, 刘德武1 1. 华南农业大学 动物科学学院 国家生猪种业工程技术研究中心，广东 广州 510642;
2. 温氏食品集团股份有限公司，广东 云浮 527400
收稿日期：2019-11-01；接收日期：2020-02-19
基金项目：国家转基因重大专项(No. 2016ZX08006002), 广东省科技创新战略专项(No. 2018B020203002)资助
摘要：成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)系统是目前基因编辑、基因表达研究的热点，其中靶向RNA的CRISPR/Cas13系统的开发为RNA的干扰和编辑提供了新的方向。文中针对HEK293T细胞非同源末端连接(Nonhomologous end joining，NHEJ)通路修复关键因子Ku70和Lig4的编码序列，设计并合成CRISPR/Cas13a、b系统相应的gRNA，检测其对ku70和lig4基因表达的影响。结果显示，Cas13a对ku70和lig4的RNA敲减效果可以达到50%以上，Cas13b对ku70和lig4的RNA敲减效果分别达到92%和76%；同时Cas13a、b系统能将Ku70和Lig4蛋白水平分别下调至68%和53%。CRISPR/Cas13系统可有效敲减HEK293T细胞RNA和蛋白质表达，为基因功能和调控研究提供一种新的策略。
关键词：CRISPR/Cas13ku70lig4基因敲减
Knockdown the expression of ku70 and lig4 in HEK293T cells by CRISPR/Cas13 system
Haoqiang Wang1, Guoling Li1, Guangyan Huang1, Zicong Li1, Enqin Zheng1, Zheng Xu1, Huaqiang Yang1,2, Zhenfang Wu1,2, Xianwei Zhang1,2
, Dewu Liu1 1. National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry, College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China;
2. Wens Foodstuff Group Co., Ltd, Yunfu 527400, Guangdong, China
Received: November 1, 2019; Accepted: February 19, 2020
Supported by: National Transgenic Major Projects (No. 2016ZX08006002), Project of R & D Plan in Key Areas of Guangdong, China (No. 2018B020203002)
Corresponding author: Xianwei Zhang. Tel: +86-766-2986345; E-mail: zxianw@163.com;
Dewu Liu. Tel: +86-20-85284816; E-mail: dwliu@scau.edu.cn.
Abstract: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated proteins (Cas) system is a hotspot of gene editing and gene expression research, in which CRISPR/Cas13 system provides a new direction for RNA interference and editing. In this study, we designed and synthesized the corresponding gRNAs of CRISPR/Cas13a and CRISPR/Cas13b systems in non-homologous end joining (NHEJ) pathway, such as Ku70 and Lig4, and then detected the expression of ku70 and lig4 in HEK293T cells. The CRISPR/Cas13a system could efficiently knockdown the mRNA expression of ku70 and lig4 more than 50%, and CRISPR/Cas13b system also suppressed ku70 and lig4 about 92% and 76%, respectively. Also, CRISPR/Cas13a, b systems could down-regulate Ku70 and Lig4 proteins level to 68% and 53%, respectively. The study demonstrates that the CRISPR/Cas13 system could effectively knockdown the expression of RNA and protein in HEK293T cells, providing a new strategy for gene function and regulation research.
Keywords: CRISPR/Cas13ku70lig4gene knockdown
CRISPR/Cas系统是来源于细菌与古菌的一种后天免疫防御系统，主要用于防止外来质粒或噬菌体的侵入[1]，其中ⅡCRISPR/Cas9系统能对基因组DNA实现精确编辑，目前已被广泛应用于农业生产及医学领域[2]。最近研究发现一种新型的靶向RNA的CRISPR蛋白Cas13，它的发现及开发为人类干扰和编辑RNA提供更便捷的方法。Cas13属于2类Ⅵ型CIRSPR关联蛋白家族，该蛋白目前共发现4种亚型，分别是Cas13a (也称作C2c2)、Cas13b、Cas13c和Cas13d[3]。与CRISPR/Cas9类似，Ⅵ型CRISPR系统含有一个效应蛋白即Cas13蛋白，它与CRISPR RNA (crRNA)结合后形成一个crRNA引导的RNA靶向复合物[4-7]。截至目前，所发现的Cas13蛋白均有两个截然不同的核糖核酸酶活性。其一，主要用于pre-crRNA的加工，有利于Ⅵ型干扰复合物的形成；其二，由两个高等真核和原核核酸结合结构域(Higher eukarytoes and prokaryotes nucleotide-binding domain，HEPN)提供，是病毒干扰过程中降解外来RNA的关键。另外，除了Cas13蛋白外，部分Ⅵ型系统拥有额外的附属蛋白，这些蛋白是非必需的，但具有调节干扰效果的活性[5-6]。Ⅳ-B和Ⅵ-C系统缺乏适应性基因cas1和cas2，说明它们可能利用同一基因组内的其他Cas位点获取适应模块，或者丢失适应模块，不再需要获取新的原始间隔序列。特别地，Cas13b存在两种亚型Ⅵ-B1和Ⅵ-B2，其中Ⅵ-B1系统拥有一个额外的开放阅读框Csx28，它编码一种小蛋白，该小蛋白带着一个假定的跨膜结构域(或信号肽)和一个发散的HEPN结构域；Ⅵ-B2系统拥有一个不同的开放阅读框Csx27，它编码一种包含3–4个可预测的跨膜结构域。Ⅵ-D系统具有更小的Cas13蛋白，并且携带一个与原核防御系统有关的WYL结构域附属蛋白。张锋实验室根据Cas13蛋白靶向RNA的性质，设计并开发了靶向RNA的CRISPR/Cas13a、b系统[8]，通过设计28/30 nt的RNA互补序列，可以实现特异性切割靶RNA和非特异性切割周围环境的RNA。研究表明，来源于纤毛菌属Leptotrichia wadeii的LwaCas13a具有50%左右的RNA敲减水平[8]，来源于普氏菌属(Prevotella sp. P5-125)的PspCas13b在萤火虫素酶报告载体上具有90%–95%的RNA敲减水平[9]。相对传统的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，CRISPR/Cas13系统具有更好的专一性和更低的脱靶效应[8-11]；相对于CRISPR/Cas9等DNA编辑工具，RNA水平的编辑避免了任何由于对遗传基因组DNA操作所引发的脱靶效应的担忧，为基因编辑器的改造和疾病的治疗提供了多种可选择的高效手段。
本课题组前期研究发现RNA干扰NHEJ关键因子Ku70、Ku80、PNKP、Lig4等可显著提高猪原代成纤维细胞的同源定向修复(Homology- directed repair，HDR)效率[12-13]，同时CRISPR干扰Ku70和Ku80同样能够显著提高HDR编辑效率[14-15]。因此，本研究尝试利用CRISPR/Cas13a、b系统特异性敲减HEK293T细胞ku70和lig4基因表达，为提高HDR效率提供一种新的策略，为CRISPR/Cas13蛋白的研究提供经验。
1 材料与方法1.1 材料Cas13a系统(#91906和#91924)、Cas13b系统(#103854和#103862)和mCherry2-C1质粒(# 54563)均来源于美国Addgene。HEK293T购自美国标准生物品收藏中心(#ATCC ACS-4500)。
1.2 Cas13a、b系统构建针对人ku70 (GeneID: 2547)和lig4 (GeneID: 3981) 2个基因的CDS序列分别设计对应的gRNA (表 1和表 2)，并由北京六合华大基因科技有限公司合成gRNA oligo引物。参考Thermo Fisher Scientific的Fast Digest BpiⅠ说明书线性化Cas13a、b的U6质粒。将上述合成的引物退火后与线性化的U6质粒16 ℃过夜连接，详细体系见TaKaRa T4 DNA Ligase (#2011A)说明书。将连接好的环状DNA转化到大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中，并划线涂板。第2天将扩大培养的单克隆菌落(AmpR)进行Sanger测序，测序引物为U6 (human): CCGTAACTTGAAAGT ATTTCG，将测序正确的菌液在氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL的LA培养基中扩大培养，并用Omega bio-tek公司的Endo-Free Plasmid Mini Kit Ⅱ (#D6950)进行质粒抽提备用，为后续HEK293T细胞转染做准备。
表 1 Cas13a和Cas13b靶向ku70的gRNA序列Table 1 Cas13a and Cas13b target gRNA sequence of ku70
| System | Items | Sequence (5'–3') |
| Cas13a | g1 | GCCTCCAAGGCTATGTTTGAATCTCAGA |
| g2 | GAGCATCCAGTGTATCCAAAGTGTGTAC | |
| g3 | GATCTCTTGGCTGTGGTGTTCTATGGTA | |
| Cas13b | g1 | GAATATTTATAGTCTCCACTTGCTTCAAGG |
| g2 | ATCAAACTATCTCTTCCTGAATATTTATAG | |
| g3 | GAGATTCAAACATAGCCTTGGAGGCATCAA | |
| g4 | GTCAAAAGGTGTCAACTCATCTTCACTCTG | |
| g5 | GTACACACTTTGGATACACTGGATGCTCAT | |
| g6 | GAGATCTCGATCACTGCTTATGATCTTACT |
表选项
表 2 Cas13a和Cas13b靶向lig4的gRNA序列Table 2 Cas13a and Cas13b target gRNA sequence of lig4
| System | Items | Sequence (5'–3') |
| Cas13a | g1 | GATCTGGAAAAAGTCTGTAGGCAACTGC |
| g2 | GATCCTTCTGTAGGACTCAGTGATATTT | |
| g3 | GCAACTGCATGATCCTTCTGTAGGACTC | |
| Cas13b | g1 | GATCTGTAGTGACATTATGCAACTCAGCAG |
| g2 | GTCCTACAGAAGGATCATGCAGTTGCCTAC | |
| g3 | GATAGAAATATCACTGAGTCCTACAGAAGG | |
| g4 | GCAGCTAGCATTGGTTTAAATGCAGAAAAT | |
| g5 | GAGTCCTACAGAAGGATCATGCAGTTGCCT | |
| g6 | GCAATAGCAGCTAGCATTGGTTTAAATGCA |
表选项
1.3 细胞培养与传代将液氮保存的HEK293T在37 ℃水浴锅中快速解冻，解冻的细胞经600×g、5 min离心后，使用含10% FBS (Gibco)和1% Anti-Anti (Invitrogen)的DMEM (Invitrogen)生长培养基重悬细胞并进行培养，培养条件为37 ℃、5% CO2。细胞生长至90%时，用PBS清洗2遍，随后加入适量的Trypsin/EDTA (0.05%，Gibco)消化1–2 min，待细胞完全脱落后用生长培养基终止反应，600×g离心5 min后，使用生长培养基重悬细胞并接种至新的细胞培养皿中继续培养。
1.4 实时荧光定量PCR检测Cas13a、b系统对mRNA的干扰效果当HEK293T细胞汇合度达到70%–90%时，参考Thermo Fisher Scientific公司的Lipofectamine 3000 Reagent说明书转染细胞。以24孔板为例，每孔将500 ng Cas13a、b质粒分别和500 ng相应的U6-gRNA共转染至细胞中。转染48 h后，抽提细胞RNA，经反转录后对细胞cDNA进行实时荧光定量PCR，检测ku70和lig4的RNA表达水平，荧光定量PCR引物见表 3。
表 3 实时荧光定量PCR引物信息Table 3 The primer sequences for qPCR
| Primer name | CCDS IDs | Primer sequence (5'–3') | Size (bp) |
| RTQ-hKu70-F | 14 021 | GAAGAAGCAGAGGAAGAACAAGAAG | 116 |
| RTQ-hKu70-R | TACCATAGAACACCACAGCCAAG | ||
| RTQ-hLig4-F | 9 508 | TTCATAATGATGCTGCTGAGTTGC | 165 |
| RTQ-hLig4-R | CCTTCTCAATGTGCTCAATATCTGC | ||
| RTQ-hActb-F | 5 341 | TCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG | 176 |
| RTQ-hActb-R | GAAGGAAGGCTGGAAGAGTGC |
表选项
1.5 Cas13a、b系统的转染效率为了鉴定Cas13a、b系统的转染效率，将不同的Cas13a、b系统(包括Cas13质粒和U6-gRNA质粒)分别同mCherry2-C1质粒共转HEK293T细胞，质粒用量均为500 ng/孔，步骤与上述保持一致。待细胞转染48 h后，使用流式细胞术(BD accuri C6 plus)检测红光细胞比例，通道为FL3。红光细胞比例间接反映Cas13系统的转染效率。
1.6 Western blotting检测目的基因的蛋白水平将上述转染48 h的细胞用PBS清洗2遍后，使用碧云天的Western及IP细胞裂解液(#P0013)裂解细胞。将5×蛋白缓冲液加入裂解后的样品中并在100 ℃水中煮沸5–10 min。使用BCA法测定蛋白浓度便于SDS-PAGE上样。将蛋白总量为20 μg的蛋白样品上样至12%的SDS-PAGE凝胶孔中，70 V电泳30 min，90 V电泳1–2 h。使用iBlot 2 Gel Transfer Device系统(Invitrogen)将蛋白条带转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后，4 ℃过夜孵育1︰2 000 KU70 (Proteintech, #10723-1- AP)兔多克隆抗体或1︰2 000 LIG4 (Abcam，#ab193353)兔单克隆抗体和1︰2 000 β-Actin (Cell signaling，#4970S)兔单克隆抗体，TBST洗膜3次，TBS洗膜1次后，室温孵育山羊抗兔IgG 1–2 h，并按上述方法洗膜。将清洗好的膜浸湿并显色后置于UVP显色装置曝光拍照，随后用ImageJ 1.52a (National Institutes of Health，USA)软件进行灰度扫描分析[16-17]，将目的蛋白灰度值参照内参灰度值进行归一化处理3次。使用GraphPad Prism 8.0软件将归一化处理的数据作图。
1.7 统计分析基因mRNA表达、转染效率及蛋白扫描结果使用IBM SPSS Statistics 20进行单因素邓肯方差分析。结果用x±s表示。*和**分别表示P < 0.05和P < 0.01的显著性水平。
2 结果与分析2.1 Cas13a、b系统构建将合成的gRNA退火后与BpiⅠ酶切的线性化U6质粒进行连接。单克隆菌扩大培养后进行Sanger测序，测序结果(图 1)符合预期。
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| 图 1 Cas13a、b系统重构质粒测序 Fig. 1 Reconstituted plasmid sequencing of the Cas13 system using U6 primer. We only listed representative sequencing results. |
| 图选项 |
2.2 Cas13a、b系统对ku70和lig4基因mRNA水平的影响针对ku70和lig4基因，我们分别为Cas13a系统设计3对gRNA，Cas13b系统设计6对gRNA。将Cas13a、b系统共转染HEK293T细胞，48 h后荧光定量PCR显示，所有Cas13a、b系统的不同gRNA对ku70 mRNA的表达水平均呈现出显著下调的现象(P < 0.01)，其中Cas13a-g2对ku70的敲减效果可以达到56%，Cas13b-g5对ku70的敲减效果高达92% (图 2A)。另外，在对lig4基因的干扰上，仅有Cas13b-g2和g5展现出显著的敲减效果，分别达到70%和76%的敲减水平(图 2B)，其余如Cas13a-g3和Cas13b-g4则具有较大的RNA敲减趋势(P < 0.1)。
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| 图 2 Cas13a、b对ku70和lig4基因mRNA水平的影响(A: Cas13a、b系统对ku70基因mRNA水平的影响；B: Cas13a、b系统对lig4基因mRNA水平的影响) Fig. 2 Effect of Cas13a, b on mRNA levels of NHEJ repair factors. (A) Effect of Cas13a, b on mRNA levels of ku70. (B) Effect of Cas13a, b on mRNA levels of lig4. Control indicates no transfection of gRNA group. Data is shown as x±s, n=3 (one-way ANOVA). * and ** represent P < 0.05 and P < 0.01, respectively. |
| 图选项 |
2.3 Cas13a、b系统转染效率评估将共转Cas13系统和红光质粒mCherry2-C1的HEK293T细胞用PBS清洗2次，经胰酶消化并离心，PBS重悬后，使用流式细胞术检测红光细胞比例。如图 3所示，红色荧光细胞数约占总细胞数的65.7%–71.0%，即3对Cas13a的gRNA和6对Cas13b的gRNA转染效率无明显差异。
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| 图 3 Cas13a、b系统转染效率评估(A: mCherry红光校正Cas13a、b系统的流式细胞图；B: Cas13a、b系统干扰ku70的转染效率；C: Cas13a、b系统干扰lig4的转染效率) Fig. 3 Evaluation of transfection efficiency for Cas13a, b system. (A) Corrected flow cytometry with mCherry. (B) Transfection efficiency that Cas13a, b systems interfere ku70. (C) Transfection efficiency that Cas13a, b systems interfere lig4. Blank represents no transfection group. Control indicates no transfection of gRNA group. Data is shown as x±s, n=3 (one-way ANOVA). |
| 图选项 |
2.4 Cas13a、b系统对Ku70和Lig4蛋白水平的影响将Cas13a、b系统转染HEK293T细胞，48 h后裂解并变性，用于Western blotting实验。使用ImageJ软件分析，结果显示，Cas13a-g2、g3和Cas13b-g2、g4–g6均能将Ku70蛋白表达水平下调20%以上，其中Cas13a-g3和Cas13b-g2在各自系统中具有最大的下调能力，分别能够将Ku70蛋白表达下调至74%和68% (图 4A)。此外，除Cas13a-g2外其余gRNA均能使Lig4蛋白水平下调20%以上，其中Cas13a-g3和Cas13b-g4在各自系统中具有最大的下调能力，分别能够将Lig4蛋白水平下调至73%和53% (图 4B)。
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| 图 4 Cas13a、b对Ku70和Lig4蛋白水平的影响(A: Cas13a、b对Ku70蛋白水平的影响；B: Cas13a、b对Lig4蛋白水平的影响) Fig. 4 Effect of Cas13a, b on protein level of Ku70 and Lig 4. (A) Effect of Cas13a, b on protein level of Ku70. (B) Effect of Cas13a, b on protein level of Lig4. The histogram was expressed as the relative expression of the target protein/β-actin. Data was obtained by ImageJ software. NC and control indicate no transfection of gRNA group. |
| 图选项 |
3 讨论CRIPSPR/Cas13系统是一种新兴的有望替代RNA干扰的RNA编辑技术[8-9]。本研究使用CRISPR/Cas13a、b系统能够有效降低ku70和lig4的转录和蛋白表达水平，但不同的gRNA拥有不同的敲减效果。最近研究表明，哺乳动物细胞中，靶向RNA的低二级结构能够大大提高转录本的敲减效果[8]。由于Cas13系统不具备解旋酶活性，RNA的高级结构影响gRNA靶向能力，故而在gRNA设计时需要考虑RNA的可靶向性以及周围二级结构对RNA切割能力的影响[18]。人的Ku70和Lig4蛋白分别由xrcc6和lig4基因编码，根据Ensembl数据库显示，xrcc6基因存在8个转录本，其中6个能够翻译形成蛋白，lig4基因具有5个能够翻译成蛋白的转录本，这些差异的转录本主要是mRNA的前体或由于可变剪切造成的。基于Cas13蛋白的切割原理，本研究将荧光定量PCR引物设计在靶位点两端，以便检测RNA水平的变化，初步了解敲减事件的发生。由于多转录本具有相同的靶位点，可能影响目的蛋白的下调水平，因此我们建议设计gRNA时尽可能避免可变剪切带来的影响。另外，部分gRNA使得目的基因的转录水平和蛋白水平表达不一致。原因可能如下：1)基因的表达一般分为转录和翻译两个层面，尤其是真核生物的基因表达存在时间和位置的时空间隔。蛋白表达存在一定的滞后性，48 h可能不足以使得转录水平和翻译水平保持一致。而过久的转染时间会导致一定的细胞毒性问题。2)受可变剪切的影响[19]，可靶向RNA的种类大于1，使得靶向能力分散。另外，多转录本的存在影响基因表达调控，进而影响蛋白表达水平。3)蛋白调控过程是复杂的，DNA修复因子如Ku70、Lig4等存在交互网络，而这个调控网络尚未完全被人类了解。4) Cas13质粒大小约13 kb，基因的干扰表达受转染效率的影响较大。5) gRNA靶向特异性影响Cas13系统对mRNA的调控效率，特异性高、脱靶效率低的gRNA更容易富集在靶位点区域，具有更快、更强地干扰基因表达的能力。另外，ku70和lig4敲减效果的不同除了gRNA的影响外，Cas13系统不同亚型的切割活性也是影响敲减效果的因素之一。Konermann等发现在哺乳动物细胞中Cas13d具有比Cas13a、b更强烈、更可观的敲减效果[7]，这个现象可能是由于Cas13d拥有更小的蛋白分子量，能够更容易地转染或包装到细胞内，并对细胞的转录和翻译有着较低的负担所造成的。
与RNAi相比，尽管Cas13系统未能将转录水平敲减至1%以下，但其对蛋白的敲减已达到RNAi的水平[12]。另外，CRISPRi和NgAgoi也仅能敲减Ku70和Lig4约40%–60%的蛋白表达量[14-15]。这些结果证明Cas13a、b系统成功达到我们的预期，并具备巨大的潜在价值。目前，CRISPR/Cas13a、b系统对蛋白敲减效果有限，主要在于Cas蛋白分子量巨大，转染或病毒包装以及细胞内蛋白运转困难。因此，Rauch等基于人类蛋白特性设计并合成了CIRTS系统(CRISPR/Cas inspired RNA targeting system)[20]，整个系统仅有2.7 kb，克服了Cas13系统分子量大和免疫原性的限制。此外，Cas13系统除了靶向RNA，敲减目的RNA的作用外，还可用于RNA编辑，纠正由于基因突变所导致的疾病[9, 21]。它不改变基因组序列的特性让其具有可逆性，似乎在基因治疗等方面比CRISPR/Cas9系统更为安全。本研究使用CRISPR/Cas13a、b系统主要针对Ku70和Lig4蛋白，筛选出了具有显著敲减效果的gRNA。在不编辑基因组的条件下，为基因功能和调控研究提供一种可行方案。
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