杨颖, 厉舒祯, 范书伶, 杨婧, 李政, 张珩琳, 曲媛媛
大连理工大学 环境学院 工业生态与环境工程教育部重点实验室，辽宁 大连 116024
收稿日期：2019-09-19；接收日期：2020-01-13
基金项目：国家自然科学基金(No. 31970107)，哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室开放课题(No. QAK201943)资助

摘要：近年来，纳米硒凭借其良好的导电、光热以及抗癌等特性，在纳米技术、生物医学以及环境修复等诸多领域得到广泛应用。实验选择前期筛选得到的贪铜杆菌Cupriavidus sp. SHE，文中探究了该菌株的细胞上清液、全细胞以及胞内提取物合成纳米硒的能力，并对细胞上清液合成的纳米硒进行形貌表征与官能团分析，最后选取革兰氏阳性菌假单胞菌Pseudomonas sp. PI1和革兰氏阴性菌大肠杆菌Escherichia coli BL21进行抗菌实验。结果表明，菌株Cupriavidus sp. SHE的细胞上清液、全细胞以及胞内提取物均具有合成纳米硒的能力。对于菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液而言，在该实验中，研究范围内其合成纳米硒的最佳条件是SeO₂浓度为5 mmol/L，pH为7。透射电子显微镜结果表明合成的纳米硒颗粒主要为球形，平均直径为196 nm。X射线衍射结果表明合成的纳米硒晶体类型为六方形结构。傅立叶转换红外光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明纳米硒表面有小分子蛋白结合，可能参与了纳米硒的合成和稳定过程。此外，抗菌实验表明菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液合成的纳米硒颗粒对菌株E.coli BL21和Pseudomonas sp. PI1均无明显的抗菌活性。综上，该研究表明菌株Cupriavidus sp. SHE在细胞上清液中产生的蛋白类物质在其合成纳米硒的过程中发挥了重要作用，合成的生物纳米硒颗粒无毒且生物相容性良好，未来在生物医学等领域具有较好的应用潜力。
关键词：贪铜杆菌纳米硒抗菌活性绿色合成
Characteristics of selenium nanoparticles synthesized by cell-free supernatant Cupriavidus sp. SHE
Ying Yang, Shuzhen Li, Shuling Fan, Jing Yang, Zheng Li, Henglin Zhang, Yuanyuan Qu
Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering (Ministry of Education), School of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China
Received: September 19, 2019; Accepted: January 13, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31970107), the Open Project of State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology (No. QAK201943)
Corresponding author: Yuanyuan Qu. E-mail: qyy@dlut.edu.cn.

Abstract: In recent years, selenium nanoparticles (SeNPs) have been widely used in many fields such as nanotechnology, biomedicine and environmental remediation due to their good electrical conductivity, photothermal properties and anticancer properties. In this study, the cell-free supernatant, whole cell and the cell-free extracts of the strain Cupriavidus sp. SHE were used to synthesize SeNPs, and several methods were applied to analyze the crystal structure and surface functional groups of the nanoparticles. Finally, Pseudomonas sp. PI1 (G⁺) and Escherichia coli BL21 (G^-) were selected to investigate the antibacterial properties of SeNPs. Cell-free supernatant, whole cell and cell-free extracts of the strain could synthesize SeNPs. As for the cell-free supernatant, selenite concentration of 5 mmol/L and pH=7 were favorable for the synthesis of SeNPs. TEM images show that the average size of nanospheres synthesized by the supernatant was 196 nm. XRD analysis indicates the hexagonal crystals structure of SeNPs. FTIR and SDS-PAGE confirmed the proteins bound to the surfaces of SeNPs. SeNPs synthesized by cell-free supernatant showed no antimicrobial activities against Pseudomonas sp. PI1 and Escherichia coli BL21 (DE3). These results suggest that proteins played an important role in biotransformation of SeNPs in an eco-friendly process, and SeNPs synthesized in this study were non-toxic and biologically compatible, which might be applied in other fields in the future.
Keywords: Cupriavidus sp. SHEselenium nanoparticlesantibacterial propertiesgreen synthesis
目前，关于纳米硒在抗癌、抗氧化、抗菌等医学方面的相关应用已有不少报道。对于纳米硒的合成而言，生物法因成本低廉、无毒、环保等特点，引起了人们的广泛关注^[1]。在合成纳米硒的众多生物资源中，细菌是一种高效的绿色纳米合成工厂，大量文献报道不同种类的细菌能够合成尺寸与形态各异的纳米硒颗粒。例如，生枝动胶菌Zooglea ramigera和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis均可在体外合成尺寸均一、分散性良好的球形纳米硒颗粒^[2-3]。贪酮杆菌Cupriavidus metallidurans CH34可在细胞内将亚硒酸盐还原为单质纳米硒，且其胞内含有大量重金属抗性基因^[4]。然而，目前关于菌株胞外合成纳米硒的研究仍未见报道。与胞内合成纳米硒相比，胞外合成反应步骤简单、不需要繁琐的后续操作，如细胞破碎以及溶剂萃取分离产物等，具有更广泛的应用前景^[5]。
此外，关于纳米硒在生物医学等方面的应用也有很多。Khiralla等研究发现用菌株嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia SeITE02合成的纳米硒颗粒对大肠杆菌具有良好的抗菌活性，也有文献表明该菌株无法合成具有良好抗菌活性的纳米硒颗粒，但其合成的纳米硒颗粒生物相容性较好^[6-7]。通常纳米硒颗粒的形貌不同对其性质会产生一定的影响。Urarika等通过分子设计和合成的方式成功合成出尺寸为300 nm的立方体结构的单质纳米硒颗粒，且通过实验证明该种形貌的纳米硒相较于球形颗粒而言对乳腺癌细胞具有更强的抗癌能力^[8]。而迄今为止，如何利用生物法定向合成特定形貌或尺寸的纳米硒颗粒仍是目前的研究难点，有待于进一步的研究发现。
本研究选择前期筛选的贪铜杆菌Cupriavidus sp. SHE，分别探究其细胞上清液、胞内提取物以及全细胞合成纳米硒的能力，并对细胞上清液合成的生物纳米硒颗粒进行形貌及尺寸表征分析。通过考察生物转化合成纳米硒过程中的关键蛋白，对生物纳米硒的合成机理进行初步探索。最后利用大肠杆菌Escherichia coli BL21和假单胞菌Pseudomonas sp. PI1考察合成的纳米硒颗粒的抗菌特性。
1 材料与方法1.1 菌株贪铜杆菌Cupriavidus sp. SHE分离自大连理工大学牛角山泥土样品，现已鉴定并保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No. 9266菌株Cupriavidus sp. SHE的16S rRNA基因序列储存于GenBank数据库，保存号为KJ875863。菌株Cupriavidus sp. SHE采用LB培养基，培养基的成分为：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L^[9]。
1.2 主要试剂二氧化硒(SeO₂)，购自天津市化学试剂研究所；氯化钠(NaCl)，购自天津市富宇精细化工有限公司；蛋白胨和酵母浸粉，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；菌株Escherichia coli BL21为实验室购买的工程菌，菌株Pseudomonas sp. PI1为实验室前期分离筛选得到。本实验所用试剂均为分析纯及以上。
1.3 利用菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液、全细胞和胞内提取物合成纳米硒从土壤中分离的菌株Cupriavidus sp. SHE于LB培养基中培养，培养条件为150 r/min、30 ℃、24 h。菌株达到对数生长期后，菌液在10 000 r/min下离心10 min (Avanti-30型，美国E Beckman公司)^[8]，用注射器将离心后的上清液透过0.45 μm的滤膜进行过滤，得到细胞上清液。离心后的菌细胞用超纯水冲洗3次，再利用超纯水将其OD₆₀₀调整为1.0得到菌株的全细胞溶液。将离心后得到的菌细胞用超纯水清洗3次后用一定量的超纯水重悬，然后利用超声破碎仪(超声波处理器CPX 750、美国)破碎30 min，将破碎后的体系在10 000 r/min条件下离心10 min，离心后得到的上清液用0.45 μm滤膜进行过滤，得到菌株Cupriavidus sp. SHE的胞内提取液。最后将上述3种反应体系分别与5 mmol/L SeO₂在30 ℃、150 r/min条件下反应，合成纳米硒颗粒。
1.4 纳米硒的表征首先通过溶液颜色变化直接观察纳米硒的生成，然后在400–800 nm波长范围内用紫外分光光度计(UV-vis，Metash UV-9000，中国)对反应体系进行测量，考察其纳米硒的合成情况。用透射电子显微镜(TEM，FEI Tecnai G2 Spirit，荷兰)对菌株Cupriavidus sp. SHE的细胞上清液合成的纳米硒颗粒的大小及形貌进行表征分析，用X射线衍射(XRD，Rigaku，日本)对菌株Cupriavidus sp. SHE的细胞上清液合成的纳米硒晶体结构进行表征分析，用傅立叶转换红外光谱(FTIR，IRPrestige-21，Japan)在400–4 000 cm^–1范围内对反应体系中可能参与纳米硒生物合成的物质的官能团进行表征分析。
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析生物合成的纳米硒为了研究可能参与纳米硒还原和稳定的蛋白，采用SDS-PAGE进行分析^[10]。将菌株Cupriavidus sp. SHE在10 000 r/min下离心30 min，收集合成的含有结合蛋白的纳米硒，然后用超纯水洗涤3次，再悬浮于超纯水中，最后利用SDS-PAGE对纳米硒表面附着的蛋白进行分析。
1.6 纳米硒的抗菌活性本实验采用纸片扩散法对纳米硒的抗菌活性进行初步的考察，实验选取革兰氏阳性菌Pseudomonas sp. PI1和革兰氏阴性菌E. coli BL21进行抗菌实验。首先在琼脂平板(MHA)上分别接种上述两种菌液200 μL (1.5×10⁸ CFU/mL)，用无菌棒涂匀。将滤纸剪成直径为10 mm的圆盘状，取25 μL纳米硒滴在剪好的滤纸上，然后用无菌钳把滤纸放在琼脂板上，以灭菌超纯水为对照。37 ℃培养24 h后，通过观察在纸片周围是否存在抑菌圈以及抑菌圈直径的大小来判断纳米硒颗粒对两株常见致病菌的抗菌性能。
2 结果与分析2.1 菌株Cupriavidus sp. SHE合成纳米硒的能力本实验利用菌株Cupriavidus sp. SHE的细胞上清液、胞内提取物和全细胞3个反应体系分别与SeO₂作用，合成纳米硒颗粒。反应数天后，3个反应体系中均可观察到体系颜色从无色逐渐变为橙红色，细胞上清液和胞内提取物体系在7 d内达到稳定，全细胞体系在10 d内达到稳定。使用UV-vis分析表明，如图 1所示，3个反应体系在600 nm处出现了明显的特征吸收峰，证明反应体系中有纳米硒的生成^[11]。用Bradford试剂盒测试蛋白质浓度显示，细胞上清液中的蛋白浓度(25 mg/L)远低于胞内提取物(150 mg/L)，但实验现象却表明细胞上清液具有更强的纳米硒合成能力^[12]。因此，推测菌株Cupriavidus sp. SHE能分泌某些生物活性分子，例如谷胱甘肽(glutathione，GSH)等，能在胞外作为还原剂还原Se (Ⅳ)为单质纳米硒颗粒^[10]。有研究表明，α、β和γ变形菌门的菌株能够在胞外分泌较高浓度的谷胱甘肽参与亚硒酸的还原和纳米硒的生成^[13]。在本实验中，菌株Cupriavidus sp. SHE属于β变形菌门，在细胞上清液中可能存在大量的谷胱甘肽类物质，因此我们可以在未来实验中进行进一步的考察研究。

图 1 不同反应体系下菌株Cupriavidus sp. SHE (A)全细胞、(B)胞内提取物以及(C)细胞上清液合成纳米硒的UV-vis光谱图 Fig. 1 UV-vis spectra of SeNPs synthesized by (A) the cells, (B) cell extracts and (C) cell-free supernatant of strain SHE. The insets show the color of SeNPs before and after reaction. Reaction condition: pH 7, 5 mmol/L SeO2.

图选项

随后考察不同SeO₂浓度及不同溶液pH对菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液合成纳米硒的影响。SeO₂浓度对生物合成纳米硒的影响如图 2A所示。当SeO₂浓度在1–5 mmol/L时，随着SeO₂浓度的增大，其在UV-vis图中的特征吸收峰峰值逐渐增加，但当SeO₂浓度进一步增大至7 mmol/L及以上时，其特征吸收峰峰值明显下降。相关文献表明反应体系中纳米硒的浓度与其在UV-vis中的特征吸收峰峰值呈正相关关系^[12]，因此菌株Cupriavidus sp. SHE的细胞上清液合成纳米硒的最佳SeO₂浓度为5 mmol/L。由于反应体系pH值的不同会影响到细胞提取物中酶的活性，进而会对纳米硒的合成造成一定的影响，因此本实验设置了6个不同的pH梯度，分别考察了细胞上清液在酸性、中性以及碱性条件下合成纳米硒的情况。其UV-vis结果如图 2B所示。结果表明，当反应体系pH值为5和10时，UV-vis图中没有出现明显的特征吸收峰，表明此时反应体系中没有纳米硒的产生，当反应体系pH为7时，其特征吸收峰值达到最大，因此，pH为7是菌株Cupriavidus sp. SHE上清液合成纳米硒的最佳条件。

图 2 不同SeO2浓度(A)以及pH (B)条件下菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液合成纳米硒的UV-vis图 Fig. 2 Uv-vis diagram of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE SHE with cell supernatant under different SeO2 concentration (A) and pH (B) conditions.

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2.2 生物合成纳米硒的表征我们采用TEM观察菌株Cupriavidus sp. SHE上清液合成的纳米硒颗粒的形貌和尺寸分布，如图 3所示。生物合成的纳米硒颗粒主要为球形，少数为棒状，且具有良好的分散性。进一步利用粒径分析软件Nano Measurer 1.2对合成的纳米硒颗粒粒径进行分析。结果发现合成的纳米硒尺寸粒径分布在83–480 nm范围内，平均粒径为196 nm。有研究表明菌株嗜碱假单胞菌Pseudomonas alcaliphila和菌株Zooglea ramigera合成的纳米硒颗粒的形貌在一定环境因素作用下会发生改变，转化为棒状颗粒^[2]。推测可能是因为大尺寸球形纳米硒颗粒的自由能远高于三角形或棒状纳米硒颗粒而导致自身结构不稳定，所以球形纳米硒颗粒在反应体系中能自发溶解形成小尺寸的硒原子，而较小尺寸的硒原子可再次组装形成一定尺寸的棒状纳米硒颗粒，降低了自身的自由能提高了稳定性^[2]。

图 3 菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液合成纳米硒的TEM图 Fig. 3 TEM images of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE with cell supernatant. (A) Spherical SeNPs. (B) Rod-like SeNPs. (C) Size distribution diagram.

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对合成的纳米硒颗粒进行XRD表征分析，结果如图 4所示。与纳米硒颗粒的六方型标准卡(JCPDS No. 06-0362)对比可知，2θ在23.74°、30.50°、42.16°、44.32°、46.81°、52.84°以及62.30°处出现7个明显的衍射峰，分别与六方晶型结构的(100)、(101)、(110)、(102)、(111)、(201)、(202)晶面相对应^[9]，并且(101)面的衍射峰强度明显高于其他峰，由此可说明合成的纳米硒晶体颗粒以(101)面为主导。

图 4 菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液合成纳米硒的XRD图 Fig. 4 XRD image of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE.

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为了对生物合成纳米硒的机制进行初步的探索，我们对合成的纳米硒颗粒进行FTIR表征分析，结果如图 5所示。其中，3 430、1 454和1 050 cm^?1处的特征吸收峰分别对应-N-H、-COO和C-N的拉伸振动峰，1 652、1 542和1 245 cm^?1处的特征吸收峰对应氨基Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的特征吸收峰^[14-15]，表明一些蛋白质可能参与了纳米硒的合成或稳定过程。例如，有研究表明陶厄式菌Thauera selenatis能在胞外分泌一种蛋白Sefa，该蛋白是一种良好的封端剂，能有效防止合成的纳米硒颗粒相互聚集^[16]。同样地，用生枝动胶菌Z. ramigera和大肠杆菌E. coli合成的纳米硒颗粒表面也可能存在着一些蛋白类物质，对纳米硒的合成和稳定过程起着重要的作用^{[2, 17]}。综上，我们推测在生物合成的纳米硒表面通常会覆盖一层蛋白类物质，它们的存在能促进纳米硒的还原也防止了小尺寸纳米硒颗粒的聚集，从而使合成的纳米硒颗粒尺寸更为均一，分散性更为良好。

图 5 菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液及其合成的纳米硒的FTIR图 Fig. 5 FTIR image of the cell-free supernatant of strain SHE and the biogenic SeNPs.

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SDS-PAGE分析表明(图 6)，在凝胶上出现多条不同大小分子量的条带，且随着样品体积量的增加，条带的颜色加深，由此可说明在合成的纳米硒颗粒的表面附着了一层蛋白质物质。Malhotra等发现某些小分子蛋白可以较为容易地通过质膜排到培养基上清液中，与金属离子反应生成纳米颗粒^[18]。因此，我们推测在SDS-PAGE中分离的蛋白质物质也在纳米硒的合成和稳定过程中起到了重要的作用。

图 6 SeNPs表面蛋白的SDS-PAGE分析 Fig. 6 SDS-PAGE analysis of proteins bound to biosynthesized SeNPs. Lane M: standard protein molecular weight marker; lane 1: 5 μL bound proteins; lane 2: 10 μL bound proteins.

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2.3 纳米硒的抗菌活性最后，我们利用菌株Pseudomonas sp. PI1和E. coli BL21对本实验中合成的纳米硒颗粒的抗菌性进行考察，如图 7所示，当纳米硒浓度为0.5–50 mg/mL时，平板中的小纸片周围均未发现明显的抑菌圈，由此可说明用菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液合成的纳米硒颗粒生物相容性较好。已有研究证实，用嗜麦芽窄食单胞菌S. maltophilia SeITE02和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的无细胞上清合成的纳米硒颗粒对菌株E. coli具有较为明显的抗菌活性^{[6, 19]}。然而，在考察菌株荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens和枝孢菌Cladosporium sp. JAPSK3合成的纳米硒颗粒的抗菌性时，得到的结果却截然不同^[7]。利用酸奶中的益生菌产生的纳米硒已被证实是一种无毒、安全的食品添加剂^[20]。目前有研究人员提出纳米硒的抗菌性大小可能与纳米硒的浓度以及颗粒大小有关，此外，纳米硒颗粒的形貌以及其元素组成也会对其诸多物理化学性质产生影响^{[6, 19]}。综上，本研究利用菌株Cuprivadius sp. SHE细胞上清液获得的纳米硒无毒且生物相容性较好，因此该纳米硒颗粒在生物医学或食品工业领域具有潜在的应用前景。

图 7 生物合成的纳米硒对E. coli BL21 (A)和Pseudomonas sp. PI1 (B)的抗菌活性 Fig. 7 The antimicrobial activities of biosynthesized SeNPs against E. coli BL21 (A) and Pseudomonas sp. PI1 (B).

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3 结论本实验探究了菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液、胞内提取物以及全细胞合成纳米硒的能力，对其合成纳米硒颗粒的形貌进行表征，并通过分析纳米硒表面关键蛋白初探合成机理，最后对生物合成纳米硒的抗菌特性进行考察，实验结论如下：(1)在利用菌株Cupriavidus sp. SHE的细胞上清液、胞内提取物以及全细胞进行纳米硒合成过程中，通过UV-vis均发现在600 nm处出现明显的特征吸收峰，表明3个反应体系均具有生物合成纳米硒的能力。(2)菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液合成的纳米硒的形貌主要为球形，少数为棒状，且颗粒分散性良好，平均粒径为196 nm；XRD分析表明合成的纳米硒颗粒的晶体结构为六方形结构，并且以(101)面为主导。(3)本实验利用FTIR和SDS-PAGE表征对纳米硒生物合成的机理进行了初步分析，结果表明覆盖在纳米硒颗粒表面的某些小分子蛋白可能参与了纳米硒的合成及稳定过程，在后续实验中将引进基因组、转录组或蛋白组等组学技术对该过程中具体的分子机制或其中起关键作用的蛋白进行进一步的揭示。(4)本实验表明菌株Cupriavidus sp. SHE细胞上清液胞外合成的纳米硒颗粒对E. coli BL21和Pseudomonas sp. PI1均无抗菌活性，说明菌株Cupriavidus sp. SHE合成的纳米硒颗粒无毒且生物相容性好。
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