, 邵吉民2 1. 浙江大学医学院 附属第二医院临床研究中心，浙江 杭州 310009;
2. 浙江大学医学院 病理学与病理生理学系，浙江 杭州 310058
收稿日期：2019-09-06；接收日期：2019-11-01；网络出版时间：2019-12-11
基金项目：国家自然科学基金(No. 81172516)资助
通讯作者：Jiang Cao. Tel: +86-571-87315201; E-mail: caoj@zju.edu.cn;
Jimin Shao. Tel: +86-571-88208209; E-mail: shaojimin@zju.edu.cn.
摘要：抑制性免疫检查点PD-1或CTLA-4靶向治疗药物已用于肿瘤的临床治疗，但单一靶点药物会有耐药发生，联合使用同时封闭多个靶点可提高疗效，因此拟构建一个可封闭多个靶点的新型重组蛋白。首先设计并合成了一个由人类PD-1和CTLA-4两个受体的胞外功能域组成并且C端带6×His标签的分泌型重组融合蛋白rPC编码序列，插入真核细胞表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1，稳定转染HEK293细胞，收集细胞培养上清，以亲和方法纯化重组蛋白rPC，通过实时荧光定量PCR检测多个人类肿瘤细胞系中PD-1配体PD-L1、PD-L2和CTLA-4配体CD80、CD86的表达，以选择相对高表达的细胞，利用细胞免疫荧光染色方法检验rPC与肿瘤细胞的结合能力，并用CCK-8法检测rPC是否对肿瘤细胞的生长有影响。结果表明，重组融合蛋白rPC可由稳定转染表达载体的HEK293细胞表达并分泌，纯化后的rPC可以与PD-1和CTLA-4配体表达相对较高的肺癌细胞NCI-H226结合，并且rPC处理对其生长并无直接影响，与预期一致。成功获得的重组融合蛋白rPC可用于进一步的体内外功能研究，也为今后研发新型多靶点肿瘤免疫治疗蛋白药物打下了坚实的基础。
关键词：重组融合蛋白PD-1CTLA-4免疫检查点
Construction, expression and purification of a mammalian secretory recombinant fusion protein rPC
Chunchun Li1, Yuqiong Xie1, Jiang Cao1
, Jimin Shao2 1. Clinical Research Center, the 2nd Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, Zhejiang, China;
2. Department of Pathology and Pathophysiology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310058, Zhejiang, China
Received: September 6, 2019; Accepted: November 1, 2019; Published: December 11, 2019
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81172516)
Abstract: Drugs targeting immune checkpoint are used for cancer treatment, but resistance to single drug may occur. Combination therapy blocking multiple checkpoints simultaneously can improve clinical outcome. Therefore, we designed a recombinant protein rPC to block multiple targets, which consists of extracellular domains of programmed cell death protein 1 (PD-1) and cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4). The coding sequence was inserted into expression vector and stably transfected into HEK293 cells. The culture supernatant was collected and rPC was affinity-purified. Real-time quantitative PCR was used to evaluate the expression levels of ligands for PD-1 and CTLA-4 in several human cancer cell lines. The binding of rPC with cancer cells was examined by immunofluorescence cell staining, the influence of rPC on cancer cell growth was assayed by CCK-8. The results showed that rPC could be expressed and secreted by stably transfected HEK293 cells, the purified rPC could bind to lung cancer NCI-H226 cells which have high levels of ligands for PD-1 and CTLA-4, no direct impact on cancer cell growth could be observed by rPC treatment. The recombinant protein rPC can be functionally assayed further for developing novel immunotherapeutic drugs for cancer.
Keywords: recombinant fusion proteinPD-1CTLA-4immune checkpoint
恶性肿瘤是危及人类生命的重大疾病，而免疫检查点异常是导致其发生和进展的重要因素之一。抑制性免疫检查点蛋白通过与各自配体结合而抑制免疫功能，肿瘤组织中两个抑制性免疫检查点程序性细胞死亡蛋白(Programmed cell death protein 1，PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4)是目前肿瘤治疗中的重要靶点，已有相应的抗体药物应用于临床，可以通过封闭并阻断相应受体-配体的结合而解除肿瘤组织的免疫抑制状态，发挥抗肿瘤作用[1-3]。但是由于肿瘤组织中通常有多种免疫检查点的异常，因此会对单一靶点的药物产生耐药，多靶点同时封闭可避免这一问题，提高疗效[4-5]。对靶点蛋白的封闭可以利用特异性抗原/抗体的竞争性结合，也可以利用特异性受体/配体的竞争性结合。对多靶点同时封闭可以通过基因工程手段构建双靶向重组抗体或由不同受体结合域组成的重组融合蛋白实现。
人体内除了在T细胞表面有PD-1和CTLA-4等免疫检查点受体蛋白表达外，还存在着相应的游离的可溶性受体，即sPD-1和sCTLA-4等，协调机体免疫调节[6-8]。因此我们采用特异性受体/配体竞争性结合策略，利用PD-1和CTLA-4的胞外功能域设计了一个全新的重组融合蛋白，可结合到表达PD-L1、PD-L2、CD80和CD86等任何一种PD-1或CTLA-4配体的细胞表面，从而封闭这些配体，使之无法与T细胞表面的PD-1或CTLA-4结合而抑制T细胞活性。在本工作中我们设计了一个含有人的PD-1和CTLA-4两个受体功能域的重组融合蛋白rPC (Recombinant PD-1-CTLA-4)编码序列，并成功获得了由哺乳动物细胞表达的重组融合受体蛋白，并对该蛋白的结合能力等作了初步鉴定。
1 材料与方法1.1 主要实验材料人胚肾细胞HEK293、人肺鳞癌细胞NCI-H226、人肺腺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HEPG2购自ATCC；人乳腺癌细胞Bcap-37、人胃腺癌细胞SGC7901购自上海中国科学院细胞库；人胃印戒细胞癌GCSR1-6由本课题组建系[9]；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京康为世纪生物有限公司；DNA marker 1 kb ladder plus购自广州东盛生物科技有限公司；RPMI1640培养液、DMEM高糖培养液购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司；LB培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性内切酶KpnⅠ、NotⅠ购自New England Biolabs公司；琼脂糖、RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；蛋白预染marker购自Thermo公司；考马斯亮蓝快速染色液购自碧云天生物技术公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate购自Merck Millipore公司；HRP标记的GAPDH抗体购自上海康成有限公司；HRP标记的6×His Tag抗体购自华安生物有限公司；DyLight650标记的6×His tag抗体购自Abcam公司；细胞核染料Hochest33342购自Sigma公司；转染试剂Attractene Transfection Reagent、亲和层析用Ni-NTA Agarose、切胶回收试剂盒Gel Extraction Kit均购自QIAGEN公司；细胞活性检测试剂Cell Counting Kit 8购自Dojindo公司；质粒提取试剂盒Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System、逆转录酶、dNTPs、RNA酶抑制剂、T4 DNA Ligase、荧光定量试剂盒GoTaq qPCR Master购自Promega公司。
1.2 重组融合蛋白rPC的设计与表达载体的构建包含有人PD-1和CTLA-4的重组融合蛋白rPC的设计如图 1所示，该重组蛋白N端为Gaussia荧光素酶的分泌型信号肽，PD-1和CTLA-4两个功能域之间由人IgG铰链区连接，C端为6×His标签。其中Gaussia荧光素酶信号肽序列为pSF-CMV-Puro-NH2-GAUS-Gaussia (Luciferase)分泌型质粒(Sigma-Aldrich，OGS1498)的nt 882–929，PD-1功能域序列为GenBank数据库中人PD-1 mRNA序列(NM_005018)的nt 117–566，CTLA-4功能域序列为GenBank数据库中人CTLA-4 mRNA序列(NM_001037631)的nt 278–694。人IgG的铰链区序列为GenBank数据库人免疫球蛋白重链恒定区mRNA序列(MG815646)的nt 298–366。该序列两端引入NotⅠ酶切位点，并在起始密码子前增加Kozak序列(GCCACC)。
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| 图 1 重组融合蛋白rPC设计示意图 Fig. 1 Illustration for the design of recombinant fusion protein rPC. |
| 图选项 |
上述重组融合蛋白编码核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的序列连接在pUC57的质粒载体上(pUC57-rPC)。用NotⅠ酶将rPC编码序列从pUC57-rPC上切下，用NotⅠ酶将pLVX-IRES-ZsGreen1载体酶切后用碱性磷酸酶处理以防自身环化，将二者切胶回收，16 ℃连接过夜，转化入大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取克隆，提取质粒，用NotⅠ酶切鉴定是否有片段插入，用KpnⅠ酶切进一步确定rPC编码序列插入方向，正向插入的质粒命名为pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC。
1.3 稳定表达rPC融合蛋白的HEK293细胞系的建立HEK293细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中。取生长状态良好的HEK293细胞，以5×105个接种于
1.4 Western blotting分析收集能稳定表达绿色荧光的细胞克隆，以未转染的HEK293细胞作为对照，用三去污裂解液(0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.15 mol/L NaCl，0.2 g/L叠氮钠，1 g/L SDS，100 mg/L苯甲基黄酰氟，1 mg/L抑肽酶，1 mL/L Nonidet P-40，5 g/L去氧胆酸钠)冰上裂解提取总蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒定量，取10 μg总蛋白热变性后进行10% SDS-PAGE检测，20 mA电泳1.5 h，250 mA转膜2 h，转膜后的PVDF膜用10%脱脂奶粉室温封闭30 min，用HRP标记的anti-6×His tag抗体以1:3 000的稀释浓度室温结合1 h，用TBST缓冲液洗膜3次后，加入化学发光底物显带。内参检测使用有HRP标记的GAPDH抗体(1:5 000)室温结合1 h，同样在TBST洗涤后，加入化学发光底物显带，鉴定rPC的表达并筛选出rPC表达量相对较高的稳定转染细胞克隆，并将此克隆命名为HEK293/rPC。
1.5 rPC融合蛋白的纯化HEK293/rPC细胞传代培养16–18 h后换液，将胎牛血清浓度由10%降至2.5%，培养72 h、收集培养上清。收集的培养上清经3 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清，真空冷冻干燥，少量无菌水重新溶解后以PBS作为缓冲液进行透析(截留分子量3 000 Da)后用于纯化。Ni-NTA琼脂糖凝胶悬液用结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0)平衡，将透析后的浓缩培养上清加NaCl至500 mmol/L，加咪唑至10 mmol/L，调pH值至8.0后与已平衡的Ni-NTA琼脂糖凝胶混匀，于4 ℃结合16–18 h。2 000 r/min离心1 min，弃上清，依次以洗涤缓冲液Ⅰ(50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)和洗涤缓冲液Ⅱ(50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑，pH 8.0)各洗2次，最后用洗脱液(50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱，得到纯化的蛋白溶液。使用Merck Millipore超滤离心管Amicon? Ultra-4 (4 mL/10 kDa，UFC801096)去除咪唑，并利用BCA试剂盒进行蛋白定量。纯化的rPC融合蛋白经10% SDS-PAGE检测，用考马斯亮蓝快速染色液染色，并用上述Western blotting方法鉴定。
1.6 实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞配体表达将NCI-H226、A549、Bcap-37、SGC7901、GCSR1-6细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，MCF-7、HepG2培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，待细胞生长汇合度达到80%–90%，分别收集细胞，利用Trizol试剂提取各细胞总RNA，使用美国Denovix公司的超微量核酸测定仪(DS-11)进行定量，各取2 μg RNA进行逆转录，体系为：0.4 mmol/L oligo(dT) 18，0.8 mmol/L dNTPs，200 U M-MLV逆转录酶，25 U RNA酶抑制剂，DEPC-H2O，总体积25 μL，42 ℃反应1 h。取2 μL上述逆转录反应产物进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为：2 μL cDNA，400 nmol/L各上下游引物，10 μL GoTaq qPCR Master Mix，用Nuclease-free water补至总体积20 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性2 min；扩增程序95 ℃，15 s，60 ℃，45 s，共40个循环。特异性上下游引物见表 1，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。对PD-L1、PD-L2、CD80、CD86进行实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参，根据各细胞的PD-L1、PD-L2、CD80、CD86的Ct值，再以2-ΔCt作为各基因的相对表达量(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)，挑选表达量相对较高的肿瘤细胞，进行细胞免疫荧光染色检测。
表 1 实时荧光定量PCR检测用引物序列Table 1 Primer sequences for real-time fluorescent quantitative PCR
| Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Size (bp) |
| PD-L1-for | ATGCCTTGGTGTAGCACTGAC | 21 |
| PD-L1-rev | GCTGGATTACGTCTCCTCCAAATG | 24 |
| PD-L2-for | CTGTGTGTTCTGGAATACTCACGTG | 25 |
| PD-L2-rev | ATGTGAAGCAGCCAAGTTGGATG | 23 |
| CD80-for | ACTCGCATCTACTGGCAAAAGGA | 23 |
| CD80-rev | ATGGGAGCAGGTTATCAGGAAAA | 23 |
| CD86-for | TGGTGCTGCTCCTCTGAAGATTC | 23 |
| CD86-rev | ATCATTCCTGTGGGCTTTTTGTG | 23 |
| GAPDH-for | CTTAGCACCCCTGGCCAAG | 19 |
| GAPDH-rev | GATGTTCTGGAGAGCCCCG | 19 |
表选项
1.7 重组融合蛋白rPC与肿瘤细胞的结合取6×104个生长状态良好的细胞接种于24孔板中，培养16–18 h。吸去培养液，以预冷的PBS清洗3次，每次5 min。用4%多聚甲醛固定NCI-H226细胞20 min，PBS清洗3次后，用5% BSA封闭1 h后，对照组加入5% BSA，实验组加入5 μg/mL用5% BSA稀释的rPC蛋白，4 ℃结合过夜，以PBS清洗3次，每次5 min，加入1:1 000稀释的以DyLight650标记的6×His tag抗体，室温避光结合2 h，以PBS清洗3次，每次5 min，最后用100 ng/mL的Hochest33342进行细胞核染色，染色后PBS清洗3次，每次5 min。倒置荧光显微镜下观察并拍照。以PBS代替rPC蛋白作为阴性对照。
1.8 重组融合蛋白rPC对NCI-H226细胞增殖的影响取生长状态良好的NCI-H226细胞，胰酶消化并计数，以8 000个/孔细胞接种于96孔板中，培养16–18 h，加入纯化的rPC蛋白至终浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0 μg/mL每个浓度5个复孔，继续培养72 h，吸去上清液，加入10 μL CCK-8，培养2 h后测OD450，分析融合蛋白对细胞生长的影响。
2 结果与分析2.1 pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC表达载体的鉴定将重组表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC用NotⅠ酶切和KpnⅠ酶切两种酶切方法进行鉴定。如图 2所示，用NotⅠ酶切得到大小约为1 030 bp和8 204 bp两条带，表明rPC片段已经插入pLVX-IRES-ZsGreen1载体中；用KpnⅠ酶切来确定片段插入的方向，正向插入可得到1 281 bp、1 567 bp和6 386 bp三个条带，表明目的基因片段rPC成功正向插入到pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC载体上。
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| 图 2 pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC质粒的酶切鉴定 Fig. 2 Characterization of plasmid pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC by restriction endonuclease digestion. M: 1 kb DNA ladder; 1: pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC digested by NotⅠ; 2: pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC digested by KpnⅠ. |
| 图选项 |
2.2 稳定表达rPC蛋白的HEK293/rPC细胞系的建立及鉴定提取转染pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC重组载体的HEK293细胞克隆和未转染的HEK293细胞总蛋白，利用Western blotting检测rPC表达水平，结果见图 3。由图中可以看出，所有细胞克隆均表达rPC蛋白，将表达较高的H克隆定为HEK293/rPC，进行后续实验。图 4为荧光显微镜下观察该细胞克隆中绿荧光蛋白的表达情况。
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| 图 3 Western blotting检测rPC的表达 Fig. 3 Detection of rPC expression by Western blotting. M: protein molecular weight standard; A–H: different clones of pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC transfected HEK293 cells; Ctrl: non-transfected HEK293 as negative control. |
| 图选项 |
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| 图 4 荧光显微镜下观察HEK293/rPC细胞中绿荧光蛋白的表达 Fig. 4 Expression of green fluorescent protein in HEK293/rPC cells observed under fluorescent microscope. (A) Bright-field observation. (B) Fluorescence observation. |
| 图选项 |
2.3 重组融合蛋白rPC的纯化及鉴定HEK293/rPC H克隆培养液上清中rPC蛋白经纯化定量后，进行10% SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝快速染色结果见图 5A。由图中可见，纯化前的培养液上清中的目的蛋白含量很少，主要为培养液中的牛血清白蛋白之类的其他蛋白成分，亲和纯化后的样品经考马斯亮蓝染色显示为单一条带。纯化后的样品经Western blotting鉴定也仅显示一条特异性条带，表明纯化成功(图 5B)。
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| 图 5 重组融合蛋白rPC的纯化与鉴定 Fig. 5 Purification and characterization of recombinant fusion protein rPC. (A) 10% SDS-PAGE followed by Coomassie Brilliant Blue staining. M: protein molecular weight standard; 1: purified rPC; 2: crude sample. (B) Western blotting for rPC. M: protein molecular weight standard; 1: purified rPC. |
| 图选项 |
2.4 rPC与肿瘤细胞结合为了验证上述重组融合蛋白rPC是否可以有效地与细胞表面的相应配体结合，我们先对一些肿瘤细胞中的配体表达情况进行了检测。对NCI-H226、A549、Bcap-37、MCF-7、HepG2、SGC7901、GCSR1-6细胞提取总RNA后，利用实时荧光定量PCR检测了PD-1配体PD-L1和PD-L2、CTLA-4的配体CD80、CD86以及内参GAPDH的表达。上述肿瘤细胞各种配体基因相对表达量见图 6，其中CD80的表达在各细胞中基本上都较少，NCI-H226细胞的PD-L1、PD-L2、CD86三个配体基因表达比其余肿瘤细胞的表达量均高一些，因此我们选择了NCI-H226细胞，利用细胞免疫荧光技术，检测重组融合蛋白rPC与肿瘤细胞的结合能力。从图 7的结果可以看出，在相同曝光时间下，对照组NCI-H226细胞没有显示出荧光信号，而以纯化的rPC结合的NCI-H226细胞可以在荧光显微镜下看到红色荧光，说明rPC蛋白可以与NCI-H226细胞有效地特异性结合。
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| 图 6 肿瘤细胞中PD-L1、PD-L2、CD80和CD86的相对表达量 Fig. 6 Relative expression level of PD-L1, PD-L2, CD80 and CD86 in cancer cells. |
| 图选项 |
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| 图 7 重组融合蛋白rPC与NCI-H226细胞的结合实验 Fig. 7 Binding assay of recombinant fusion protein rPC with NCI-H226 cells. |
| 图选项 |
2.5 融合蛋白对肿瘤细胞增殖的影响图 8为CCK-8法检测不同浓度的重组融合蛋白rPC对NCI-H226细胞生长的影响。从图中可看出，重组蛋白rPC对NCI-H226生长没有明显的直接促进或抑制作用。
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| 图 8 rPC对NCI-H226细胞生长的影响 Fig. 8 Effect of rPC on the growth of NCI-H226 cells. |
| 图选项 |
3 讨论免疫逃避是导致肿瘤发生发展的一个重要原因，而免疫检查点的异常则是免疫逃避的机制之一。肿瘤细胞会通过T细胞PD-1、CTLA4等抑制性免疫检查点相关通路来逃避免疫系统，以抗体阻断这些通路可对恶性肿瘤起到治疗作用[10-11]。目前针对免疫检查点PD1/PD-L1和CTLA-4的药物已用于临床[12-15]，但是也存在着应答率低和耐药的问题，而肿瘤组织中多个免疫检查点异常是导致这些问题的重要原因之一，采用多个单一靶点药物联合使用可以提高疗效[4, 16]，而研发多靶点药物将能够同时封闭多个免疫检查点，更好地解除T细胞的抑制，发挥更强的抗肿瘤效应。已有报道显示一种重组PD-1蛋白具有很好的免疫调节作用[17]。因此，本研究设计了重组融合蛋白rPC，含有PD-1和CTLA-4两个检查点蛋白的胞外功能域，不仅能与PD-1的配体PD-L1和PD-L2结合，而且也能与CTLA-4的配体B7-1和B7-2结合，因此能够同时封闭并阻断肿瘤细胞表面和抗原递呈细胞表面的PD-LI、PD-L2、B7-1和B7-2等配体对T细胞表面的PD-1和CTLA-4的结合，发挥双靶点解除免疫抑制的作用，体现出比单一靶点药物更好的疗效。
由于哺乳动物细胞有能够使蛋白质正确折叠所必需的各种分子伴侣以及辅助因子和翻译后修饰，保证蛋白质的结构和功能，在表达外源蛋白时相对原核细胞有一定的优势，因此目前重组抗体药物均使用哺乳动物细胞表达系统进行生产。中国仓鼠卵巢(CHO)和人胚肾(HEK 293)细胞是常用于生产重组蛋白的哺乳动物细胞。HEK 293细胞具有转染效率高、易于培养的特点[18]，因此我们在工作中选择了HEK293作为表达系统开展研究。
我们在序列的设计方面，在起始密码子前加上Kozak序列有助于真核细胞中的翻译；在N端使用的Gaussia荧光素酶信号肽为相对效率较高的分泌型信号肽[19-20]；PD-1和CTLA-4功能域之间采用天然的IgG重链的铰链区来连接，可以使得两个功能域更好地独立发挥作用而减少相互干扰；6×His序列为相对较小的标签，对重组蛋白的功能影响不大，而且有助于检测和分离纯化。
在成功获得稳定表达重组融合蛋白rPC的细胞克隆后我们进行了rPC的分离纯化。由于rPC是分泌到培养液中的，因此我们在细胞培养中采用2.5%的低血清浓度，一方面可以使细胞生长不会因为生长过快频繁传代导致上清中的rPC积累过少，另一方面也可以尽量减少血清中各种蛋白浓度过高对后续纯化的干扰(从图 5A可以看出，即使采用了低血清浓度培养，培养上清中主要的蛋白质还是高丰度的白蛋白)。根据一级结构计算得到的重组融合蛋白rPC的理论分子量应为37.8 kDa，但我们在实验中发现rPC的表观分子量大于理论分子量，表明rPC重组融合蛋白可能在翻译后有一定的修饰，因为PD-1和CTLA-4两个功能域均为胞外段，可能发生不同程度的糖基化[21]。
PD-1的配体PD-L1、PD-L2可表达于肿瘤细胞，而CTLA-4的配体CD80、CD86较多表达在抗原递呈细胞，但肿瘤细胞也会有少量表达。为了验证rPC是否具有与相应配体结合的生物活性，我们挑选了PD-L1和PD-L2都有较高表达且CD80和CD86也有一定表达的人肺癌NCI-H226细胞进行了结合实验，结果表明我们得到的rPC纯化蛋白可以有效地与该细胞结合，具有生物活性。另外，我们还用细胞增殖实验排除了rPC对肿瘤细胞生长具有促进作用的风险。
为了实验方便本研究中我们采用的是C端6×His Tag标签，证明了由PD-1和CTLA-4相应功能域拼合的重组融合蛋白rPC具有结合表达相应受体的肿瘤细胞的能力。后续工作我们将考虑改用人免疫球蛋白的Fc结构域，Fc结构域的应用一方面能够使得融合蛋白在体内有较好的稳定性，另一方面还可以研究由不同受体结合域组成的融合蛋白是否能和抗体一样发挥一定的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，在对相应配体的靶点进行封闭的同时还可以对肿瘤细胞或抑制性T细胞进行杀伤(除了封闭靶点作用，临床上CTLA-4抗体的治疗作用更多的是以这一方式体现[22-23])。
本研究已经成功得到一种新型重组融合蛋白rPC蛋白，并证实其能与肿瘤细胞结合，但不刺激肿瘤细胞生长，为进一步研究该蛋白体内外各种功能以及作为一种新型蛋白药物研发打下了基础，并将为今后利用重组融合受体靶向肿瘤免疫检查点这一思路进行肿瘤治疗的尝试提供经验。后续我们将采用各种方法和手段，对rPC与相应配体分子(PD-L1/PD-L2和C80/CD86)的直接结合作用、rPC对T细胞的体外杀伤肿瘤细胞的作用、体内抑瘤作用以及相应的机制进行验证和深入研究，为今后尝试利用重组融合蛋白靶向多个肿瘤免疫检查点这一策略进行肿瘤治疗提供参考。
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