1. 鲁东大学 生命科学学院，山东 烟台 264025;
2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308
收稿日期：2019-12-12；接收日期：2020-02-24；网络出版时间：2020-03-11
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 31922047, 31901015)资助
摘要：在当今不可再生资源日益消耗的情形下，利用生物合成的技术，将甲醛转变成糖类，具有重要意义。该过程最重要的是找到一个合适的催化剂组合来实现甲醛的二聚反应。在最近的研究中，报道发现了一种乙醇醛合酶(Glycolaldehyde synthase，GALS)可以催化这一反应，将其与D-果糖-6磷酸醛缩酶(D-fructose-6-phosphate aldolase，FSA)组合使用，即“一锅酶”法，可以利用甲醛合成L-木糖，并且转化率可达64%。这一过程的实现也为合成其他糖的反应提供了参考。
关键词：甲醛乙醇醛L-木糖生物合成甲醛聚糖反应
Biocatalysis of formaldehyde to L-xylose
Zhailin Chu1,2, Xiaoyun Lu2, Yuwan Liu2, Bo Cui2, Meidong Jing1, Huifeng Jiang2
1. College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, Shandong, China;
2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
Received: December 12, 2019; Accepted: February 24, 2020; Published: March 11, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31922047, 31901015)
Corresponding author: Huifeng Jiang. Tel/Fax: +86-22-24828732; E-mail: jiang_hf@tib.cas.cn.
Abstract: It is of great significance to use biosynthesis to transform the inorganic substance formaldehyde into organic sugars. Most important in this process was to find a suitable catalyst combination to achieve the dimerization of formaldehyde. In a recent report, an engineered glycolaldehyde synthase was reported to catalyze this reaction. It could be combined with engineered D-fructose-6-phosphate aldolase, a "one-pot enzyme" method, to synthesize L-xylose using formaldehyde and the conversion rate could reach up to 64%. This process also provides a reference for the synthesis of other sugars. With the increasing consumption of non-renewable resources, it was of great significance to convert formaldehyde into sugar by biosynthesis.
Keywords: formaldehydeglycolaldehydeL-xylosebiosynthesisformaldehyde reaction
利用甲醇、甲醛等简单的一碳物质合成复杂的糖类已经有150多年的历史，该过程不仅与生命起源前地球上最初的碳水化合物的形成有关[1]，还是一种比较理想的生物单糖合成方法[2]。甲醛聚糖(Formose)反应通常由水溶液中的无机碱(氢氧化钙等)充当催化剂，随后激活其他复杂的反应，如羟醛反应、反醇醛缩合反应、坎尼扎罗反应、交叉坎尼扎罗反应等。由于甲醛聚糖反应过程极其复杂，会产生数十个直链和支链单糖[3]以及多元醇[4]和聚羟基碳酸[5]，产物分离提纯难度大，限制了其商业化要求的经济价值，基于此，本研究设计并优化了一条利用生物催化将甲醛转变成L-木糖的途径。
据报道，乙醇醛是甲醛聚糖反应中非常重要的中间产物，它通常来源于羟醛缩合和逆羟醛缩合的催化反应[6]。在自然界中，甲醛被紫外线辐射催化后也可生成乙醇醛[7-11]，但是在紫外线的作用下，糖类会被破坏，最终在光化学反应中获取单糖的收率并不高。此外，噻唑盐也是一种合适的催化剂，可催化甲醛的低聚反应，生成二羟基丙酮(DHA)[12-17]。David Baker探索了这类酶，并筛选改造苯甲醛裂解酶(Benzaldehyde lyase，BAL)获得比野生型活性提高100倍的突变体甲醛酶(Formolase，FLS)，使其具有合成乙醇醛和二羟基丙酮的功能，但是FLS主要合成产物为二羟基丙酮[18-19]。因此，寻找一种新的生物催化剂来实现这一反应具有重要意义。
最近，本实验室发现并改造获得乙醇醛合酶(GALS)[20]，它可以高效地催化甲醛生成乙醇醛。本研究将寻找一个合适的组合，使一碳物质经该组合催化合成糖类[21-24]。通过结合甲醛聚糖反应与醛缩反应，提出了一种从甲醛合成L-木糖的新途径，即利用GALS与FSA的组合来催化甲醛合成L-木糖。这些酶分别在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中过表达，然后通过“一锅酶”法以甲醛为底物合成L-木糖。结果显示，合成L-木糖的酶促反应有较高的转化率，而且研究结果也给利用甲醛合成其他糖类提供新思路。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验试剂甲醛、乙醇醛、L-甘油醛、L-木糖和异丙基- β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司，酵母粉和胰化蛋白胨购自英国Oxoid公司，乙腈和三氟乙酸购自德国Merck公司，硫酸卡那霉素、氨苄青霉素、甘油、吡啶、咪唑、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等购自北京索莱宝科技有限公司，所有限制性内切酶和DNA连接酶均购自Novagen公司，Ni-NTA亲和色谱柱购自Qiagen。
本研究所使用的所有菌株和质粒均在本实验室保存。大肠杆菌DH5α用于质粒构建，BL21(DE3)用于酶的表达。pET-28a(+)用于表达GALS，pET-22b(+)用于表达FSA。
1.1.2 实验配方蛋白缓冲液A：50 mmol/L K3PO4，5 mmol/L MgSO4，pH 7.4；蛋白缓冲液B：50 mmol/L K3PO4，5 mmol/L MgSO4，1 mol/L咪唑，pH 7.4；蛋白缓冲液C：50 mmol/L三乙醇胺，pH 7.5；蛋白缓冲液D：50 mmol/L三乙醇胺，1 mol/L咪唑，pH 7.5；洗脱液：含不同浓度的咪唑缓冲液；稀有糖衍生试剂(1 mL体系)：21.1 mg苄氧基胺盐酸盐，300 μL甲醇，660 μL吡啶，40 μL ddH2O。LB培养基：酵母粉5 g/L，胰化蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；LB固体平板：酵母粉5 g/L，胰化蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，1.5% (W/V)琼脂；2YT培养基：酵母粉10 g/L，胰化蛋白胨16 g/L，NaCl 5 g/L。
1.2 方法1.2.1 质粒构建与克隆将密码子优化过的GALS克隆到pET28a(+) NdeⅠ和XhoⅠ之间，构建质粒GALS-pET-28a，并将突变体FSA-A129T/A165G克隆到pET-22b(+)的SalⅠ和XhoⅠ之间，构建质粒FSA-A129T/A165G-pET-22b，然后将含有GALS或FSA基因的质粒分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有对应抗生素的LB平板上培养过夜，随后挑取单克隆测序验证，序列正确的质粒保存于?20 ℃备用。硫酸卡那霉素和氨苄青霉素的工作浓度均为100 μg/mL。
1.2.2 GALS和FSA的表达与纯化将GALS-pET-28a、FSA-A129T/A165G-pET-22b质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在含相应抗生素的LB固体平板上过夜。挑取单克隆于5 mL液体LB培养基中，37 ℃、220 r/min过夜培养作为种子液。第二天将种子液接种到800 mL 2YT液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养至OD600约0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，16 ℃、220 r/min诱导表达16 h。随后于5 500 r/min离心收集菌体，用蛋白缓冲液A重悬并离心清洗菌体，于?20℃保存备用。
重悬菌体利用高压细胞破碎仪(JN-3000plus)破碎，120 MPa，2次。12 000 r/min、4℃离心40 min去除细胞碎片。将上层清液取出待用，采用镍离子亲和层析柱方法纯化目的蛋白，上清液过两遍镍柱，然后GALS (FSA)分别用含50 mmol/L咪唑的蛋白缓冲液A (蛋白缓冲液C)清洗杂蛋白，用含200 mmol/L咪唑的蛋白缓冲液A (蛋白缓冲液C)洗目的蛋白，收集洗脱液用15 mL 30 kDa (3 kDa)的超滤管在4 ℃、3 600 r/min条件下离心浓缩，再用蛋白缓冲液A (蛋白缓冲液C)换液2次除去蛋白中的咪唑。
整个蛋白纯化过程，从菌液破碎开始后续操作一直在4 ℃条件下进行。
上述得到的纯化蛋白用Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)试剂盒测蛋白浓度，于?80 ℃保存备用。
1.2.3 酶法催化甲醛合成木糖反应体系(200 μL)：1 mg/mL GALS，2 mg/mL FSA-A129T/A165G，2 g/L甲醛，蛋白缓冲液C补足，37 ℃反应24 h。反应结束后，取10 μL样品进行稀有糖衍生。
稀有糖衍生方法(200 μL体系)：取10 μL的反应产物于2 mL的EP管中，加入50 μL稀有糖衍生试剂，均匀混合，50 ℃条件下反应1 h，再向EP管中加入140 μL甲醇，12 000 r/min离心30 min，取150 μL上清液进行HPLC检测。
1.2.4 目标产物木糖的检测HPLC检测条件：安捷伦的液相检测系统1260 InfinityⅡ，色谱柱为XBridge C18，5 μm，4.6 mm×250 mm Column，紫外检测器，检测波长为215 nm，进样量20 μL，流动相A为0.1% TFA (V/V)；B为0.095% TFA (V/V)-乙腈:水(4:1)，前16 min B相按20%–60%梯度增加，对应的A相80%–40%递减，后14 min A相维持80%，B相维持20%不变，柱温35 ℃，流速1 mL/min，共检测时间为30 min。
2 结果与分析2.1 甲醛合成木糖通路的实现和木糖的检测1861年，Butlerow首次报道了甲醛聚糖反应[25]，之后的相关研究工作也一直在进行，但是在提高产品选择性方面进展缓慢。主要原因是早期的研究工作以甲醛的水溶液为基本原料，无机碱作催化剂，终产物为由直链糖和支链糖组成的复杂混合物(粘稠糖浆)，其产物的品种繁多(通常30种以上)、结构类似(同分异构体为主)，分离提纯难度大。20世纪80年代以来，以T. Matsumoto为代表的科学家们针对早期甲醛聚糖反应存在的问题，进行了一系列技术上的重大改进。甲醛聚糖反应的研究方面取得了令人瞩目的新进展(例如三碳糖的选择性已从早期的10%以下提高到接近90%)，使甲醛聚糖技术具备了制备专一产品的能力，并且在经济上显示了具有竞争能力的光明前景，但目前的研究仅限于低碳糖。
本研究设计了一条甲醛合成L-木糖的新途径，整个路线是由两种酶来催化，即第一种是具有催化甲醛(1)合成乙醇醛(2)功能的酶GALS，而第二种是能同时催化两步反应的酶FSA，它能催化乙醇醛与甲醛生成L-甘油醛(3)，同时又催化乙醇醛与L-甘油醛，生成L-木糖(4) (图 1)。
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| 图 1 甲醛到L-木糖催化途径示意图 Fig. 1 Schematic diagram of catalytic pathway from formaldehyde to L-xylose. GALS: glycolaldehyde synthase; FSA: D-fructose-6-phosphate aldolase. |
| 图选项 |
采用高效液相色谱法检测L-木糖，首先将反应产物进行衍生化处理并用甲醇稀释，处理后的样品离心取上清用HPLC检测，如图 2所示，木糖标品和反应组均在7.7 min左右出峰，而对照组则没有检测到木糖的产生。由此证明，图 1设计的途径可以成功实现并且可以检测到产物L-木糖。
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| 图 2 L-木糖液相检测 Fig. 2 Liquid phase detection of L-xylose. |
| 图选项 |
2.2 甲醛到L-木糖途径的优化对本实验室筛选改造的乙醇醛合酶(GALS)与David Baker教授探索改造的FLS进行比较，结果发现GALS可以专一性地催化甲醛生成乙醇醛，并且随着底物浓度的增加，虽然两种酶的催化效率都在增加，但是GALS的催化效果更为明显，其催化效率约是FLS的13倍(图 3)，因此确定了图 1设计的途经中第一步酶用GALS。
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| 图 3 不同底物浓度情况下两种酶GALS和FLS催化甲醛到羟基乙醛的产量 Fig. 3 Production of hydroxyacetaldehyde from formaldehyde using enzymes GALS and FLS at different substrate concentrations. GALS: glycolaldehyde synthase; FLS: formolase: FALD: formaldehyde. |
| 图选项 |
为了进一步优化如图 1所示的催化途径，设计了3组实验来验证反应的情况。图 4中的设计是分别用野生型酶GALS-WT和筛选的酶GALS-H281VQ282F来催化底物甲醛，对照组中不添加任何酶。如图 3所示，催化甲醛合成乙醇醛的过程得以实现，并且筛选得到的突变型酶的催化效率远远高于野生型，达到了89.9%，而对照组无目标产物乙醇醛生成。而图 5是用酶FSA分别催化乙醇醛、L-甘油醛和乙醇醛加L-甘油醛3组不同底物生成L-木糖的转化效率。由图 5可知，当底物只有乙醇醛或L-甘油醛存在时，FSA无法催化其生成L-木糖，而同时存在乙醇醛和L-甘油醛时，FSA才能催化二者生成L-木糖，且催化效率达到44.2%，由此证明了图 1的途径示意图的L-甘油醛(3)和乙醇醛生成L-木糖(4)的步骤可以实现，并且有较高的催化效率。图 6是在底物甲醛和乙醇醛同时存在的情况下，FSA催化二者生成L-木糖的量，以及中间产物L-甘油醛的量。对照组无酶添加，因此无L-甘油醛和L-木糖生成，而sample组则检测到微量的L-甘油醛和大量的L-木糖，因此可以说明图 1的路径图中FSA催化乙醇醛(2)和甲醛生成L-甘油醛(3)同时又催化L-甘油醛(3)和乙醇醛生成L-木糖(4)的过程可以实现。底物用的0.1 mol/L FALD和0.2 mol/L GALD，因此理论生成0.1 mol/L L-木糖，实际检测到8.14 g，因此该过程转化率为54.3%，而该过程相比图 5中添加生成L-木糖的直接底物L-甘油醛和乙醇醛的效率高，原因可能是L-甘油醛对FSA有一定抑制作用。
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| 图 4 野生型和突变型酶GALS催化甲醛生成乙醇醛的效率 Fig. 4 Efficiency of wild-type and mutant enzyme GALS in catalyzing formaldehyde to glycolaldehyde. |
| 图选项 |
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| 图 5 酶FSA分别催化乙醇醛、L-甘油醛、乙醇醛和L-甘油醛生成L-木糖的转化率 Fig. 5 Enzyme FSA catalyzes the conversion rates of glycolaldehyde, L-glyceraldehyde, glycolaldehyde, and L-glyceraldehyde to L-xylose. |
| 图选项 |
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| 图 6 FSA催化甲醛和乙醇醛生成L-甘油醛和L-木糖的量 Fig. 6 Enzyme FSA catalyzes the production of l-glyceraldehyde and l-xylose from formaldehyde and glycolaldehyde. GALD: glycolaldehyde; L-Gly: L-glyceraldehyde; FSA: FSAA129TA165G; L-xyl: L-xylose. |
| 图选项 |
整个反应体系中，甲醛不仅会被催化合成乙醇醛，还会与乙醇醛反应生成L-甘油醛，乙醇醛可同时与甲醛和L-甘油醛反应。因此，使GALS和FSA的催化速率相匹配显得尤为重要。为了提高甲醛到L-木糖的转化率，测试比较了不同浓度、不同酶比例的GALS和FSA。
为了获得更高的转化率，对两种酶的比例进行优化，发现适当的FSA对于该反应有促进作用。当甲醛的浓度为1 g/L，且使用比例为1:1的GALS与FSA时，转化率高达63.93%，而整体来看，当GALS与FSA的比例为1:2时，整个体系催化效率比较稳定，且在该比例下底物浓度对催化效率影响也较小，因为甲醛参与两步，一步自缩合成乙醇醛，另一步还与乙醇醛反应生成L-木糖，所以如果GALS的比例过高会导致甲醛大部分都缩合为乙醇醛，没有足够多的甲醛与乙醇醛反应生成L-木糖，因此该反应的关键是要保持一定优势的酶FSA的比例。整体从3组情况看，底物浓度为1 g/L的甲醛，足以维持整个反应(图 7)。
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| 图 7 不同浓度甲醛为底物，不同的GALS和FSA酶比例合成L-木糖的转化率 Fig. 7 Different concentrations of formaldehyde as substrates, different ratios of GALS and FSA enzymes to synthesize L-xylose. |
| 图选项 |
3 结论我国是能源大国，碳排放量占全球1/3，发展以一碳为原料的工业生物转化过程，有助于推动工业原料路线的战略转移。而且一碳化合物作为一种应用广泛的绿色能源物质，其来源广泛，廉价易得，将一碳资源转变成生物体中间代谢产物不仅可以改善环境，也能变废为宝。
本研究设计了以甲醛为底物，经过两步催化反应利用甲醛来合成L-木糖，为一碳资源的利用奠定了一定的基础，同时也为其他糖的合成提供了新思路。而且该途径从甲醛到L-木糖两步反应在我们优化了底物浓度和酶比例之后，总转化率高达64%，达到了一个比较高的水平，因此，以甲醛为原料来合成L-木糖的生物途径具有重要意义。
总之，本研究已经开发了一种使用工程化的GALS和FSA通过生物催化级联反应从简单分子甲醛制备L-木糖的途径，值得注意的是，L-木糖的制备具有最佳的能量利用和原子经济性，同时避免了化学或生物催化方法所需的功能化和活化。接下来，将继续寻找合适的醛缩酶或者改造FSA来合成其他单糖。
参考文献
| [1] | Orgel LE. The origin of life-a review of facts and speculations. Trends Biochem Sci, 1998, 23(12): 491-495. DOI:10.1016/S0968-0004(98)01300-0 |
| [2] | Delidovich IV, Simonov AN, Taran OP, et al. Catalytic formation of monosaccharides: from the formose reaction towards selective synthesis. ChemSusChem, 2014, 7(7): 1833-1846. DOI:10.1002/cssc.201400040 |
| [3] | Decker P, Schweer H, Pohlamnn R. Identification of formose sugars, presumable prebiotic metabolites, using capillary gas chromatography/gas chromatography—mas spectrometry of n-butoxime trifluoroacetates on OV-225. J Chromatogr A, 1982, 244(2): 281-291. DOI:10.1016/S0021-9673(00)85692-7 |
| [4] | Partridge RD, Weiss AH, Todd D. Branched-chain carbohydrate structures resulting from formaldehyde condensation. Carbohydrate Res, 1972, 24(1): 29-44. DOI:10.1016/S0008-6215(00)82257-0 |
| [5] | de Bruijn JM, Kieboom APG, van Bekkiun H. Alkaline degradation of monosaccharides Ⅵ1: the fhucto-fobmose reaction of mixtures of D-fructose and formaldehyde. J Carbohydr Chem, 1986, 5(4): 561-569. DOI:10.1080/07328308608062975 |
| [6] | Breslow R. On the mechanism of the formose reaction. Tetrahedron Lett, 1959, 21(1): 22-26. |
| [7] | Simonov AN, Pestunovaet OP, Matvienko LG, et al. Possible prebiotic synthesis of monosaccharides from formaldehyde in presence of phosphates. Adv Space Res, 2007, 40(11): 1634-1640. DOI:10.1016/j.asr.2007.08.002 |
| [8] | Delidovich IV, Tara OP, Simonov AN, et al. Photoinduced catalytic synthesis of biologically important metabolites from formaldehyde and ammonia under plausible "prebiotic" conditions. Adv Space Res, 2011, 48(3): 441-449. DOI:10.1016/j.asr.2011.03.032 |
| [9] | Snytnikova OA, Simonov AN, Pestunova OP, et al. Study of the photoinduced formose reaction by flash and stationary photolysis. Mendeleev Commun, 2006, 16(1): 9-11. DOI:10.1070/MC2006v016n01ABEH002188 |
| [10] | Yoshihiro S, Yoshinobu M, Chikahiro S, et al. Formose reactions. Ⅱ. the photochemical formose reaction. Bull Chem Soc Jpn, 1977, 50(1): 222-226. DOI:10.1246/bcsj.50.222 |
| [11] | Schwartz AW, De Graaf RM. The prebiotic synthesis of carbohydrates: a reassessment. J Mol Evol, 1993, 36(2): 101-106. DOI:10.1007/BF00166245 |
| [12] | Castells J, López-Calahorra F, Geijo F. The formoin reaction. Carbohydrate Res, 1983, 116(2): 197-207. DOI:10.1016/0008-6215(83)88109-9 |
| [13] | Shigemasa Y, Okano A, Saimoto H, et al. The favored formation of DL-glycero-tetrulose in the formose reaction. Carbohydrate Res, 1987, 162(2): c1-c3. DOI:10.1016/0008-6215(87)80231-8 |
| [14] | Shigemasa Y, Tanioka SI, Furukawa H, et al. The favored formation of threo-3-Pentulose in the formose reaction. J Carbohydrate Chem, 1991, 10(1): 97-100. DOI:10.1080/07328309108543894 |
| [15] | Shigemasa Y, Ueda T, Saimoto H. First synthesis of DL-2-C-hydroxymethyl-3-pentulose in the formose reaction. J Carbohydrate Chem, 1989, 8(4): 669-673. DOI:10.1080/07328308908048025 |
| [16] | Yoshihiro S, Takaaki U, Hiroyuki S. Formose reactions. XXVⅢ. selective formation of 2, 4-bis (hydroxymethyl)-3-pentulose in N, N-dimethylformamide- water mixed solvent. Bull Chem Soc Jpn, 1990, 63(2): 389-394. DOI:10.1246/bcsj.63.389 |
| [17] | Matsumoto T, Yamamoto H, Inoue S. Selective formation of triose from formaldehyde catalyzed by thiazolium salt. J Am Chem Soc, 1984, 106(17): 4829-4832. DOI:10.1021/ja00329a031 |
| [18] | Siegel JB, Smith AL, Poust S, et al. Computational protein design enables a novel one-carbon assimilation pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(12): 3704-3709. DOI:10.1073/pnas.1500545112 |
| [19] | Poust S, Piety J, Bar-Even A, et al. Mechanistic analysis of an engineered enzyme that catalyzes the formose reaction. Chem Bio Chem, 2015, 16(13): 1950-1954. DOI:10.1002/cbic.201500228 |
| [20] | Lu XY, Liu YW, Yang YQ, et al. Constructing a synthetic pathway for acetyl-coenzyme a from one-carbon through enzyme design. Nat Commun, 2019, 10: 1378. DOI:10.1038/s41467-019-09095-z |
| [21] | Gutierrez M, Parella T, Joglar J, et al. Structure-guided redesign of D-fructose-6-phosphate aldolase from E. coli: remarkable activity and selectivity towards acceptor substrates by two-point mutation. Chem Commun, 2011, 47(20): 5762-5764. DOI:10.1039/c1cc11069a |
| [22] | Szekrenyi A, Soler A, Garrabou X, et al. Engineering the donor selectivity of D-fructose-6-phosphate aldolase for biocatalytic asymmetric cross-aldol additions of glycolaldehyde. Chem-A Eur J, 2014, 20(39): 12572-12583. DOI:10.1002/chem.201403281 |
| [23] | Castillo JA, Guérard-Hélaine C, Gutiérrez M, et al. A mutant d-fructose-6-phosphate aldolase (Ala129Ser) with improved affinity towards dihydroxyacetone for the synthesis of polyhydroxylated compounds. Adv Synth Cataly, 2010, 352(6): 1039-1046. DOI:10.1002/adsc.200900772 |
| [24] | Szekrenyi A, Garrabou X, Parella T, et al. Asymmetric assembly of aldose carbohydrates from formaldehyde and glycolaldehyde by tandem biocatalytic aldol reactions. Nat Chem, 2015, 7(9): 724-729. DOI:10.1038/nchem.2321 |
| [25] | Butlerow A. Formation synthétique d'une substance sucrée. CR Acad Sci, 1861, 53: 145-147. |
