李火明, 夏颖, 李干武
, 蔡文通 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 兽医生物技术国家重点实验室, 黑龙江 哈尔滨 150069
收稿日期：2020-09-20；修回日期：2021-01-14；网络出版日期：2021-03-12
基金项目：国家自然科学基金（31902242）；国家重点研发计划（2018YFD0500500）
*通信作者：李干武, Tel/Fax: +86-451-51051728;E-mail: liganwu@caas.cn;
蔡文通, Tel/Fax: +86-451-51051728;E-mail: caiwentong@caas.cn.
摘要：[目的] 多方面鉴定尿路致病性大肠杆菌中的Ⅰ型限制-修饰（restriction-modification，RM）系统C5423-5425，并揭示其功能与生理意义。[方法] 利用Lambda Red重组系统构建CFT073 DNA甲基化转移酶基因缺失株Δc5424；利用单分子实时测序分析以获得C5424甲基化修饰的位点与基序；利用转化效率试验说明RM系统抵御外源DNA的转化；利用转录组测序和荧光定量RT-PCR鉴定C5424的调控基因；利用软琼脂平板运动试验等方法研究细菌生理功能的变化。[结果] 用生物信息学方法鉴定了一个Ⅰ型RM系统；获得了c5424的突变株；鉴定了C5424修饰的靶序列GmAGNNNNNNNGTCA/TGmAC NNNNNNNCTC，并揭示了靶序列在基因组中的分布；C5424系统可以抵御外源DNA的进入；c5424的缺失显著影响17个基因的表达，包括运动相关基因motB和抗活性氯基因rclR等；c5424的缺失显著影响CFT073的运动能力和抗次氯酸的能力。[结论] 本文从多方面鉴定了尿路致病性大肠杆菌CFT073中的I型RM系统C5423-5425，这个系统对细菌具有重要的生理意义。本文对研究细菌的表观遗传学具有参考价值。
关键词：尿路致病性大肠杆菌DNA甲基化转移酶单分子实时测序限制-修饰系统
Characterization of a type Ⅰ restriction-modification system C5423-5425 in uropathogenic Escherichia coli
Huoming Li, Ying Xia, Ganwu Li
, Wentong Cai State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, Heilongjiang Province, China
Received: 20 September 2020; Revised: 14 January 2021; Published online: 12 March 2021
*Corresponding author: Ganwu Li, Tel/Fax: +86-451-51051728;E-mail: liganwu@caas.cn;
Wentong Cai, Tel/Fax: +86-451-51051728;E-mail: caiwentong@caas.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31902242) and by the National Key Research and Development Project (2018YFD0500500)
Abstract: [Objective] To characterize a type I restriction-modification (RM) system C5423-5425 in uropathogenic Escherichia coli CFT073 and to determine its function and physiological significance. [Methods] Lambda Red recombination system was used to construct methyltransferase gene deletion mutant Δc5424 in CFT073. The modification sites and recognition motif of C5424 methyltransferase were obtained by single molecule real-time sequencing analysis. A transformation efficiency assay was used to test that the RM system C5423-5425 can block transformation of exogenous DNA. Genes regulated by C5424 were identified by transcriptome sequencing and real-time quantitative PCR. The physiological function of c5424 was studied by soft agar plate motility assay. [Results] A type I RM system was identified by bioinformatics methods. A c5424 deletion mutant was constructed. We found that the C5424 recognition motif was GmAGNNNNNNNGTCA/TGmACNNNNNNNCTC, and its distribution in the genome was presented. C5424 contributed to reducing transformation of foreign DNA. Deletion of c5424 significantly affected the expression of 17 genes, including motB and rclR. Lacking c5424 significantly affected bacterial motility and the resistance to hypochlorous acid in CFT073. [Conclusion] In this paper, the type I RM system C5423-5425 was characterized in detail, and it is physiologically important for uropathogenic E. coli CFT073. Thus, our data provided valuable information for bacterial epigenetics studies.
Keywords: uropathogenic Escherichia coliDNA methyltransferasesingle molecule real-time sequencingrestriction-modification system
在细菌中，限制-修饰(restriction-modification，RM)系统是普遍存在的，常被认为是细菌最原始的免疫系统，用来抵御外来的DNA，尤其是噬菌体[1-2]。它们通常由两部分组成：核酸内切酶，负责位点特异性的DNA切割；甲基化转移酶，可以甲基化DNA，其修饰时的识别位点通常与内切酶切割的识别位点一致。根据亚基组成、识别靶序列特征、切割位点特征和辅因子需求等，RM系统被划分为Ⅰ (如EcoKⅠ)、Ⅱ (如EcoR I)、Ⅲ (如EcoP15Ⅰ)和Ⅳ (如Mcr和Mrr) 4个不同的类型[3]。Ⅰ型RM系统通常由HsdS (S亚基)、HsdM (M亚基)、HsdR (R亚基) 3个亚基组成，形成催化限制性内切和修饰的五聚体蛋白R2M2S[4]。其中，S亚基特异识别DNA序列，R亚基发挥限制性酶切的作用，M亚基催化甲基化转移[5]。三聚体M2S作为DNA甲基化转移酶可以独立存在。hsdR和hsdM基因高度保守，而hsdS则高度可变，导致特异性不同。Ⅰ型RM的识别序列包括两部分，通常被N5-8隔开，比如EcoKⅠ的识别序列为AmACNNNNNNGTGC/GCmACNNNNNNGTT (互为反向重复序列)，两部分中的腺嘌呤都会被甲基化。这种识别方式是因为S亚基含有2个靶位点识别结构域(TRD)。很多Ⅰ型系统含有重复的hsdS基因，2个hsdS可以通过反向重复序列发生翻转，导致甲基化特异性的变化，产生“相变”(phase variation)现象[6]。另外，在多种病原菌有报道发现Ⅰ型RM系统可以调控毒力基因的表达，进而影响毒力[7-8]。
尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)是导致尿路感染的主要病原细菌，感染后会导致肾盂肾炎、膀胱炎和尿道炎等疾病，严重影响人们的健康[9]。UPEC编码多种毒力因子，包括负责黏附和定殖的菌毛、负责侵袭和运动的鞭毛、负责调控宿主免疫反应的溶血素、负责摄取铁离子的摄铁蛋白等[9-10]。毒力调控使得病原菌能够适应宿主环境并适当地表达毒力因子以建立感染[11]。鉴于Ⅰ型RM系统的多样性和毒力调控作用，本文鉴定了UPEC CFT073菌株中的一个Ⅰ型RM系统c5423-c5424-c5425，为细菌的表观遗传学和UPEC病原学研究提供了重要参考。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒: UPEC CFT073，Lambda Red同源重组系统质粒pKD46、pKD3、pKD4、pCP20和pCJ112均由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器: LB固体和液体培养基均购自北京博润莱特科技有限公司；所有的PCR试验试剂购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；总RNA提取试剂盒(Promega EastepTM Super Total RNA Extraction Kit)购自北京宝林科生物科技有限公司；细菌全基因组提取试剂盒购自哈尔滨牧乐生物试剂有限公司；氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)购自武汉盖云天生物技术有限公司。
1.2 细菌培养条件
1.2.1 静置培养: 将菌种接种到LB液体培养基中，置于恒温培养箱中37 ℃静置培养12 h，然后，1:100转接到新的LB液体培养基中，37 ℃静置培养6 h至菌液OD600≈1。
1.2.2 振荡培养: 直接挑取菌种划线到LB固体培养基上，恒温培养箱中37 ℃倒置培养12 h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养3 h至菌液OD600≈1。
1.3 引物设计与合成 根据GenBank上公布的UPEC CFT073的全基因序列，利用软件Clonemanager设计所有本研究中用到的特异性引物(表 1)。克隆带有目的基因(c5424)同源臂的替换引物MT54-F和MT54-R由两部分组成，引物的5′端前55 bp是和缺失目的基因(c5424)两侧同源的，后边3′端部分是以pKD4为模板克隆卡那霉素的基因特异性引物。荧光定量RT-PCR引物均使用网站(https://sg.idtdna.com/Primerquest/)设计。以上所有的引物均由吉林库美生物有限公司合成。
表 1. 本研究中用到的引物 Table 1. Primers used in this study
| Primers | Sequences (5?→3?) | Target genes |
| MT54-F | TGTGCCTTCTGCAACCATCATGTTGCAGAAGGCCTTGTTTTTCATGGAATACAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGA | |
| MT54-R | TGCAACGCCGAGGTCCAGGTTTCCATATGATCAACGATCAGCTTTTCCACACTCACATATGAATATCCTCCTTAG | |
| Check-F | TATGGTCAGCCGCCGTTAAC | |
| Check-R | ATTTCCGCAATTCTAGTTAGC | |
| Kan-R | CCTCGTCCTGCAGTTCATTC | |
| Kan-F | GCTTGCCGAATATCATGGTG | |
| 4cut-F | CGCGCCCGGTACCAGCATGCTGACAATTGCGCTCGAATTCTGGTACACCTGCTGTGTC | |
| 4cut-R | TAGCTGTTTCCTGTCAGTCATGACCTAGTTACTCTCTAGAAACCTGCCTTATCATCAAAG | |
| qRT-PCR | ||
| c0418-F | CCATCAGCCCACCCAATAAA | c0418 (forward) |
| c0418-R | AGCATGGCAAACGGCTAATA | c0418 (reverse) |
| c0421-F | CCACAAGGAACGATCGATAAGA | c0421 (forward) |
| c0421-R | AACGCATGCCAACGAATAAC | c0421 (reverse) |
| c2304-F | GAGGCTAATTCGGTTGGGAATA | c2304 (forward) |
| c2304-R | CAGAATCGCCCGATGTTTAGA | c2304 (reverse) |
| c5423-F | CTGCACCTGCCTTTGTTTAC | c5423 (forward) |
| c5423-R | CAAAGTGATGGAAGGCTGTATTG | c5423 (reverse) |
| c4327-F | AGGATACTGCAACTCGCTTAAT | c4327 (forward) |
| c4327-R | CGCGAAGAAGGTACGTCATATT | c4327 (reverse) |
| rpoB-F | GCATCATCCCTTACCGTGGTTC | rpoB (forward) |
| rpoB-R | GGATCTGCTCTGTGGTGTAGTTCA | rpoB (reverse) |
表选项
1.4 生物信息学分析 根据GenBank上发表的CFT073基因组序列，利用Rebase数据库(http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html)分析基因组中RM系统的分布信息，通过与大肠杆菌K12、UTI89、EC958和O157等菌株RM系统的分布相互比较分析，鉴定并阐述Ⅰ型RM系统在UPEC上的分布特征。
1.5 Illumina平台与单分子实时(SMRT)测序 采用静置培养的方式，待细菌生长至平台期，使用DNA提取试剂盒(TaKaRa)提取野生株CFT073和突变株Δc5424的全基因组，将样本保存在无RNA酶的ddH2O中。每个样本使用声裂法，将约100 ng的全基因组处理成小于500 bp的片段。使用末端修复酶对片段进行末端修复，选择修复好的片段回收。然后，每个样本使用P5和P7引物进行PCR扩增，PCR产物用Agilent 2100生物分析仪进行分析，并且使用Qubit 3.0荧光计进行定量。随后，将不同的DNA文库加载到Illumina HiSeq仪器上，测序采用2×150双端(PE)测序，使用HiSeq控制软件(HCS)+OLB+gapipine- 1.6 (Illumina)对HiSeq进行图像分析和碱基调用。
对于SMRT测序，剪切全基因组DNA约10 μg，然后选择10 kb的双链DNA片段，用通用发夹接头对DNA片段进行末端修复。根据要求准备文库，文库在PacBio Sequel仪器上进行测序，后续测序分析由苏州金唯智生物技术有限公司完成，数据已上传至国家微生物科学数据中心(NMDC10017678)。
1.6 基因缺失株的构建 采用Lambda Red同源重组[12]进行基因突变株的构建，首先利用MT54-F和MT54-R引物，以pKD4为模板克隆带有目的基因同源臂的Kan基因(KanR)片段，PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，片段保存在–20 ℃中。
将带有pKD46的CFT073菌种接种带有Amp抗性的LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养OD600达到0.2，加入1%的L-阿拉伯糖溶液，继续培养直到菌液OD600达到0.6–0.8。将菌液制备成电转化感受态细胞，电转化之前回收的带同源臂的片段，将转化好的菌液均匀涂布到带有Kan基因抗性的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养12 h，直到长出肉眼可见的单菌落，使用Check-F、Kan-R和Check-R、Kan-F鉴定目的基因缺失是否成功。筛选出带有抗性的Δc5424: : KanR阳性重组子，将其制成电转化感受态细胞，将pCP20质粒电转化到Δc5424: : KanR感受态细胞中，37 ℃培养去掉KanR和pCP20质粒，获得UPEC目的基因突变株Δc5424。
1.7 生长曲线测定 分别将野生株CFT073和突变株Δc5424接种到LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养过夜，然后使用新的LB培养基将菌液OD600稀释到0.05，之后将稀释好的菌液同时置于相同的条件下培养，每0.5 h测量一次菌液OD600值。汇总数据，绘制生长曲线，比较野生株CFT073和突变株Δc5424生长速度的差异。
1.8 转化效率试验 转化效率试验参考文献[8]：用带有识别基序的引物4cut-F/R扩增pdeH基因，用C112试剂盒将DNA片段克隆至pCJ112质粒，形成p4cut。制备各菌株的电转化感受态细胞，每管约含有5×109个细胞。通过电转化(2.5 kV)将0.3 μg质粒转入野生株和突变株感受态细胞中，将转化后的菌液平均分为两部分，均匀涂布在Kan抗性和无抗性的LB平板上，37 ℃培养，统计长出的菌落数，转化效率%=KanR的转化子CFU/无抗性LB的CFU×100%。
1.9 转录组测序(RNA-seq) 采用静置培养的方式，将野生株CFT073和突变株Δc5424培养至OD600≈1，使用总RNA提取试剂盒提取总RNA进行转录组测序。转录组测序由金唯智生物技术有限公司完成，数据已上传至国家微生物科学数据中心(NMDC10017678)。
1.10 荧光定量RT-PCR(qRT-PCR) 静止培养野生株CFT073和突变株?c5424，提取总RNA，通过qRT-PCR验证转录组测序结果。以基因rpoB为内参基因，引物见表 1。
1.11 细菌运动性试验 细菌运动性试验[13]，采用静置培养的方式，将野生株CFT073、突变株Δc5424培养至菌液OD600≈1，用无菌牙签蘸取菌液垂直插进LB半固体培养基中，但是不要触及底部，37 ℃静置培养12 h，测量细菌菌落生长浑浊区域的直径大小，所有试验重复3次测量，计算浑浊区域的直径平均值并进行统计。
1.12 细菌抗氧化试验 细菌抗氧化试验[14-16]，采用静置培养的方式，细菌过夜培养，1:100转接到新的LB培养基中，同样的条件下，培养细菌至OD600≈0.4–0.6。取1 mL菌液，4 ℃、5000 r/min离心10 min，收集菌体，使用预冷的PBS缓冲液清洗菌体2次，使用等体积的PBS重悬菌体，然后1:5稀释菌体至OD600=0.1。于96孔板中，100 μL菌液和100 μL
2倍预期浓度(200 μmol/L)次氯酸溶液混合(迅速取样后终止反应，涂板计数，此数据为0 min)，37 ℃避光培养20 min，加入终浓度9 mmol/L的甲硫氨酸溶液终止反应，最后使用PBS溶液稀释涂板，计数。存活率计算公式为：存活率=(CFU20 min/ CFU0 min )×100%。
2 结果和分析 2.1 生物信息学分析鉴定CFT073中的Ⅰ型RM系统 基于RM系统中DNA甲基化转移酶保守的酶活位点(DPPY和FxGxG)和基因构成预测到UPEC CFT073包含有一个新的Ⅰ型RM系统(c5423-c5424-c5425)，分别编码特异性识别蛋白(HsdS)、甲基化转移酶(HsdM)和核酸内切酶(HsdR)(图 1-A)。对c5424进行BLASTp分析发现：在非致病性大肠杆菌MG1655菌株中，不存在c5424的直系同源蛋白；在某些UPEC和EHEC菌株中存在c5424的直系同源蛋白。值得一提的是，虽然在MG1655和UPEC膀胱炎分离株UTI89中不存在c5424的直系同源蛋白，但是在染色体的相同位置，存在另外一套Ⅰ型RM系统，由3个基因构成，分别为UTI89_C5050、UTI89_C5051和UTI89_C5053 (图 1-B)。
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| 图 1 c5423-c5425基因位置信息与同源比较 Figure 1 Genetic organization and sequence comparison of c5423-c5425 genes. A: genetic organization of the type I RM system genes in UPEC CFT073 genome; B: sequence comparison of the RM systems and their adjacent genes between the UPEC CFT073 and UTI89 strains. The grey scale indicates the homology between two DNA molecules. |
| 图选项 |
2.2 c5424基因缺失株构建及生长特性测定 利用Lambda Red重组系统进行缺失株构建，获得带有Kan抗性的c5424的缺失株Δc5424: : kanR。进一步利用带有翻转重组酶的pCP20质粒，去掉Kan抗性基因，最终获得Δc5424菌株。
通过测定野生株CFT073和突变株Δc5424在LB液体培养基中的生长情况，绘制生长曲线，由图 2可知，c5424基因对菌株生长无明显影响。
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| 图 2 c5424基因缺失株的生长曲线 Figure 2 Growth curve of the Δc5424 mutant. |
| 图选项 |
2.3 DNA甲基化转移酶c5424修饰基序的鉴定 为了鉴定C5424甲基化修饰的基序，使用SMRT单分子实时测序对野生株CFT073及c5424缺失株进行全基因组测序，同时利用Illumina Hiseq进行序列校准。根据碱基的IPD值，通过SMRTlink软件分析，确定碱基的修饰类型。分析结果表明野生株中共测到3种m6A的甲基化基序，而c5424突变株中仅有2种基序(表 2)，表明C5424负责GmAGNNNNNNNGTCA基序的甲基化。更进一步，我们对427个基序作了定位，按照正义链/反义链、基因编码区/基因间区等参数进行排布，以展示基序的位置规律(图 3)。比如，在3700–3800 kb的位置，基序倾向于分布在正义链上；在300–400 kb的位置，基序倾向于分布在基因间区，这种成簇的在基因间区的出现，可能参与直接调控。
表 2. 单分子实时测序分析CFT073和Δc5424的m6A甲基化结果 Table 2. The single molecule real time sequencing analysis of m6A methylation in CFT073 and Δ c5424
| MS | CP | MT | fraction | nD | nG | GT | MIR |
| Motif detected in WT | |||||||
| GATC | 2 | m6A | 0.998 | 41465 | 41538 | GATC | 5.71 |
| CACAG | 4 | m6A | 1 | 8010 | 8010 | CACAG | 5.97 |
| GAGNNNNNNNGTCA | 2 | m6A | 0.81 | 355 | 427 | GAGNNNNNNNGTCA/TGACNNNNNNNCTC | 4.49 |
| TGACNNNNNNNCTC | 3 | m6A | 0.791 | 341 | 427 | GAGNNNNNNNGTCA/TGACNNNNNNNCTC | 3.73 |
| Motif detected in mutant | |||||||
| GATC | 2 | m6A | 0.998 | 41465 | 41538 | GATC | 5.71 |
| CACAG | 4 | m6A | 1 | 8010 | 8010 | CACAG | 5.97 |
| MS (motif string): motif sequence; CP (center position): the location of modification base in motif; MT: modification type; fraction: percentage of detected modified motif relative to the amount of all motif sequences in the genome; nD (ndetected): number of modified motif sequences detected; nG (ngenome): number of motif sequences in the genome; GT (group tag): the presence of bipartite motif; MIR (mean Ipd ratio): the average value of IPD. | |||||||
表选项
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| 图 3 c5424修饰的基序在CFT073基因组中的分布 Figure 3 Distribution of C5424 modified motifs in the CFT073 genome. The five concentric circles represent (from outside to inside) genomic positions; ORF on the positive and negative strands; C5424 motifs on the positive and negative strands; C5424 motifs on the CDS regions and intergenic regions; GC content, peaks facing outside indicate higher GC content than the average genomic GC content, peaks facing inside indicate lower GC content than the average genomic GC content, the higher the peaks, the bigger the difference. |
| 图选项 |
2.4 RM系统对转化效率的影响 为了研究RM系统(C5423-5425)是否参与抵御外来DNA，我们首先构建了带有识别基序的质粒p4cut；将p4cut质粒通过电穿孔分别转化至野生株CFT073和突变株?c5424中，发现突变株能够得到更多的转化子(图 4-A)；与野生株比，转化效率提高约30倍(图 4-B)，说明RM系统(C5423-5425)参与抵御外来的DNA。作为对照，我们在野生株和lacZ基因突变株中同时转化p4cut质粒，转化效率无显著差别(结果未展示)。
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| 图 4 C5424对转化效率的影响 Figure 4 The effect of C5424 on plasmid transformation efficiency. A: a plate view of transformants after transformation of p4cut into the wild-type strain CFT073 and mutant strain ?c5424; B: transformation efficiency of plasmid p4cut in the wild-type strain CFT073 and mutant strain ?c5424. |
| 图选项 |
2.5 转录组测序分析 为了确定基因c5424调控的靶基因，我们比较了突变株Δc5424和野生株CFT073的基因表达谱，转录组测序数据表明c5424影响17个基因的表达(表 3)，随后，我们挑选了其中5个基因做了qRT-PCR验证，结果与转录组测序结果基本相符(图 5)。
表 3. 转录组测序分析得到突变株Δc5424中差异表达基因 Table 3. RNA-seq analysis revealed differentially expressed genes in the mutant ?c5424 compared to the wild-type strain
| Genes | Gene productsa | Log2(fold change)b (Δc5424 VS CFT073) |
| gene-c1234 | Conserved hypothetical protein | –2.57 |
| gene-c0418 | Hypothetical protein ykgB | –2.35 |
| gene-c3692 | Hypothetical protein | –2.02 |
| gene-c2304 | Chemotaxis motB protein | –1.82 |
| gene-c4327 | Transcriptional regulator gadX | –1.69 |
| gene-c1233 | Hypothetical protein | –1.57 |
| gene-c0421 | Hypothetical transcriptional regulator ykgD | –1.56 |
| gene-c4323 | Hypothetical protein yhiE | –1.53 |
| gene-c5426 | Conserved hypothetical protein | –1.44 |
| gene-c5423 | Putative restriction modification enzyme S subunit | –1.44 |
| gene-c3145 | Hypothetical protein ydfK | –1.38 |
| gene-c4326 | Hypothetical transcriptional regulator yhiW | –1.24 |
| gene-c5395 | Chaperone protein fimC precursor | –1.23 |
| gene-c1123 | Cold shock-like protein cspG | –1.21 |
| gene-c3184 | Cold shock-like protein cspB | –1.18 |
| gene-c2301 | Methyl-accepting chemotaxis protein II | –1.15 |
| gene-c3816 | 30S ribosomal protein S21 | 1.24 |
| a: according to GenBank annotation; b: values in this column represent the changes in the Δc5424 in comparison to the parental strain, CFT073. Transcriptome analysis was carried out with three biological replicates. | ||
表选项
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| 图 5 qRT-PCR验证部分转录组测序得到的差异表达基因 Figure 5 Validation of differentially expressed genes by qRT-PCR. Transcriptional levels were normalized to CFT073 rpoB; data are mean±SD from three biological replicates (n=3). *: P < 0.05; **: P < 0.01 (Student's t test). |
| 图选项 |
2.6 c5424影响细菌运动能力 C5424影响motB的表达大于2倍，而motB与细菌运动能力有关。为了研究c5424的缺失是否影响细菌运动能力，测量并比较LB半固体培养基上野生株CFT073与突变株Δc5424菌落浑浊区域大小。如图 6，野生株CFT073浑浊区域大小均数(1.5±0.3) cm，突变菌株Δc5424浑浊区域大小均值(0.9±0.2) cm，两者呈现显著性差异(P < 0.05)。因此，c5424对于维持细菌的运动能力很重要。
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| 图 6 野生株CFT073和Δc5424突变株在LB半固体培养基上的运动能力检测 Figure 6 Bacterial motility of E. coli CFT073 and Δc5424 in semi-solid agar. |
| 图选项 |
2.7 c5424促进细菌抵抗次氯酸杀伤 C5424调控基因c0421的表达；其编码的基因属于AraC家族转录调控因子[15]，与细菌抗次氯酸杀伤有关，为了说明c5424参与细菌抵抗次氯酸，比较野生株CFT073与突变株Δc5424被次氯酸杀伤后的存活能力。如图 7，未经过次氯酸处理的野生株和突变株，细菌数无显著差别；次氯酸处理后，野生株CFT073的存活率为0.0042%，突变株Δc5424存活率约为0.0006%，呈现明显下降趋势。表明c5424促进细菌抵抗次氯酸杀伤。
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| 图 7 野生株CFT073和Δc5424突变株抗次氯酸能力测定 Figure 7 Hypochlorous acid resistance assay of E. coli CFT073 and Δ c5424. |
| 图选项 |
3 讨论 依据致病部位、症状和毒力因子等，致病性大肠杆菌被分为多个致病型，如肠出血型、致脑膜炎型和尿路致病型。这种多样性一般被认为是由于大肠杆菌基因组的可塑性导致的，比如质粒、转座子和噬菌体等可移动元件极大地改变了大肠杆菌基因组的构成[17]。本研究关注的C5424系统在非致病性大肠杆菌中不存在，而只存在于部分UPEC和EHEC的菌株中，暗示其可能是通过基因水平转移获得的，其对某些菌株有特殊的作用。的确，我们发现C5424影响motB的表达以及运动性，motB是鞭毛运动蛋白复合体的主要组成成分；鞭毛是UPEC和EHEC中重要的粘附因子和侵入因子，尤其是，它被认为在UPEC从膀胱上行至肾脏感染的过程中发挥重要作用[18]。编码RclR的基因c0421在大肠杆菌抵抗活性氯的过程中发挥重要的作用。RclR是AraC族转录激活因子，其高度保守的半胱氨酸残基对活性氯极度敏感，当细菌受到活性氯的氧化胁迫后会激活RclR以增加细菌抗氧化的能力[14]。本文中我们发现C5424调控rclR并参与CFT073抵抗次氯酸的杀伤；巨噬细胞和嗜中性粒细胞中都有髓过氧化物酶(myeloperoxidase)，它可将过氧化氢和氯离子转化为次氯酸，以起到杀灭微生物的作用[19]。因此，C5424系统可能使得UPEC在被巨噬细胞和嗜中性粒细胞吞噬后能够更好地存活。此外，C5424还调控抗酸基因c4327[20]、菌毛蛋白基因c5395[21]等UPEC体内适应性相关的基因。
虽然DNA甲基化转移酶在病原菌中有广泛的调控作用，但是RM系统本身的主要功能是抵御外来DNA的入侵，比如质粒或噬菌体。在链球菌中，Ⅰ型RM系统介导抵御外源DNA通过转化进入细胞[8, 22]。我们利用SMRT测序方法比较野生株CFT073和缺失株Δc5424的甲基化组，确定了C5424甲基化修饰的基序，这个基序成对出现，符合Ⅰ型系统的特征[23]。接下来我们构建了包含识别基序的质粒。很明显，C5424的缺失极大地增加了质粒DNA的转化，表明C5424系统可以用来抵御外来DNA，很有可能是C5425介导了质粒的切割。UPEC通常定殖于肠道中，一旦污染了尿道口，就可能引起尿路感染[24]。人体肠道内存在大量的噬菌体(> 1010/g粪便)[25]，因此，C5424系统介导的外源DNA切割可能有助于大肠杆菌抵御肠道内噬菌体从而更好地定殖。另外，值得一提的是，生物信息学预测与SMRT测序结果暗示，在CFT073中存在其他的RM系统，也发挥抵御外来DNA的功能。这些不同的系统很可能有不同的修饰基序，用来抵御不同来源的DNA。
但是，C5424系统调控靶基因的分子机制仍是未解之谜。DNA甲基化转移酶调控的常见方式有：(1) 通过甲基化靶基因的启动子区域，影响RNA聚合酶或调控蛋白的结合；(2) DNA甲基化转移酶内部的重复序列的重组导致相变的发生，进而引起甲基化识别位点变化以及靶基因变化；(3) DNA的甲基化导致染色体构象发生变化，进而影响转录[26]。经过搜索，我们没有发现靶基因的启动子区域含有识别基序，也没有发现c5424基因内部有正向或反向重复序列，因此我们推测C5424影响靶基因的转录很有可能是通过第三种机制，即间接调控方式。
最后，本研究鉴定了大肠杆菌CFT073菌株中的一套RM系统C5423-5425：鉴定出DNA甲基化转移酶C5424的修饰基序；确定了RM系统可以抵御外源DNA；从全局层面定义了C5424的调控元，这些靶基因很有可能促进了UPEC的体内适应性或毒力。
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