詹元龙, 赵瑞英, 崔鸿亮, 李华泰, 宋志峰, 刘长莉
东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040
收稿日期：2019-09-03；接收日期：2019-10-10
基金项目：中央高校研究项目(Nos. 2572018CJ01, 2572019BD05)，国家自然科学基金(No. 51678120)资助

摘要：3-羟基丙酸(3-HP)作为一种重要的平台化合物，以此为底物能够合成多种具有商业潜质的生物制品。野生菌合成3-HP产量较低，严重限制3-HP的大规模应用与生产，通过改造合成代谢通路的相关基因，构建以廉价底物为碳源的工程菌株，实现降低生产成本提高产量的目的。文中将对近年来国内外通过代谢工程合成3-羟基丙酸的研究进展进行概述，并对甘油途径、丙二酸单酰辅酶A途径、β-丙氨酸等途径合成3-HP的优缺点进行总结分析，对3-HP未来发展前景进行展望。
关键词：3-羟基丙酸代谢工程甘油途径丙二酸单酰辅酶A途径β-丙氨酸途径
Progress in metabolic engineering of biosynthesis of 3-hydroxypropionic acid
Yuanlong Zhan, Ruiying Zhao, Hongliang Cui, Huatai Li, Zhifeng Song, Changli Liu
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China
Received: September 3, 2019; Accepted: October 10, 2019
Supported by: Research Funds for the Central Universities (Nos. 2572018CJ01, 2572019BD05), Natural Natural Science Foundation of China (No. 51678120)
Corresponding author: Changli Liu. Tel/Fax: +86-451-82192073; E-mail: liuchangli@nefu.edu.cn.

Abstract: As an important platform compound, 3-hydroxypropionic acid (3-HP) can be used as a substrate to synthesize a variety of biological products with commercial potential. The titer of 3-HP by wild-type bacteria is low, which severely limits the large-scale application and production of 3-HP. By modifying the genes related to the metabolic pathway, engineered bacteria using cheap substrates as carbon sources are constructed, the aim of reducing production cost and increasing output is realized. In this paper, the recent progress in the synthesis of 3-HP by metabolic engineering at home and abroad is reviewed. The advantages and disadvantages of glycerol pathway, malonyl-CoA pathway and beta-alanine pathway for synthesis of 3-HP are also summarized and analyzed, and the future development of 3-HP is prospected.
Keywords: 3-hydroxypropionic acidmetabolic engineeringglycerol pathwaymalonyl-CoA pathwayβ-alanine pathway
随着石化资源的逐步枯竭和气候的不断恶化，人们急需从石化经济向生物经济转变。3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是一种可再生生物质，在2004年更新的12种重要平台化学品中排名第三，美国能源部将3-HP列为21世纪最具潜力的化工产品之一^[1]。
3-羟基丙酸，又称β-羟基丙酸，是一种三碳非手性的有机物分子，分子式为C₃H₆O₃，分子量为90.08。在化学结构上，与乳酸互为结构异构体，两端含有一个羟基和一个羧基。3-HP的应用具有多样化，可用作生产粘合剂、塑料包装、纤维、清洁剂和树脂等，也可聚合成聚3-羟基丙酸酯(P3HP)或含3-HP的共聚物^[2]。3-HP是多种关键化合物的合成前体，如丙二酸、1, 3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酸甲酯以及具有致癌作用的丙烯酰胺等。
3-HP的合成方法主要分为化学合成法和生物合成法。其中化学合成法生产3-HP具有成本高、起始材料昂贵以及与环境不相容等特点。生物合成法中的天然合成途径又面临着遗传背景不清晰、产量低、稳定性差、工业生产实施困难等问题，因此利用代谢工程技术合成3-HP已成为当今各国的研究热点。文中对生物合成3-羟基丙酸的代谢工程研究进行概述，并对甘油途径、丙二酸单酰辅酶A途径以及β-丙氨酸途径进行详细介绍以及优缺点分析，最后对未来3-羟基丙酸的研究方向进行展望。
1 甘油途径因甘油价格低廉、来源广泛，以甘油途径合成3-HP已成为各国****的研究热点，如表 1所示。其主要分为两种途径：辅酶A依赖途径和辅酶A非依赖途径^[3]。在辅酶A依赖途径中，甘油通过辅酶B12依赖性的甘油脱水酶(PduCDE)转化为3-羟基丙醛(3-HPA)，又经丙醛脱氢酶(PduP)、磷酸转移酶(PduL)和丙酸激酶(PduW)的催化作用生成3-HP。辅酶A非依赖途径中，甘油通过辅酶B12非依赖性的甘油脱水酶催化生成3-HPA，再利用醛脱氢酶将3-HPA氧化成3-HP。目前，国内外对甘油途径的大部分研究都是辅酶A非依赖途径。
表 1 利用甘油途径合成3-HP情况Table 1 Synthesis of 3-HP by glycerol pathway

Engineering strategy	Strain	Reactor	Titer (g/L)	References
Expressing of dhaB, ald4 gene	E. coli	Shake flask	0.17	[4]
Expressing of dhaB, aldH gene	E. coli	Shake flask	0.58	[5]
Expressing of dhaB, aldH gene and medium optimization	E. coli	Fed-batch	31.00	[6]
Introducing the activation factor gdrAB, expressing dhaB and KGSADH gene	E. coli	Fed-batch	38.70	[7]
Screening for different acid-tolerant recombinant strains	E. coli	Fed-batch	41.50	[8]
Introducing a new synthetic selection device and screening for highly reactive aldehyde dehydrogenase	E. coli	96-well plates	5.08	[9]
Expressing of 5 untranslated regions to optimize expression levels	E. coli	Fed-batch	40.51	[10]
Fine-tuning expression between genes using a synthetic regulatory cassette consisting of RBS	E. coli	Fed-batch	56.40	[11]
Deleting the glycerol inhibitors glpR and ackA-pta and the yqhD gene	E. coli	Bioreactor	42.10	[12]
Expressing of the dhaB-dhaR and PSALDH genes deleting glpK and yqhD genes	E. coli	Bioreactor	57.30	[13]
Screening for the gabD4 gene, using site-directed mutagenesis to increase activity, knocking out ackA-pta, yqhD genes	E. coli	Fed-batch	71.90	[14]
Expressing of the puuC gene, deleting of the dhaT gene	K. pneumoniae	Fed-batch	16.00	[16]
Studying on nitrate as electron acceptor	K. pneumoniae	Fed-batch	22.50	[17]
Using two-stage fed-batch fermentation technology, deleting of the ldhA and gdrAB genes	K. pneumoniae	Fed-batch	61.90	[18]
Expressing of dhaB and gdrAB genes, deleting of byproduct synthesis genes and optimization of culture conditions	K. pneumoniae	Fed-batch	43.00	[19]
Natural promoter drives heterologous expressing of the ald4 gene	K. pneumoniae	Shake flask	4.23	[20]
Using kanamycin-resistant Pkan promoter and expressing of aldH gene	K. pneumoniae	Shake flask	15.28	[21]
Using the IPTG-inducible tac promoter to block the synthesis of by-products	K. pneumoniae	Fed-batch	83.80	[22]
Overexpressing of PuuC gene, using tandem repeat tac promoter andsupplement yeast extract	K. pneumoniae	Bioreactor	102.61	[23]
Introducing of ALDH pathway to express dhaB, gdrAB and puuC genes	P. denitri?cans	Shake flask	4.92	[24]
Heterologous expressing of the ALDH pathway and deleting of the glpK gene	B. subtilis	Shake flask	10.00	[25]

表选项


在两种途径中，醛脱氢酶需要NAD⁺作为辅因子，维持NAD⁺辅因子再生可通过以下两种方法解决。首先，提供氧气的供应，增加通气量后虽然可以维持NAD⁺在电子传递链中再生，但氧的存在既抑制辅酶B12的合成又对脱水酶造成失活。其次，可在3-HPA转化为1, 3-丙二醇(1, 3-PDO)的过程中添加NADH，利用1, 3-丙二醇氧化还原酶消耗NADH生成NAD⁺。
1.1 大肠杆菌作为宿主菌株大肠杆菌E. coli作为一种模式生物，具有遗传背景清晰、易于改造、对生长环境要求低等优点，此外，在合成途径中，因其自身含有醛脱氢酶基因，可在表达甘油脱水酶dhaB基因的基础上，将合成的3-HPA氧化为3-HP。目前，以E. coli为宿主的合成途径还存在一些问题。首先，E. coli没有甘油脱水酶基因，需要从其他宿主菌中筛选并导入宿主细胞，宿主对酶的耐受性需要进一步研究。其次，在甘油途径中需要辅酶B12的供应，提高了生产成本，不利于工业生产。除此之外，甘油脱水酶与醛脱氢酶之间的平衡问题同样需要被考虑。针对以上问题，各国****开始筛选多种宿主菌的脱水酶以及高效的醛脱氢酶，并在调整酶之间的平衡和抑制副产物合成等方面进行研究。
以重组E. coli为宿主，利用甘油途径合成3-HP最早被提出是在2001年，Suthers等^[4]以甘油为底物，通过筛选来自不同宿主的醛脱氢酶后发现来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的醛脱氢酶活性最强、效果最佳，并利用基因工程技术将来自肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶dhaB基因以及来自S. cerevisiae的醛脱氢酶ald4基因在重组E. coli中过表达，生成0.17 g/L的3-HP，虽然产量不高，但从此拉开了利用甘油合成3-HP的序幕。
由于甘油脱水酶的性质不稳定，醛脱氢酶活性较低，导致两种酶在宿主菌中不能平衡表达，使中间代谢产物3-羟基丙醛(3-HPA)不断积累产生毒性，为解决此类问题，各国****对此进行了研究。韩国Park团队在重组E. coli中，过表达来自K. pneumonia的dhaB基因和来自E. coli的aldH基因，摇瓶培养后获得0.58 g/L的3-HP，产率为0.02 g/(L·h)^[5]，之后将分批补料培养基进行优化，改变物化参数使产率提高到0.43 g/(L·h)^[6]。为提高醛脱氢酶的活性和甘油脱水酶的稳定性，Rathnasingh等^[7]在E. coli中导入激活因子gdrAB以及过表达来自巴西固氮菌Azospirillum brasilens中活性较高的醛脱氢酶KGSADH，产量达到38.7 g/L，产率高达1.32 g/(L·h)。之后又在9株不同耐酸的重组E. coli中同时过表达3种基因，最终在E. coli W3100和E. coli W两种宿主菌中分别产生15.3 g/L和41.5 g/L的3-HP，解决了宿主对酸耐受程度的问题^[8]。若想使产量达到新的突破，仅利用传统技术对目的基因筛选及表达是不够的，因此Seok等^[9]运用合成生物学技术，引入一种新型合成选择装置，该装置无需昂贵的仪器或密集型的劳动程序就可以筛选出定向进化的醛脱氢酶KGSADH，将酶的催化效率提高2.79倍，最终获得优化的3-HP生产菌株。该装置可作为高通量筛选工具用于设计3-HP的合成途径，为后续研究提供一个新的思路，使代谢工程技术不只停留在基因筛选和表达等方面。
筛选高活性的醛脱氢酶可解决活性较低的问题，但一味提高醛脱氢酶活性会起到相反作用，因此只有维持酶之间的平衡表达才能使产量最大化。Lim等^[10]发现可在重组宿主菌体内表达5个非翻译区来优化表达水平，进而使翻译速率形成差异，在此基础上，通过微调dhaB1基因的表达，使酶之间活性达到平衡状态，测试后发现4种不同的重组菌株经摇瓶培养后可使3-HP产量提高2.4倍，达到40.51 g/L。在此之后，Park团队^[11]通过使用核糖体结合位点(RBS)组成的合成调节盒来微调两个基因之间的表达，使醛脱氢酶的表达活性提高8倍，在分批补料培养中产生高达56.4 g/L的3-HP，产率达到1.18 g/(L·h)，以此证明调控酶活的平衡在3-HP生产中的重要性。
在3-HP的合成过程中会伴随着一些副产物的生成，副产物不仅能利用培养基中的营养成分促进自身生长代谢，工业生产时还涉及到产物分离困难等问题。理论上在表达高活性的醛脱氢酶以及调节酶之间平衡的基础上，敲除副产物合成途径中的关键基因可使产量得到改善。Jung等^[12]敲除甘油抑制因子glpR和促进乙酸合成的ackA-pta基因以及催化3-HPA生成1, 3-PDO的yqhD基因，发酵培养后获得42.1 g/L的3-HP，产率达到1.32 g/(L·h)。在此之后，研究人员将高活性的醛脱氢酶与敲除副产物合成基因的方法有效结合，在重组E. coli BL21(star)中过表达来自短乳杆菌Lactobacillus breris的dhaB-dhaR基因以及来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的半醛脱氢酶PSALDH，并破坏途径中的glpK、yqhD基因，培养36 h后产生57.3 g/L 3-HP，使产率提高至1.59 g/(L·h)^[13]。为使醛脱氢酶的活性最大化，Chu等^[14]从17种醛脱氢酶筛选出来自贪铜菌Cupriavidus necator的醛脱氢酶gabD4基因，并基于同源建模进行定点、饱和诱变，获得的突变菌株的活性提高1.4倍，同时又对乙酸、乙醇等副产物的合成基因ackA-pta、yqhD进行敲除，最终在分批补料生物反应器中获得71.9 g/L的3-HP，产率高达1.8 g/(L·h)，是迄今为止以E. coli为宿主利用甘油途径合成3-HP的最高产量。但该实验仍有可提升的空间，后续研究可在此基础上继续调整酶之间的表达以及筛选更合适的宿主菌使产量进一步提高。
以E. coli为宿主生产3-HP，具有遗传背景清晰、对生长环境要求低以及可利用廉价的碳源甘油为底物等优点，但在途径中表达来自外源的甘油脱水酶基因、补充昂贵的辅酶B12以及维持NAD⁺再生仍然是急需攻克的问题。最近对巨大芽孢杆菌以及脱氮菌的研究显示可通过去除基于核糖开关的反馈抑制系统来增加辅酶B12合成，可将此引入甘油合成途径解决辅酶B12添加的问题^[15]。
1.2 肺炎克雷伯氏菌作为宿主菌株与E. coli相比，肺炎克雷伯氏菌K. pneumoniae自身具有dhaB基因，并能够在微氧或厌氧的条件下合成辅酶B12，在很大程度上解决辅酶B12添加的问题，降低了生产成本，无疑成为替代E. coli最好的选择。但是该菌株可在医院环境中迅速传播而引起人类感染，引起公众健康问题，并且其遗传背景也并不清晰。在K. pneumoniae中，甘油途径分为还原途径和氧化途径。甘油被甘油脱水酶还原生成3-HPA后，部分3-HPA继续被还原为1, 3-PDO，而另一部分3-HPA则被醛脱氢酶氧化为3-HP。利用K. pneumoniae生产3-HP的研究方向主要在关键酶的筛选、副产物合成基因的敲除以及高效启动子的筛选和优化等几个方面。
敲除副产物合成基因并筛选高活性的醛脱氢酶能有效减少副产物生成，提高目标产物的产量。研究首先集中在抑制关键副产物1, 3-PDO的合成上，Ashok等^[16]通过表达醛脱氢酶puuC基因，并从染色体中删除编码1, 3-PDO氧化还原酶的dhaT基因，产生3.60 g/L的3-HP，又通过微氧分批补料培养获得16.00 g/L的3-HP。之后在硝酸盐作为电子受体的潜在用途的研究中发现该菌株在厌氧条件下可产生22.50 g/L的3-HP^[17]，产率提高至0.45 g/(L·h)。但在菌株生长后期，乳酸的生成抑制了3-HP的生长，使产量无法继续提高，应通过其他技术手段进行优化、改善和解决乳酸生成的问题。于是为抑制乳酸的形成，Jiang等^[18]使用两阶段分批补料发酵技术，同时敲除乳酸和1, 3-PDO的合成基因ldhA、dhaT，构建了3种代谢工程化菌株过表达来自E. coli的醛脱氢酶，通过控制通气速率，该菌株在38 h内产生61.90 g/L的3-HP，产率提升至0.58 g/(L·h)。两阶段分批补料发酵的使用，是3-HP培养技术新的突破。为实现3-HP产量最大化，Ko等敲除多种副产物合成基因抑制乳酸、琥珀酸、1, 3-PDO的生成，并将dhaB和gdrAB基因过表达以及在糖酵解途径减少甘油同化、增加甘油流向共生产和改变通气速率等方法，最终合成43.00 g/L的3-HP^[19]。该方法对副产物合成途径进行更深程度的研究，抑制副产物生成和培养条件优化，但产量并未实现新的突破，后续可选取更高活性的醛脱氢酶进行研究。
启动子控制目的基因表达，筛选不同强度的启动子，可提高关键酶的活性进而提高产量。使用K. pneumoniae中天然启动子驱动醛脱氢酶ald4基因的异源表达，获得的3-HP产量低且表达量无法得到控制^[20]。于是马春路等^[21]选用含有卡那霉素抗性基因的Pkan启动子在菌中过表达aldH基因，培养后获得15.28 g/L的3-HP。Li等^[22]发现IPTG诱导型tac启动子能过表达puuC基因，又通过阻断副产物合成途径并优化发酵条件，分批补料培养获得83.80 g/L的3-HP，产率高达1.16 g/(L·h)。在最新的研究中，Zhao等^[23]利用K. pneumoniae DSM 2026为宿主菌株，使用3个串联重复tac启动子过表达puuC基因，并在培养过程中维持中性的pH值和补充酵母提取物，使3-HP产量高达102.61 g/L，是迄今为止通过甘油途径合成3-HP的最高产量，实验选用乳酸对丙酮酸回流的方式导致发酵后期乳酸完全消失，解决后续3-HP和乳酸难以分离的问题。以K. pneumoniae为宿主可有效解决E. coli面临的辅酶B12的添加、外源甘油脱水酶基因表达等问题。研究过程中对高效醛脱氢酶的筛选、副产物合成基因的敲除以及高强度启动子的选择对最终产量有着重要的影响，后续研究中可结合合成生物学中生物传感器调控机制和调控因子进行研究。
1.3 其他宿主菌脱氮假单胞菌Paracoccus denitrificans在有氧条件下能够合成辅酶B12，保证NAD⁺有效再生，被认为是利用甘油生产3-HP最理想的菌株，Zhou等^[24]在P. denitrificans中引入来自K. pneumoniae的ALDH途径，过表达dhaB、gdrAB、puuC基因后，摇瓶发酵可积累4.92 g/L的3-HP。但以P. denitrificans为宿主面临的问题是在生成3-HP的同时，3-HP被氧化成丙二酸并将3-HP作为生长的碳源，后续研究可通过敲除转化丙二酸的相关基因方面入手。Kalantari等^[25]以枯草芽孢杆菌B. subtilis生产3-HP，该菌株可在高温下生长，节省发酵过程中的冷却步骤，节约生产成本，通过异源表达K. pneumoniae的ALDH途径，敲除甘油激酶编码基因glpK，阻断甘油向3-磷酸甘油的代谢通路，构建的重组菌株最终合成10.00 g/L的3-HP。
其他宿主菌利用甘油途径合成3-HP虽能解决辅酶再生、发酵过程中低温冷却的问题，但仍面临着遗传背景不清晰、合成产量低等问题，研究人员需要对相关代谢途径进一步研究来解决此类问题。
目前对甘油途径的研究主要以E. coli和K. pneumoniae为主。E. coli具有遗传背景清晰、对生长环境要求低以及利用廉价的碳源为底物等优点，但在途径中表达外源甘油脱水酶基因、补充昂贵的辅酶B12以及维持NAD⁺再生仍然是急需攻克的问题，未来的研究可在E. coli中通过去除基于核糖开关的反馈抑制系统来增加辅酶B12合成。以K. pneumoniae为宿主可有效解决辅酶B12的添加、外源甘油脱水酶基因表达等问题，研究过程中对高效醛脱氢酶的筛选、副产物合成基因的敲除以及高强度启动子的选择对最终产量有着重要的影响，后续研究中可结合合成生物学中生物传感器调控机制和调控因子进行研究。其他宿主菌利用甘油途径合成3-HP的研究应主要解决遗传背景不清晰，合成产量低等问题。
2 丙二酸单酰辅酶A途径丙二酸单酰辅酶A途径主要是利用乙酰辅酶A羧化酶(ACC)将来自于葡萄糖的中间产物乙酰辅酶A还原成丙二酸单酰辅酶A，又通过丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCR)生成3-HP，其中丙二酸半醛(MSA)是丙二酸单酰辅酶A合成3-HP的中间体。该途径中葡萄糖转化成乙酰-CoA产生2 mol NADH、1 mol ATP和1 mol CO₂，乙酰-CoA利用1 mol CO₂和1 mol ATP羧化成丙二酰辅酶A，随后利用2 mol NADPH将丙二酰辅酶A还原成3-HP。该途径能够在能量上很好地平衡，具有较高的转化效率。目前对丙二酰辅酶A途径的研究主要通过改善关键酶的催化作用、平衡酶之间的活性、增加辅因子和能量供应以及解决细胞毒性等几个方面，如表 2所示。
表 2 利用丙二酸单酰辅酶A途径合成3-HP情况Table 2 Synthesis of 3-HP using the malonyl-CoA pathway

Engineering strategy	Strain	Carbon source	Reactor	Titer (g/L)	References
Expressing of acc, pntAB, mcr genes	E. coli	Glucose	Shake flask	0.19	[26]
Dissecting MCR into two fragments and improved enzyme activity	E. coli	Glucose	Shake flask	0.15	[27]
Tuning activity level to achieve functional balance between enzymes	E. coli	Glucose	Fed-batch	40.60	[28]
Expressing heterologous acc gene and optimize media	E. coli	Glucose	Fed-batch	10.08	[29]
Using acetate as a substrate and deleting byproduct synthesis genes	E. coli	Acetate	Shake flask	3.00	[30]
Increasing reducing equivalent	S. cerevisiae	Glucose	Shake flask	0.46	[31]
Expressing pdc1, ald6, acsL641P genes and enhancing the supply of cofactors	S. cerevisiae	Glucose	Fed-batch	9.80	[32]
Using site-directed mutagenesis to increaseing acc gene activity	S. cerevisiae	Glucose	Bioreactor	0.28	[33]
Development of a novel sensor that introducing the promoter TEF1 and expressing the fas1 gene	S. cerevisiae	Glucose	Bioreactor	0.80	[34]
Expressing two independent enzymes	S. elongatus	CO2	Shake flask	0.67	[35]
Expressing heterologous biotin protein ligase without carbonic anhydrase	P. furiosus	Maltose	Bioreactor	0.37	[36]
Optimizing mcr gene expression	Synechocystis	CO2	Shake flask	0.84	[37]
Increasing promoter strength and mcr gene copy number	M. extorquens	Glucose	Shake flask	0.07	[38]
Using high expression of the hsp9 promoter and optimizing medium	S. pombe	Glucose	Shake flask	7.60	[39]

表选项


2.1 大肠杆菌作为宿主菌株在丙二酸单酰辅酶A途径中，大肠杆菌E. coli自身含有能够将乙酰辅酶A转化为丙二酸单酰辅酶A的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，在培养过程中，可诱导acc基因过表达，避免外源基因的添加而造成代谢负担。
韩国Park团队^[26]将acc、pntAB基因以及来自橙色绿屈挠菌Chloroflexus aurantiacus的mcr基因在E. coli体内共表达，在24 h内累积0.19 g/L的3-HP，理论上抑制副产物的合成会提高目标产物，但对合成副产物的相关基因pta-ackA、ldhA、sucAB敲除后，产量并未得到改善。此研究首次证明从葡萄糖生产3-HP代谢通路的可行性，但因MCR酶的活性较低限制了3-HP的高产，后续可通过增加前体物质和NADPH的供应以及对mcr基因进行改造使酶活提高进而提高3-HP产量。
为改善关键酶的催化作用，赵广团队^[27]对途径中的mcr基因进行改造，通过将mcr基因分成两个功能结构域MCR的N末端和MCR的C末端区域，发现当MCR的两个功能区域拆分后，酶活有较大提升，又通过定点诱变技术进行改造，E. coli在48 h后累积0.15 g/L的3-HP。后续发现MCR-C端表达量及酶活均低于MCR-N端，推测两个结构域的活性不平衡是导致MCR整体酶活低的主要原因，通过饱和诱变和定点突变来提高MCR-C的酶活，采用染色体整合技术控制MCR-N端酶活，最后结合发酵条件的优化及补料分批培养3-HP产量可达40.60 g/L，产率高达0.56 g/(L·h)，是已知利用丙二酸单酰辅酶A途径合成3-HP的最高产量^[28]。赵广团队对关键酶MCR的研究使丙二酸单酰辅酶辅酶A途径合成3-HP的产量达到一个新的高度，在此基础上可参考Park团队，对合成副产物基因进行敲除以及提高辅因子供应进而提高产量。
笔者所在团队在mcr基因功能区域分离的基础上，引入美国华盛顿大学Liu Di设计的FapR生物传感器，构建根据细胞内丙二酸单酰辅酶A浓度来调节acc基因表达的负反馈系统，有效解决acc基因过度表达所产生的毒性问题，将含有目的基因的质粒在重组E. coli BL21(DE3)中进行表达，获得相应产量的3-HP。此项技术已申请2项发明专利。
除了对关键酶进行改造，通过筛选不同的宿主-载体系统，也可使产量进一步提高。Cheng等^[29]在E. coli中表达来自兼性厌氧菌谷氨酸棒状菌Corynebacterium glutamicum的acc基因和来自C. aurantiacus的mcr基因，通过选择不同的宿主-载体系统，最终确定宿主E. coli BL21(DE3)和pET28a的组合生产3-HP最有效，在后续发酵过程中补充NaHCO₃和生物素，分批补料培养36 h后，获得10.08 g/L的3-HP，产率为0.4 g/(L·h)。
在上述研究中，实验均以葡萄糖作为底物，Lee等^[30]打破常规，选取醋酸盐为底物并敲除副产物合成基因。过表达mcr基因和编码乙酰-CoA合成酶的acs基因，同时删除编码乙醛酸分流途径阻遏物的iclR基因，并添加浅蓝菌素来减少碳流向脂肪酸合成，最后在8.98 g/L的醋酸盐中获得3.00 g/L的3-HP，之后的研究应针对mcr密码子优化提高关键酶活性以及解决辅因子循环等问题。
2.2 酿酒酵母菌作为宿主菌株与E. coli相比，酿酒酵母S. cerevisiae同样是重要的安全模式菌株，体内含有将乙酰辅酶A还原成丙二酸单酰辅酶A的acc基因，过表达后利用丙二酸单酰辅酶A途径与mcr基因合成3-HP。不同的是其可以在酸性条件下生产，增强了宿主菌对产物的耐受性，培养后的产物大部分为游离的3-HP，在工业生产中可节省下游分离提取的费用。
在合成途径中，除了对目的基因表达和副产物合成基因敲除以外，辅因子和能量供应也必不可少。Chen等^[31]以S. cerevisiae为宿主菌株，在过表达acc、mcr基因基础上，同时过表达adh2、ald6以及acsSE基因，并敲除合成副产物编码胞质苹果酸合酶的mls1基因，最后加入甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPNsm，使3-HP的产量提高到原来的3倍，达到0.46 g/L，但产率仅为0.006 g/(L·h)。Kildegaard等^[32]为改善乙酰辅酶A的供应，将pdc1、ald6、acsL641P基因一起过表达，再通过转移NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapdh基因，提高mcr作用所需的NADPH，增强辅因子的供应，使重组S. cerevisiae合成9.80 g/L的3-HP，产率提升至0.1 g/(L·h)。副产物合成基因的敲除以及辅因子和能量的供应可有效提高3-HP的产量，但产量低下无法达到工业生产要求，可通过对关键酶的筛选以及宿主-载体系统的选择等方面进行改善，以及引入合成生物学技术对此进行研究。
为解决关键酶活性的问题，Shi等^[33]以S. cerevisiae为研究对象，对acc1基因的Ser659和Ser1157两个位置进行定点突变，使acc1基因活性得到增强，从而促进3-HP的合成，使3-HP产量为0.28 g/L。David^[34]以Liu Di设计的FapR生物传感器为基础，在S. cerevisiae中开发一种新型传感器，引入酵母启动子TEF1控制mcr基因表达以及过表达PHXT1启动子控制下的抑制剂fas1基因，两个基因在FapR控制的代谢途径下，25 h产生约0.80 g/L的3-HP，产量虽然不高，但在方法和技术上已得到创新并开展了新的研究思路，之后的研究可以此为基础，从其他菌中筛选出高活性的关键酶以及增强辅因子的供应来提高产量。
酿酒酵母S. cerevisiae作为真核模式生物，可生长在酸性条件下，解决菌株不耐酸的问题。但产量低仍是该途径的关键问题，后续应筛选具有更高活性的乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A，并对酶之间的平衡问题进行研究。
2.3 其他宿主菌近些年，也报道过一些其他宿主菌利用丙二酸单酰辅酶A途径合成3-HP。Lan等^[35]以伊隆-盖塔斯乳腺球菌Synechococcus elongatus PCC 7942为宿主菌，通过将msrMs、mcrSt基因整合到染色体上，最后合成0.67 g/L的3-HP，证明使用蓝细菌将CO₂光合转化为3-HP的可行性，利用CO₂代替了廉价碳源使用，解决成本高等问题。Lian等^[36]以激烈火球菌Pyrococcus furiosus为宿主菌，过表达acc、mcr、mrs基因生成3-HP，在此基础上将来自勤奋生金球菌Metallosphaera sedula的碳酸酐酶CA和生物素蛋白连接酶BPL分别添加至该途径，3-HP产量达0.12 g/L和0.37 g/L。实验表明辅助蛋白质在代谢工程中对异源表达极为重要。
启动子对目标基因的控制同样受到研究者的关注。Wang等^[37]以集胞藻Synechocystis sp.为宿主，通过表达acc基因和生物素酶增强前体丙二酰辅酶A的供应，更换启动子和培养条件增加mcr基因的表达，并且过表达NAD(P)转氢酶基因来改善NADPH供应，6 d后产生0.84 g/L的3-HP。Yang等^[38]使用工程化扭脱甲基杆菌Methylobacterium extorquens AM1，通过增加启动子强度和mcr拷贝数未提高产量。Suyama等^[39]以重组裂殖酵母S. pombe为宿主，在高度表达的hsp9启动子作用下，编码Cut6p和CaMCR基因，在补充乙酸盐的培养基中培养31 h，3-HP产量达7.60 g/L。通过对启动子修饰与更换，使3-HP的产量得以改善。
利用其他宿主菌合成3-HP的遗传背景不清晰，并面临着产量低、不能工业化生产等问题。之后的研究应主要集中在代谢途径的具体分析以及应用合成生物学技术对相关基因进行控制和表达等方面。
以丙二酸单酰辅酶A途径合成3-HP主要以E. coli和S. cerevisia为主，E. coli的遗传背景清晰，自身含有能够将乙酰辅酶A转化为丙二酸单酰辅酶A的乙酰辅酶A羧化酶ACC，在培养过程中，可诱导acc基因过表达，避免外源基因的添加而造成代谢负担。未来的发展方向可引入转录抑制因子FapR，抑制acc基因过表达产生的毒性。与E. coli相比，S. cerevisiae同样是重要的安全模式菌株，不同的是其可以在酸性条件下生产，增强了宿主菌对产物的耐受性，培养后的产物大部分为游离的3-HP，在工业生产中可节省下游分离提取的费用，但合成产量低仍是急需解决的重要问题，今后应在关键酶平衡的问题上进行研究。
3 β-丙氨酸途径β-丙氨酸是微生物体内广泛存在的代谢产物，可通过多种氨基酸发生转氨作用以及丙酮酸转化而形成，并作为中间体合成3-HP。研究者使用基因组代谢模型发现该途径比丙二酸单酰辅酶A途径具有更高的理论得率，目前已经在E. coli和S. cerevisiae中成功构建β-丙氨酸途径，并获得较高的产量。
Liao等^[40]首次在E. coli中构建β-丙氨酸途径，提出可通过丙氨酸2, 3-氨基变位酶(AAM)的转氨作用将α-丙氨酸转化为β-丙氨酸，再通过β-丙氨酸丙酮酸转氨酶(BAPAT)转化形成丙二酸半醛，最后利用3-羟基丙酸脱氢酶(HPDH)的还原作用形成3-HP。在此基础上，Song等^[41]在E. coli中开发另一种新的β-丙氨酸途径，使用来自富马酸盐的天冬氨酸，此途径比草酰乙酸的途径具有更高的性能，通过表达来自E. coli的ydfG基因和来自P. aeruginosa的pa0132基因，并将基因组中的强启动子tac替代sdhC基因的天然启动子，经摇瓶培养和分批补料培养分别产生3.69 g/L和31.10 g/L的3-HP，使产率达到0.63 g/(L·h)。
Jessen等^[42]发现S. cerevisiae中的γ-氨基丁酸转氨酶(GABT)同样可以将β-丙氨酸转化为丙二酸半醛，成功在S. cerevisiae中构建β-丙氨酸途径。近几年，该课题组又在不同宿主菌中发现多种可将β-丙氨酸转化为丙二酸半醛的氨基转移酶，并已成功申请专利^[43]。Borodina等^[44]利用β-丙氨酸作为前体，将蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus中编码β-丙氨酸丙酮酸转氨酶yhxA基因与来自E. coli的ydfG基因在S. cerevisiae中过表达，再通过表达天然细胞质天冬氨酸氨基转移酶aat2基因和两种丙酮酸羧化酶pyc1、pyc2基因来改善L-天冬氨酸的供应，最后在分批补料培养中获得13.70 g/L的3-HP，产率为0.17 g/(L·h)。Kildegaard等^[45]在S. cerevisiae中比较丙二酸单酰辅酶A途径与β-丙氨酸途径利用木糖生产3-HP的能力，结果表明，在分批补料培养中β-丙氨酸途径可获得6.09 g/L的3-HP，而丙二酸单酰辅酶A途径仅获得2.30 g/L。
E. coli和S. cerevisiae的遗传背景清晰，是典型的模式菌株，该途径可将不同种类的氨基酸转化为β-丙氨酸，在通过不同活性的转氨酶将其转化为丙二酸半醛，进而还原成3-HP。β-丙氨酸途径可获得高产的3-HP，但其合成途径十分复杂，在生长过程中容易造成代谢负担，此外，β-丙氨酸途径通常使用常见的代谢中间体为底物，在发酵过程中会伴随着多种副产物的合成，使产品分离十分困难。未来应对β-丙氨酸途径作进一步的研究找出其他更简单的代谢通路，并筛选高活性的转氨酶以及掌握更有效的产品分离技术。
4 其他途径Luo等^[46]利用丙酰辅酶A途径，在重组E. coli中将来自皱褶假丝酵母Candida rugosa的丙酰基- CoA脱氢酶PACD和来自埃氏巨型球菌Megasphaera elsdenii的pct、hpcd基因共表达，使产量达到0.72 g/L。后又敲除途径中琥珀酸CoA转移酶ygfH基因和柠檬酸甲酯合成酶prpC基因，使菌株在摇瓶实验中产生2.17 g/L的3-HP，因途径中需补充额外的丙酸盐，导致生产成本提高，不利于工业化生产。
Holo等首次提出3-HP固碳循环途径，研究发现3-HP是C. aurantiacus固碳途径的中间代谢产物。通过研究，单循环固碳途径被逐步完善，但却发现在途径中无法确认固定产物乙醛酸代谢机制的问题，因此Fuchs等提出3-HP是一种双循环偶联途径，并通过实验阐述了乙醛酸代谢机制中未解决的问题以及对特征酶进行纯化、鉴定，最后确立3-HP双循环偶联途径^[47]。该途径利用CO₂为底物，可减少生产成本，在循环过程中吸收和同化大气环境中有机酸等物质，解决环境污染的问题，在未来可开展绿色工业生产。
Yu等^[48]发现一种具有高度底物耐受性的丙腈水解酶，其可将3-羟基丙腈(3-HPN)转化为3-HP。将含有该腈水解酶基因的重组大肠杆菌，使用海藻酸钙包埋和化学交联固定化的方法将静息细胞固定在藻酸钙上，通过不断地重复利用以及分离、纯化，最终从30批中获得184.7 g/L 3-HP，转化率高达36.9 g/(L·h)。通过细胞的固定方法增强了它们对底物的耐受性、稳定性、重复利用性进而提高产量，但3-HPN本身也是一种重要化学品，其作为底物添加提高了生产成本，不利于工业化生产。
在最新的研究中，Liu等^[49]以脂肪酸FAs为原料，在分析多种途径的限制因素后，在E. coli中成功构建脂肪酸代谢途径，并通过组合代谢工程和发酵条件的优化，发酵培养后产生52.00 g/L的3-HP，产率为1.56 g/(L·h)。利用脂肪酸为原料生产3-HP，虽然能获得大量产物，但脂肪酸本身也作为一种重要的有机物可用于化妆品、涂料、脂肪酸盐的生产，用其作原料会增加生产成本，不利于工业化生产，后续研究应集中在利用廉价物质作为碳源来生产3-HP。
5 途径优缺点甘油作为生产生物柴油的副产品，价格低廉、来源广泛，代谢通路中涉及的两种关键酶来源广、背景清晰。但该途径仍面临着一些问题，如菌株对产物的耐受性较低、3-HPA积累产生的毒性、E. coli中辅酶B12供应以及K. pneumoniae的安全性等。后续研究可筛选适应低pH条件的微生物进行发酵，找出活性更高的醛脱氢酶或降低甘油脱水酶活性来调节酶之间的平衡以及使用来自酪酸梭菌的不依赖B12的甘油脱水酶来解决辅酶B12供应的问题。
在利用丙二酸单酰辅酶A途径合成3-HP的生产过程中可使用廉价的碳源葡萄糖、木糖等原料作为底物，并在培养工程菌的过程中不需要辅酶B12的供应，从而降低了生产成本，且该途径代谢通路简单，便于操作。然而该途径还存在合成产量低、较低的菌株耐受性以及acc基因过度积累产生毒性等问题。为解决上述问题，应对途径中的关键基因进行筛选或根据途径中涉及的蛋白质晶体结构，设计出具有所需特性的酶来提高活性，通过筛选3-HP的耐受基因或菌株来解决产物耐受性的问题。笔者所在团队为控制途径中acc基因和mcr基因之间平衡表达，引入含有FapR调控因子的生物传感器，可有效解决acc基因过度积累产生的毒性问题。
β-丙氨酸途径作为微生物体内广存的代谢产物，前体来源广泛，并已证明合成3-HP的产量可高于丙二酸单酰辅酶A途径。但其合成途径复杂，在培养过程中容易造成代谢负担，未来的研究可找出其他更简单的代谢通路，筛选高活性的转氨酶以及掌握更有效的产品分离技术来提高3-HP的产量。
在对其他途径的研究中发现，E. coli可利用丙腈水解酶，通过固定化细胞获得高产量的3-HP，但其代谢途径背景不清晰，添加前体物质三羟基丙腈又提高了生产成本。其他途径中也同样需要添加昂贵的前体物质，不利于工业化生产，应对代谢调控机制进一步分析、调整，并添加廉价的前体物质作为碳源合成3-HP。
6 总结与展望近些年来，3-HP作为重要的平台化合物，受到各国****的广为关注，生物合成3-HP所需的原料来源广，生产成本低，对环境的影响较小。但野生菌合成3-HP的产量低、稳定性差，工业生产实施困难，因此需要利用代谢工程技术对代谢途径进行研究，近几年研究主要通过更换不同的宿主、底物、代谢途径以及敲除副产物合成基因，平衡酶之间的活性，增加前体和辅助因子的供应等方法来提高3-HP的产量，并在研究中引入合成生物学技术，开发了可动态调节转录因子的生物传感器。但迄今为止仍存在以下问题：1)辅酶B12的供应提高生产成本；2)产物积累产生的毒性问题；3)菌株对产物的耐受性较低，产量无法提高。
未来3-HP的合成方向需要以节约、环保为理念，利用廉价或可再生的物质为碳源。针对上述问题，提出未来的发展方向：1)最近对巨大芽孢杆菌以及脱氮菌的研究显示，可去除途径中的反馈抑制系统来增加辅酶B12合成，可将此方法引入途径中解决辅酶B12的供应问题。2)筛选高活性的关键酶并对酶之间的平衡进行调整，可有效减少产物积累产生的毒性。3)筛选出具有高底物耐受性的宿主菌。4)在途径中结合合成生物学中生物传感器调控因子以及CRISPR-Cas系统，3-HP产量有望得到进一步加强。下游工艺涉及的原位产品分离回收、副产物的处理以及产品纯度等问题仍需新的技术手段来解决。各国****致力于此项技术的研究，相信3-HP工业化生产的前景将会日益精进。
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