高；当pH小于8.0时，其酶活力缓慢下降；当pH大于8.5时其活力快速下降；pH为5.5和9.0时，仅为15%和8%的相对酶活。如图 5B所示，P450_VpMO酶活力随温度的提高而升高，当温度高于45 ℃时P450_VpMO的酶活力迅速降低。由此确定重组P450_VpMO最适反应pH和温度分别为8.0和45 ℃。如表 1所示，P450_VpMO酶的最适pH与CYP116B家族中P450_LaMO的相同，而最适温度均高于CYP116B家族中的P450_LaMO (40 ℃)^[23]和P450_SMO (30 ℃)^[33]。

图 5 pH (A)和温度(B)对重组P450VpMO酶活力的影响 Fig. 5 Effects of pH (A) and temperature (B) on the activity on recombinant P450VpMO

图选项

表 1 CYP116B家族P450酶的酶学性质比较Table 1 A comparison of enzymatic characterization of CYP116B family

P450s	pH	Tm (℃)	T50(℃)
P450VpMO	8	45	38
P450SMO	7	30	–
P450-Hal1	8.5	–	34
P450LaMO	8	40	–
“–”indicate which was not reported; pH indicates the optimal pH; Tm indicates the optimal temperature; T50 indicates the half-inactivation temperature.

表选项


2.5 温度对重组P450_VpMO稳定性的影响接下来测定重组P450_VpMO在不同温度下孵育1 h后其残余酶活力。如图 6A所示，当温度低于30 ℃时，P450_VpMO的残余酶活力可保持80%以上；40 ℃和45 ℃孵育1 h，其残余酶活力仅为40%和0%。其半失活温度大约为38 ℃，略高于CYP116B62的半失活温度(34 ℃)^[32]。如图 6B所示，重组P450_VpMO在35 ℃、40 ℃和45 ℃条件下孵育不同时间测定残余酶活力，其半衰期t_1/2分别为130 min、40 min和4 min (图 6B)。在低于35 ℃时，重组P450_VpMO稳定，故选择30 ℃作为其催化反应温度用于后续的反应测试。此外，将重组P450_VpMO的相关酶学性质与同类酶相比较(表 1)，发现其最适温度和半失活温度均高于同类酶，表明该酶具有良好温度稳定性，适合后期应用研究。

图 6 温度对重组P450VpMO稳定性的影响 Fig. 6 Effect of temperature on stability of recombinant P450VpMO

图选项

2.6 P450_VpMO动力学参数测定由于V. paradoxus 具备可以降解环境中含有甲氧基的污染物的能力^[20]，为此本实验选择以结构相对简单的4-甲氧基苯乙酮为模式底物，按照方法1.6研究和测定P450_VpMO的动力学常数。非线性拟合的结果符合Michaelis-Menten方程(图 7)，测得重组P450_VpMO的K_m和V_max值分别为0.458 mmol/L和0.028 μmol/(mg·min)，以分子量为87.072 kDa计算其k_cat值为2.438 min^–1，催化效率k_cat/K_m为5.318 mmol/(L·min)。

图 7 重组P450VpMO的动力学参数的非线性拟合 Fig. 7 Nonlinear fitting curves of kinetic parameters of recombinant P450VpMO

图选项

2.7 重组P450_VpMO的底物谱探索最后按照方法1.8，检测重组P450_VpMO是否也可以催化其他能够被不同CYP116B家族P450催化而脱甲基的底物，分别为4-甲氧基苯乙酮^[30] (1)、6-甲氧基喹啉^[23](2)、7-甲氧基香豆素^[32](3)、4-甲氧基苯甲腈^[30](4)、6-甲氧基-1-萘满酮^[21](5)、2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮^[30](6)、7-甲氧基-1-萘满酮^[21] (7)和4-甲氧基二苯甲酮^[30](8)。结果如图 8所示，重组P450_VpMO对这些含甲氧基的底物均具有较强的脱甲基功能。相比于CYP116B家族其他P450，重组P450_VpMO对4-甲氧基苯乙酮的转化率高于P450-TT (CY116B46，32%)^[30]，对7-甲氧基香豆素的转化率高于P450Hal-1 (CYP116B62，35%)^[32]；对4-甲氧基二苯甲酮的转化率高于P450_RhF (CYP116B2，13%)^[30]；对2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮的转化率高于P450-AX (CYP116B64，10%)^[30]；对4-甲氧基苯甲腈的转化率高于P450-TB (CYP116B29，12%)^[30]。由此结果显示重组P450_VpMO在同类酶中转化效率较高，具有一定研究价值。

图 8 重组P450VpMO对催化不同含甲氧基底物的转化率 Fig. 8 The conversion of different methoxy-substrates catalyzed by recombinant P450VpMO

图选项

2.8 重组P450_VpMO对甲氧苄啶的降解测试鉴于P450_VpMO酶有较好的脱甲基功能，随后测定其能否降解含甲氧基的抗生素污染物甲氧苄啶，实验表明该酶对甲氧苄啶有一定降解作用(图 9)。然而，该反应降解效率不到5%，故在后续研究中会进一步对反应条件进行优化，并利用分子生物学技术对P450_VpMO进行定向进化来提高该酶对甲氧苄啶的降解效率。

图 9 P450VpMO催化甲氧苄啶的HPLC检测 Fig. 9 Analysis of Trimethoprim degradation catalyzed by P450VpMO

图选项

3 结论由于细胞色素P450单加氧酶可催化多种不同类型的化学反应而参与天然产物的生物合成，因此，它是合成生物学重要的催化元件和绿色的生物催化剂。本研究全基因合成了一种来源于争论贪噬菌V. paradoxus S110的细胞色素P450单加氧酶基因，并成功地在大肠杆菌中可溶表达。通过一级序列和一氧化碳示差法分析表明P450_VpMO为一种新型电子自供体类P450s，隶属于为CYP116B亚家族；并对这种新型电子自供体P450_VpMO的酶学性质和脱甲基功能作了初步探索，发现该酶具有降解抗生素甲氧苄啶的重要作用，这为后期对该酶的定向进化改造以及拓展该类酶的应用奠定了基础。
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