1. 浙江万里学院 生物与环境学院,浙江 宁波 315100;
2. 浙江大学 动物科学学院,浙江 杭州 310012
收稿日期:2019-07-29;接收日期:2019-10-11
基金项目:国家级大学生创新创业训练计划(No. 201810876022),浙江省大学生新苗人才计划(No. 2018R420012),浙江省自然科学基金(No. LQ19C050001),浙江省生物工程一流学科自设课题(No. ZS2017010)资助
摘要:在高温下保持催化活性是工业酶的重要性质。近年来,采用基因工程、蛋白质工程技术提高野生酶进行催化活性或耐热等性质取得了重要进展。文中利用新近建立起来的异肽键介导的SpyTag/SpyCatcher系统对瘤胃微生物来源的木聚糖酶XYN11-6进行分子环化,获得稳定的环化酶C-XYN11-6。在60 ℃、70 ℃和80 ℃下处理10 min,C-XYN11-6的残余活性为81.53%、73.98%和64.41%,分别是相同条件下线性蛋白L-XYN11-6残余活性的1.48、2.92、3.98倍。经60–90 ℃热处理10 min后,C-XYN11-6仍保持可溶状态,而L-XYN11-6几乎完全聚沉。内源荧光和8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)结合荧光光谱分析显示,较之L-XYN11-6,热处理环境中C-XYN11-6更能够维持其构象稳定。值得注意的是,分子环化提高了C-XYN11-6对0.1–50 mmol/L Ca2+或0.1 mmol/L Cu2+的耐受能力。综上所述,文中利用SpyTag/SpyCatcher系统获得热稳定性和离子稳定性提高的环化酶,为工业酶的分子改良及扩大其在工业领域的应用建立了良好基础。
关键词:瘤胃木聚糖酶分子环化底物降解热稳定性
Enhancing thermostability of xylanase from rumen microbiota by molecular cyclization
Kexin Zhou1, Huan Wang1, Xintao Zhu1, Anqi Zheng1, Nuo Li1, Xiaobao Sun1,2, Deying Gao1, Peipei An2, Jiakun Wang2, Guoying Qian1, Qian Wang1,2
1. College of Biological & Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, Zhejiang, China;
2. College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310012, Zhejiang, China
Received: July 29, 2019; Accepted: October 11, 2019
Supported by: National Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program (No. 201810876022), Zhejiang Xinmiao Talents Program (No. 2018R420012), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (No. LQ19C050001), Zhejiang Provincial Top Key Discipline of Bioengineering Level A(No. ZS2017010)
Corresponding author: Qian Wang. Tel: +86-574-88222391; E-mail: wangq@zwu.edu.cn.
Abstract: The capacity for thermal tolerance is critical for industrial enzyme. In the past decade, great efforts have been made to endow wild-type enzymes with higher catalytic activity or thermostability using gene engineering and protein engineering strategies. In this study, a recently developed SpyTag/SpyCatcher system, mediated by isopeptide bond-ligation, was used to modify a rumen microbiota-derived xylanase XYN11-6 as cyclized and stable enzyme C-XYN11-6. After incubation at 60, 70 or 80 ℃ for 10 min, the residual activities of C-XYN11-6 were 81.53%, 73.98% or 64.41%, which were 1.48, 2.92 or 3.98-fold of linear enzyme L-XYN11-6, respectively. After exposure to 60–90℃ for 10 min, the C-XYN11-6 remained as soluble in suspension, while L-XYN11-6 showed severely aggregation. Intrinsic and 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS)-binding fluorescence analysis revealed that C-XYN11-6 was more capable of maintaining its conformation during heat challenge, compared with L-XYN11-6. Interestingly, molecular cyclization also conferred C-XYN11-6 with improved resilience to 0.1–50 mmol/L Ca2+ or 0.1 mmol/L Cu2+ treatment. In summary, we generated a thermal- and ion-stable cyclized enzyme using SpyTag/SpyCatcher system, which will be of particular interest in engineering of enzymes for industrial application.
Keywords: rumenxylanasemolecular cyclizationsubstrate degradationthermostability
酶在高温、强酸/碱、金属离子、有机溶剂等工业环境下,易发生构象改变从而失去活性[1],如何获取高活性和良好稳定性的工业酶成为研究者关注的焦点[2]。理想的工业酶通常需兼具高催化活性与良好的分子稳定性,然而此类理想型糖苷水解酶很难从自然界直接获取。常规的菌种选育方法难以在短期内达到预期目标。通常,对于蛋白质的分子改良包括以下两个方面:以点突变为代表的理性设计和以定向进化为代表的非理性设计。前者需要充分掌握酶的结构、作用位点等信息,而后者从大量的突变体库中筛选优势突变体,需要高通量筛选技术作为支撑。因此,在不了解详细催化机制或缺少有效筛选方式的情况下,难以对目标蛋白进行分子改良[3]。
蛋白质的稳定性与其结构中的折叠状态息息相关,分子环化能够降低蛋白折叠域与非折叠域的构象熵,进而增加蛋白质稳定性,同时可增加蛋白质的受体亲和力,其功能和活性几乎不受影响[4]。蛋白质环化是一种将线性肽的C-端和N-端通过酰胺键进行首尾环合形成环状分子的过程。目前,已建立起多种经生物法获得环状蛋白的方法,其中较为常用的方法包括蛋白质反式剪接(Protein trans-splicing,PTS)[5]、内含肽介导的蛋白表达连接(Expressed protein ligation,EPL)[6]、转肽酶(Sortase)介导的转肽作用(Sortagging)[7]等。然而,这些环化方式通常受光、温度、pH或氧化还原状态等外部因素调节。
自然界中存在天然环肽类物质具有首尾相连的环化结构。与线性蛋白相比,环化蛋白具有较高的热稳定性和结构稳定性[8]。但大多数天然蛋白在生物体内均为线性蛋白,存在对热、金属离子、抑制剂等复杂环境中的稳定性不足,导致其活性快速丧失,制约了其在工业催化、食品制造、医药领域的应用。牛津大学的Howarth团队在革兰氏阳性菌酿脓链球菌Streptococcu spyogenes纤连蛋白CnaB2中分离了带有Asp117的C-端肽段(SpyTag)和带有Lys31的N-端肽段(SpyCatcher)。其中,Lys31能够和Asp117侧链自发地进行共价结合[9-10]。该反应能够在短时间内完成,并且不需要任何特异性酶活离子进行催化。将SpyTag和SpyCatcher肽段分别置于目的蛋白N-和C-末端可自发形成异肽键从而实现分子环化,这种异肽键一经形成很难发生逆反应。与其他环化途径相比,经异肽键共价结合的蛋白分子的化学稳定性和热稳定性大幅度提高,为酶分子的稳定性改造提供了新思路[11-12]。Wang等[13]发现,经SpyTag/SpyCatcher系统分子环化的地衣聚糖酶最适反应温度提升5 ℃,且在100 ℃下处理10 min后仍能保持80%的残余活性。另有研究显示,β-内酰胺酶在55 ℃条件下发生聚沉,可溶性蛋白显著减少且活性丧失。而相同条件下,经异肽键连接介导的环化β-内酰胺酶活性则几乎不受影响,且Tm值显著上升[14]。此外,SpyTag/SpyCatcher系统在生物材料、医学等方面也发挥了重要的作用,如与蛋白质形成网状的生物材料,可以包裹活性胚胎干细胞等,防止其失活,同时可增强癌细胞捕获,作为药物缓释/输送材料、获得多种构型蛋白、蛋白质-RNA互作等[15-18]。由于其效果显著、使用便捷、适用范围广等优点,异肽键介导的分子环化技术已成为国际上的研究热点[19-20]。
本研究利用SpyTag/SpyCatcher系统对瘤胃未培养微生物来源的内切木聚糖酶XYN11-6进行分子环化[21],分析线性和环化酶蛋白的基本酶学性质,重点关注分子环化提升酶蛋白热稳定性,并探究了环化前后蛋白构象的变化,为提升工业酶在加工及应用范围建立基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种和质粒克隆宿主大肠杆菌Escherichia coli TOP10F’和原核表达宿主E. coli BL21(DE3)本实验室保存。pET-30a(+)购于Novagen公司,pET30a(+)/XYN11-6和用于分子环化的pETTC质粒由本实验室前期构建[21-23]。
1.1.2 主要试剂T4 DNA连接酶购自北京全式金生物技术有限公司,限制性内切酶购自Promega公司。PCR产物纯化试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司,DNA割胶回收试剂盒购自Axygen,质粒小量抽提试剂盒购自AidLab公司。HisTrapTM FF层析柱购自GE公司,山毛榉木聚糖购自Sigma公司。酵母浸提物、蛋白胨、卡那霉素(Kanamycin,Kan)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)、重组牛肠激酶(Enterokinase,EK)购自BBI,其余试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司分子生物学级产品。
1.2 重组载体及宿主构建以含瘤胃微生物木聚糖酶基因的pET30a(+)/XYN11-6质粒为模板,利用XYN11-BamHⅠ (5′-CGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCCGC-3′)和XYN11-HindⅢ (5′-CAAGCTTCGCCCCCTCGAT ATAGACCT-3′)引物进行PCR扩增,获得699 bp的目的片段。经BamHⅠ和HindⅢ双酶切,纯化回收目的产物后分别连接至pET30a(+)或pETTC载体,连接产物热激转化E. coli TOP10F’感受态,涂布含100 μg/mL Kan的Luria-Bertani (LB)固体平板。采用菌落PCR法筛选阳性转化子,并提取重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序进一步验证。测序正确的重组质粒命名为pET30a/trXYN11-6和pETTC/trXYN11-6,并热激转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞,涂布含100 μg/mL Kan的LB固体平板。
1.3 重组蛋白诱导表达从平板上挑取重组宿主BL21/pET30a/trXYN11-6和BL21/pETTC/trXYN11-6至3 mL含100 μg/mL Kan的LB培养基,37 ℃、200 r/min振荡培养16–20 h。将培养基以1%接种量接种200 mL LB培养基,37 ℃、200 r/min振荡培养至OD600=0.6–1 (约3–5 h)。添加终浓度为1 mmol/L IPTG,在16 ℃、100 r/min下诱导表达12–16 h后,4 ℃、12 000 r/min离心15 min收集细胞。用50 mL 1×PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,2 mmol/L KH2PO4,pH 7.4)重新悬浮菌体,流速6 L/h,压力800 MPa,6 ℃,在FB-2010均质机(上海励途)中破碎5 min。4 ℃、12 000 r/min离心15 min收集上清液即为粗酶液。
1.4 蛋白纯化与SDS-PAGE将上述粗酶液上样HisTrapTM FF层析柱,利用20 mmol/L至1 mol/L咪唑,流速0.3 mL/mL在BioLogic LP层析系统上(Bio-Rad)进行梯度洗脱线性(L-XYN11-6)与环化XYN11-6 (C-XYN11-6)。纯化的蛋白利用10 kDa Amicon? Ultra超滤管(Millipore)去除残余咪唑后,用于电泳和后续性质分析。
纯化蛋白与1×上样缓冲液混合,煮沸10 min,4 ℃、12 000 r/min离心5 min后,收集上清液用于SDS-PAGE (15%分离胶,4%浓缩胶)。电泳结束后,用考马斯亮蓝R250染色1 h,脱色,拍照观察。
1.5 酶活力测定采用3, 5二硝基水杨酸(DNS)法测定木聚糖酶活性[24],采用Bradford法测定蛋白浓度[25]。除特殊需求外,本研究均采用1.5 μg纯化酶用于性质分析。
1.5.1 最适pH将纯化后的15 μL线性或环化XYN11-6酶液分别与60 μL用pH 3.0–10.0缓冲液(柠檬酸/磷酸缓冲液pH 3.0–8.0;甘氨酸/NaOH缓冲液pH 9.0– 10.0)配制的0.5%木聚糖底物在50 ℃下反应10 min。同时设置空白对照组,空白管中加入15 μL预先煮沸灭活的酶液,反应10 min。在上述试验和对照体系加入75 μL DNS试剂,100 ℃保温15 min。待冷却至室温后,使用SpectraMax M3酶标仪(Molecular Devices)于540 nm下测定XYN11-6反应活性,设4组平行试验。以最高活性时的pH为100%,计算各pH条件下相对活性。
1.5.2 最适温度将纯化后15 μL线性或环化XYN11-6酶液分别与60 μL 0.5%木聚糖底物(pH 6.0)混合,于30–80 ℃下反应10 min。设置空白对照组,测定方法同上。以最高活性时的反应温度为100%,计算各温度条件下的相对活性。
1.5.3 pH稳定性在最适温度下,将7.5 μL酶液置于7.5 μL不同pH缓冲液(pH 3.0–10.0)中1 h后,各实验管中加入60 μL 0.5%木聚糖底物,于50 ℃、pH 6.0条件下反应10 min。设置空白对照组,测定方法同上。以反应起始点为100%,计算各pH条件下的残余活性。
1.5.4 热稳定性在pH 6.0中,将7.5 μL酶液置于不同温度(40–80 ℃)下保温60 min,分别于0、2、5、10、20、40、60 min取样,分别加入60 μL 0.5%木聚糖底物,于50 ℃、pH 6.0条件下反应10 min。设置空白对照组,测定方法同上。以反应起始点为100%,计算各温度条件下的残余活性。
1.5.5 离子稳定性将7.5 μL酶液与7.5 μL不同浓度(0– 50 mmol/L)的金属离子溶液(Ca2+或Cu2+)混合,4 ℃孵育1 h后,各实验管中加入60 μL 0.5%木聚糖底物,于50 ℃、pH 6.0条件下反应10 min。设置空白对照组,测定方法同上。以不加离子溶液为100%,计算各离子条件下的残余活性。
1.5.6 动力学参数分别配制不同浓度(0.5–14 mg/mL)山毛榉木聚糖底物,在最适反应条件下进行酶促反应5 min,设4组平行试验。利用GraphPad Prism 7计算Km及Vmax。
1.6 蛋白聚沉分析将溶于1×PBS缓冲液的纯化酶蛋白(约2.5 μg)分别于25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃中保温10 min,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,上清液用于SDS-PAGE和活性分析。
1.7 荧光光谱分析将溶于1×PBS缓冲液的纯化酶蛋白(约20 μg)加入0.1 cm比色皿,置于RF-5301pc荧光分光光度计(SHIMADZU)中。激发波长280 nm,发散波长300–500 nm。以未处理的L-XYN11-6与C-XYN11-6为对照,分别测定它们在25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃条件下孵育5 min后的内源荧光光谱。
进一步利用ANS结合酶蛋白,激发波长390 nm,发散波长400–600 nm。以未处理的L-XYN11-6与C-XYN11-6为对照,分别测定它们在25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃条件下孵育5 min后的外源荧光光谱。
1.8 数据统计数据与图片处理采用GraphPad Prism 7.0,数据以平均值±标准差(x±s) (n=4),采用双尾学生t-检验进行统计分析,*P < 0.05;**P < 0.01。
2 结果与分析2.1 重组蛋白表达与分析XYN11-6 (即ORF6)是经湖羊瘤胃微生物Fosmid文库筛选获取的木聚糖酶基因[17]。BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和系统进化树分析显示,该蛋白来源于未培养瘤胃微生物,与已报道的木聚糖酶相似度较低(图 1)。序列比对显示,XYN11-6氨基酸序列与瘤胃梭状芽孢杆菌Ruminiclostridium cellulolyticum (GenBank登录号:ACL75128.1)、产黄纤维单胞菌Cellulomonas flavigena (GenBank登录号:CAJ57849.1)和豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae (登录号:BAA06837.1)来源的木聚糖酶相似度仅分别为38.79%、38.03%和35.59%。
图 1 木聚糖酶系统发育树分析 Fig. 1 Phylogenetic tree analysis of xylanases. XYN11-6 was labeled with arrow. |
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Pfam分析(http://pfam.xfam.org/)显示,XYN11-6蛋白包含一个N端的GH11家族木聚糖酶的催化结构域和一个C端未知结构域。为探究SpyTag/SpyCatcher系统对酶稳定性的作用,本研究将其催化结构域亚克隆至原核表达载体,在大肠杆菌中异源表达获得线性蛋白L-XYN11-6,进一步在其N和C端分别加上来自S. pyogenes纤连蛋白CnaB2的SpyTag和SpyCatcher肽段,经Asp117和Lys31自发形成异肽键获得环化蛋白C-XYN11-6(图 2A)[22-23]。
图 2 XYN11-6的分子环化 Fig. 2 Molecular cyclization of XYN11-6. (A) Schematic diagram of cyclization. EK: Enterokinase. (B) SDS-PAGE analysis of linear and cyclized XYN11-6 proteins. 1: L-XYN11-6; 2: C- XYN11-6; 3: RL- XYN11-6. |
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SDS-PAGE结果显示,经6×His亲和层析后L-XYN11-6的分子量约为38 kDa,略大于其理论分子量32.8 kDa,推测可能是由于其理论等电点(pI=6.73)接近中性,影响其在凝胶中的泳动速度。C-XYN11-6的分子量约为45 kDa,与其理论分子量45.8 kDa相一致(图 2B)。为消除末端肽段对试验过程的影响,进一步利用EK酶切割C-XYN11-6,重新获得线性化的C-XYN11-6 (RL-XYN11-6),用于热稳定性分析。
2.2 最适pH和pH稳定性线性蛋白L-XYN11-6和环化蛋白C-XYN11-6的最适pH和pH稳定性呈现类似的规律。两种蛋白的最适pH均为pH 5.0,pH 5.0–8.0范围内活性较高(图 3A),在较广的pH范围内较为稳定,在pH 4.0–9.0下处理1 h残余活性达70%以上(图 3B)。
图 3 XYN11-6最适pH和pH耐受 Fig. 3 The optimum pH and pH stability of XYN11-6. (A) Optimum pH. (B) pH stability. Data represent the x±s (n=4). |
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2.3 最适温度和热稳定性线性蛋白L-XYN11-6和环化蛋白C-XYN11-6的最适温度均为50 ℃ (图 4A)。环化蛋白较之线性蛋白最适温度并没有提升,但C-XYN11-6在高温(60–90 ℃)下的催化作用优于L-XYN11-6。热稳定性试验表明,L-XYN11-6在50 ℃以下较为稳定,50 ℃处理1 h,酶活性仍能保持80.30%± 3.33%。当温度继续升高,则活性迅速下降。在60%、70%和80 ℃条件下分别处理10 min,L-XYN11-6的残余活性为63.30%、39.72%和27.50% (图 4B)。与线性蛋白相比,环化蛋白的热稳定性显著提升。将C-XYN11-6分别在60 ℃、70 ℃和80 ℃条件下处理10 min,C-XYN11-6的残余活性为81.53%、73.98%和64.41%,分别是相同条件下L-XYN11-6残余活性的1.48、2.92和3.98倍(图 4C)。即使在60 ℃和70 ℃条件下处理1 h,C-XYN11-6仍保留64.59%和34.50%的残余活性,而L-XYN11-6则完全失活,表明环化后蛋白的热稳定性得到提升。
图 4 XYN11-6最适温度和温度耐受 Fig. 4 The optimum temperature and thermostability of XYN11-6. (A) Optimum temperature. (B–D) Thermostability of L-XYN11-6 (B), C-XYN11-6 (C) and RL-XYN11-6 (D). Data represent the x±s(n=4). |
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为验证异肽键介导的分子环化与酶蛋白热稳定性的相关性,我们进一步利用EK酶对C-XYN11-6进行重新线性化(图 2),并分析其热稳定性。试验结果显示,重新线性化的C-XYN11-6蛋白(RL-XYN11-6)的热稳定性迅速下降,将其在60 ℃和70 ℃条件下分别处理1 h,RL-XYN11-6残余活性为5.93%和1.62% (图 4D),与L-XYN11-6的残余活性相接近,表明异肽键介导的分子环化而非蛋白末端的SpyTag或SpyCatcher肽段提升了酶的热稳定性。
2.4 离子稳定性进一步研究分子环化对金属离子的耐受能力,发现C-XYN11-6对Ca2+和Cu2+的耐受能力优于L-XYN11-6。经0.1 mmol/L Ca2+和Cu2+处理1 h后,C-XYN11-6的残余活性分别为84.53%± 5.20%和66.31%±12.17%,分别是相同条件下L-XYN11-6残余活性的2.22倍和3.00倍(P < 0.01) (图 5)。同时,离子耐受能力呈现明显的剂量效应。当离子浓度提高至0.5 mmol/L以上时,分子环化对离子的能力减弱(图 5A),甚至消失(图 5B)。
图 5 金属离子对木聚糖酶活性的影响 Fig. 5 Effects of metal ions on xylanase activities. (A) Ca2+. (B) Cu2+. Data represent the x±s(n=4). Statistical significance was analyzed using a two-tailed Student's t-test by GraphPad Prism 7.0 and indicated by asterisks: *, P < 0.05; **, P < 0.01. |
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2.5 动力学参数以山毛榉木聚糖为底物,线性蛋白L-XYN11-6米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)分别为(9.15±1.28) mg/mL和(1 594±144.2) μmol/(min·mg protein),环化蛋白C-XYN11-6的Km和Vmax分别为(9.39±0.61) mg/mL和(1 426±49.40)μmol/(min·mg protein)。以0.5%山毛榉木聚糖为底物时,C-XYN11-6的比活性为(484±12.1) U/mg,与L-XYN11-6的(542±50.0) U/mg无显著差异(P=0.062),提示分子环化提升酶热稳定性的同时并没有降低酶的催化效率。
2.6 抗聚沉能力分析抗热聚沉能力分析结果显示,L-XYN11-6在50 ℃以下较为稳定,温度继续升高至60 ℃以上,则蛋白迅速变性,进而发生聚沉(图 6A)。较之L-XYN11-6,C-XYN11-6的抗聚沉能力显著提升,在60–90 ℃下处理10 min后,大部分蛋白仍能处于上清液中(图 6B)。经60 ℃条件下处理10 min后,C-XYN11-6的残余活性为63.70%±4.44%,是L-XYN11-6的3.91倍(P < 0.05)。随着温度继续升高,C-XYN11-6的残余活性仍显著高于L-XYN11-6 (P < 0.001) (图 6C),这与热稳定性的试验结果相符合(图 4B和4C)。
图 6 抗热聚沉能力分析 Fig. 6 Resistance to heat aggregation. (A–B) Protein aggregation of L-XYN11-6 (A) and C-XYN11-6 (B). (C) Residual activities of supernatant enzymes after heat challenge. M: standard protein marker; CK: control. Data represent the x±s(n=4). Statistical significance was analyzed using a two-tailed Student's t-test by GraphPad Prism 7.0 and indicated by asterisks: *, P < 0.05; **, P < 0.01. |
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2.7 荧光光谱分析为分析线性与环化XYN11-6在热激过程中构象的变化,我们进一步开展内源荧光分析。在25 ℃、40 ℃和50 ℃条件下处理5 min后,线性蛋白L-XYN11-6的荧光值逐渐上升;当温度高于60 ℃时,L-XYN11-6的荧光值又迅速下降,同时伴随着最大发射波长从336 nm红移至338 nm;当温度上升至到90 ℃时,红移值达3 nm (图 7A),提示其构象发生剧烈改变[22]。而环化蛋白C-XYN11-6经25–90 ℃下处理5 min后,其荧光值略有上升,最大吸收波长也仅从337 nm红移至338 nm (图 7B),提示其构象基本维持稳定。利用ANS对疏水区域进行标记,其外源荧光光谱呈现与内源荧光光谱类似的规律(图 7C和7D),表明经分子环化的酶分子更能够维持其蛋白构象稳定。
图 7 荧光光谱分析 Fig. 7 Fluorescence spectra analysis. (A) Intrinsic fluorescence of L-XYN11-6. (B) Intrinsic fluorescence of C-XYN11-6. (C) ANS-binding fluorescence of L-XYN11-6. (D) ANS-binding fluorescence of C-XYN11-6. The inset plots show the maximum peak wavelengths. |
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3 讨论近年来,采用基因工程、蛋白质工程等手段提升野生木聚糖酶的酶学性质受到广泛关注。通过在分子水平对野生木聚糖酶进行改造,使其拥有优良的温度耐受性,利于酶制剂大范围应用于工业化生产。Hegazy等[26]采用易错PCR (Error-prone PCR)构建突变文库和微孔板筛选相结合的方法对嗜热脂肪土芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus木聚糖酶XT6进行改造,获得转化数(kcat)提高4.5倍的突变体。He等[27]对里氏木霉Trichoderma reesei木聚糖酶Xyn2进行点突变,获得60 ℃下半衰期分别提高2.5倍的XM1 (F14C/Q52C)和1.8倍的XM2 (V59C/S149C)突变体。Nakatani等[28]采用序列饱和突变技术(Site saturation mutagenesis)对来自芽孢杆菌TAR-1的木聚糖酶XynR进行改造,其突变体在80 ℃条件下处理15 min后仍保留80%的残余活性。此外,有研究报道通过N端序列置换[29]或在靶蛋白C端添加一个额外的α螺旋结构[30],也能提高木聚糖酶的热稳定性。
上述的分子改良技术的确能有效改善木聚糖酶的热稳定性。然而,定向进化需要有效且高通量的筛选技术,通常筛选容量达104–107的突变体文库才能获得理想的优势突变体[31];点突变技术则需要掌握酶蛋白的催化位点、催化机制等具体信息,才能选择靶向氨基酸残基作为突变位点,一定程度上限制了它们作为分子改良手段的使用范围[32]。相比之下,异肽键介导的分子环化技术反应迅速、无需特殊催化剂,能更简便、快速地提升蛋白稳定性,且适用的范围更广[22]。
反刍动物瘤胃中的微生物能有效降解植物性饲料中的木质纤维素类物质,生成挥发性脂肪酸供机体生长所需[33]。前期研究中,我们采用宏基因组与宏转录组相结合的方法从湖羊瘤胃中筛选获得一系列高活性的木聚糖酶、纤维素酶等糖苷水解酶[21, 34]。然而,这类具备木质纤维素底物高效降解能力的酶热稳定性相对不足,如木聚糖酶XYN-LXY于50 ℃处理10 min后,活性损失达50%以上,推测可能是瘤胃微生物来源的酶蛋白适应在动物机体温度(38–41 ℃)下催化的结果[35]。
针对瘤胃微生物来源糖苷水解酶热稳定性的不足,本研究将XYN11-6进行分子环化,分析线性与环化蛋白的酶学性质。结果显示,线性蛋白L-XYN11-6和环化蛋白C-XYN11-6呈现类似的最适pH与pH稳定性(图 3)。然而,环化蛋白的热稳定性显著提升。在60 ℃、70 ℃和80 ℃下分别处理10 min后,C-XYN11-6的残余活性为81.53%、73.98%和64.41%,分别是相同条件下L-XYN11-6残余活性的1.48、2.92、3.98倍(图 4C)。我们进一步利用EK将C-XYN11-6重新切割为线性构象(图 2),发现RL-XYN11-6的热稳定性明显低于C-XYN11-6 (图 3D),提示异肽键介导的分子环化而不是酶蛋白两侧的SpyTag或SpyCatcher肽段提升了酶的稳定性[25]。值得注意的是,RL-XYN11-6甚至比L-XYN11-6更不稳定,推测是由于EK切割时间较长,导致酶蛋白发生部分失活。之后的聚沉试验和荧光光谱分析进一步证实了环化提升了酶蛋白的耐热能力。在较高温度(60–90 ℃)环境中,L-XYN11-6迅速发生构象改变,芳香族氨基酸残基和蛋白疏水区的暴露,伴随着最大吸收波长红移的现象(图 7A和7C),造成蛋白变性失活,进一步发生聚集进而聚沉析出(图 6A)。然而,C-XYN11-6在相同条件下仍能维持其蛋白基本构象稳定,仅发生微弱红移(图 7B和7D),仅表现出部分蛋白失活,即使在90 ℃下处理10 min几乎不发生聚沉(图 6B),有力地证明异肽键介导的分子环化有助于提升蛋白的热稳定性。值得注意的是,有研究报道SpyTag/SpyCatcher分子环化可以提升L-苯丙氨酸醛缩酶在乙醇、丙酮等有机溶剂中的稳定性[36]。本研究中,我们还发现分子环化有助于提升对部分金属离子的耐受能力(图 5),其作用机制需要进一步展开研究。
综上所述,本研究采用异肽键介导的SpyTag/SpyCatcher系统对瘤胃未培养微生物来源的木聚糖酶进行分子环化,提升酶的热稳定性和抗聚沉能力。较之传统的分子改良策略,分子环化技术具有反应速率快、反应过程无需特定催化酶、适用对象广等优势,为提升工业酶的分子稳定性建立了良好基础。
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