徐鹏1, 王大红1,2
, 郑迎莹1, 沈文浩1 1. 河南科技大学食品与生物工程学院, 河南 洛阳 471023;
2. 河南省食品微生物工程技术研究中心, 河南 洛阳 471023
收稿日期：2019-08-04；修回日期：2019-10-05；网络出版日期：2020-03-06
基金项目：国家自然科学基金（31401672）；河南省高校青年骨干教师项目（2016GGJS-060）
*通信作者：王大红。Tel/Fax:+86-379-64282342;E-mail:wangdahong2003@163.com.
摘要：[目的] 筛选和鉴定产ε-多聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）的放线菌菌株，测定所产ε-PL的结构和聚合度，研究其抑制微生物生长的效果。[方法] 利用亚甲基蓝和ε-PL因静电排斥而形成透明圈原理筛选ε-PL产生菌，采用Itzhaki方法复筛。考察分离菌株的形态、生理生化特征和16S rRNA基因、gyrB基因序列的同源性鉴定菌种。结合其波谱特征对其所产ε-PL进行结构和聚合度鉴定。采用抑菌圈法考察所产ε-PL对7株指示菌的抑菌活性。[结果] 获得3株能够产生ε-PL的放线菌，其中X-18的ε-PL产量最高，达到0.8 g/L，综合形态、生理和分子生物学分析结果，鉴定为白色链霉菌（Streptomyces albulus）。根据波谱学特征，并与标准品比对，证实该ε-PL分子聚合度为25-30，抑菌实验结果显示，它对细菌的抑菌效果明显好于真菌。[结论] 从土壤中分离到1株抑菌效果较好的ε-PL产生菌S.albulus X-18，丰富了ε-PL产生菌资源。
关键词：ε-聚赖氨酸分离鉴定
Screening and identification of an ε-polylysine-producing bacterium
Peng Xu1, Dahong Wang1,2
, Yingying Zheng1, Wenhao Shen1 1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science & Technology, Luoyang 471023, Henan Province, China;
2. Henan Engineering Research Center of Food Microbiology, Luoyang 471023, Henan Province, China
Received: 4 August 2019; Revised: 5 October 2019; Published online: 6 March 2020
*Corresponding author: Dahong Wang, Tel/Fax:+86-379-64282342;E-mail:wangdahong2003@163.com.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31401672) and by the Fund of Young Teachers in Colleges and Universities of Henan Province (2016GGJS-060)
Abstract: [Objective] The aim of this study was to isolate and identify ε-polylysine-producing (ε-PL) actinomycetes from the environment, followed by determining the structure of ε-PL, and studying its inhibition of microbial growth. [Methods] Strains were isolated based on the transparent zone formed by themethylene blue and ε-PL. Itzhaki method was used to screen the strains. A bacterium strain was identified by morphological and physiological characterization and sequence analyses of 16S rRNA and gyrB gene. The structure of ε-PL was studied by spectrum analysis. Its antimicrobial activity was measured by inhibition zone method. [Results] We isolated 3 actinomycete strains. Strain X-18, with the highest ε-PL yield (0.8 g/L), was identified as Streptomyces albulus. The molecular polymerization degree of ε-PL was 25-30 by the spectral data analysis and the comparison with the ε-PL standard. Its antimicrobial effect was better on bacteria than fungi. [Conclusion] An ε-PL-producing strain S. albulus X-18 was successfully isolated to enrich the resources of ε-PL producers.
Keywords: ε-polylysineseparationidentification
随着食品工业的快速发展，全世界约有10%–20%的食品损失源于腐败。ε-聚赖氨酸(ε-polylysine，简称ε-PL)由赖氨酸残基通过ε酰胺键连接而成[1]，其聚合度一般为25–30[2]，由于其含有带正电荷的氨基，它对真菌、细菌、噬菌体或病毒都显示出广泛的抗微生物活性[3]；并且人体可将其分解为L-赖氨酸，为人体所吸收[4]，具有防腐与营养强化的双重功能，是一种优良的天然生物类食品防腐剂。ε-PL的研究和商业化应用最早从日本开始，之后在韩国和美国得到广泛应用[5]。2014年，我国批准ε-PL及其盐酸盐作为新型食品添加剂可以在食品工业中使用，该物质还可用于化妆品、药物包被物、基因载体、电子材料和环保材料等方面[6-7]，从而导致全球对ε-PL的需求量逐年增加。
在ε-PL产生菌中，多以链霉菌属为主，主要为白色链霉菌(Streptomyces albulus)[8]，但也有研究者报道了其他产生菌，段杉等筛选到一株产ε-PL的灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacus)[9]；Li等筛选到一株灰色链霉菌(Streptomyces griseofuscus)[10]；Ouyang等从土壤里筛选到一株产ε-PL的北里孢菌[11]；此外还有诺氏链霉菌、弗吉尼亚链霉菌、麦角真菌、枯草芽孢杆菌等均能产生ε-PL。对ε-PL的研究在日本进行较早并比较成熟，Kahar等利用筛选得到的白色链霉菌S410经过两段发酵和补料发酵，使ε-PL产量达48.3 g/L[12]。我国的相关研究起步较晚，江南大学、华南理工大学、南京工业大学和南开大学等单位在ε-聚赖氨酸产生菌株的筛选、诱变、分子改良育种及发酵生产上作了大量研究[13-14]，但与日本相比仍有一定差距，并且具有自主知识产权的菌株较少。本文主要是从土壤中筛选能够生产ε-PL的放线菌菌株，采用生理生化特征、16S rRNA基因和gyrB基因分析相结合的方法对获得的菌株进行鉴定，并对其代谢产物结构进行鉴定，进一步测定了该ε-PL对不同微生物生长的抑制能力，本文研究结果为该菌株的进一步研究和所产生ε-PL的应用奠定理论基础。
1 材料和方法 1.1 材料 土样采自河南、河北、江苏等地；以林地、荒草地、菜园为主，取距表层5–15 cm的土壤30 g左右，自然风干3–7 d，研钵碾碎后过筛。
1.2 培养基 SG富集培养基(分离培养基) (g/L)：甘油10，酵母膏0.10，NaH2PO4 0.68，MgSO4·7H2O 0.25，(NH4)2SO4 0.66，pH 7.0。
LB种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母5，NaCl 5，pH 7.0。
M3G发酵培养基(复筛培养基)(g/L)：葡萄糖50，(NH4)2SO4 10，酵母膏5，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，K2HPO4 0.8，KH2PO4 1.36，水1 L，pH 6.8 [葡萄糖，酵母膏，(NH4)2SO4分开灭菌]。
1.3 实验方法
1.3.1 富集培养: 称取2.5 g土样，置于25 mL SG富集培养基中，30 ℃、220 r/min恒温振荡培养2 d。
1.3.2 初筛和复筛: 对富集培养液进行梯度稀释，取各稀释度的菌悬液0.2 mL分别涂布于加有0.02 g/L的亚甲基蓝的SG分离培养基(含1.8%琼脂粉)，30 ℃恒温培养，至菌落长出；观察菌落生长情况，对形成透明圈的菌落，反复划线纯化，直至获得纯种。
挑取获得的菌落接种于LB种子培养基中，30 ℃、220 r/min培养24 h。再将生长好的种子液按6%接种到M3G发酵培养基中，30 ℃、220 r/min发酵96 h，获得发酵产物。
1.3.3 ε-PL的定性和定量检测: 定性检测：ε-PL是生物碱，可与碘化铋钾试剂(dragendorff)反应产生红色沉淀。向发酵上清液中滴加数滴dragendorff试剂，若有砖红色沉淀出现，即为阳性反应，表明有ε-PL产生。
定量检测：参照Itzhaki方法[15]。
1.3.4 菌体形态观察和生理生化特征的测定: 菌体形态观察：收集菌体→加入2.5%戊二醛→4 ℃过夜固定→PBS溶液清洗→乙醇梯度脱水→醋酸异戊酯置换→晾干→离子溅射仪喷银→观察。
生理生化特征的测定参照《常见细菌系统鉴定手册》[16]。
1.3.5 分子生物学鉴定: 挑取待鉴定菌株的纯培养物，按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的指示提取DNA，并进行PCR扩增。16S rRNA基因序列PCR扩增采用细菌通用引物27F (5′-AGT TTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3′)；7F (5′-CAGAGTTTGATC CTGGCT-3′)和1540R (5′-AGGAGGTGATCCAGC CGCA-3′)。DNA促旋酶B亚基基因(gyrB)序列PCR扩增采用的引物为5′-ATCGTGCCGTCCGAGA ACAA-3′和5′-CTTCACGAAGTCGACGATGC-3′。PCR扩增采用PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，将该的菌株序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，并使用MEGA 6.0软件构建系统发育树。
1.3.6 产物鉴定: (1) 发酵产物的分离和纯化：发酵液10000 r/min离心10 min除去菌体，将上清液pH调至3.0，70 ℃处理30 min，去除沉淀的杂蛋白，利用弱酸性阳离子树脂D152进行产物吸附，树脂采用蒸馏水及0.2 mol/L醋酸洗去未吸附的杂质，然后用0.1 mol/L盐酸洗脱产物，洗脱液用2 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0后进行减压蒸发浓缩，活性炭过滤脱色后透析袋除盐，收集袋内液体并冷冻干燥，冻干粉用于结构鉴定和抑菌活性分析。
(2) 发酵产物分子量的测定：发酵产物分子量的测定使用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)，根据其质谱信息，并与ε-PL标准品对比，确定其分子量范围。
(3) 产物紫外光谱测定：将发酵产物进行紫外全波长扫描，采样范围190–1100 nm，采样间距1 nm，观察其吸收峰特征，并与ε-PL标准品对比。
(4) 产物红外光谱测定：取适量充分干燥发酵产物，采用KBr压片法，测定该物质在4000– 400 cm–1范围内的红外吸收光谱，分辨率1 cm–1，并与ε-PL标准品对比。
(5) 核磁共振波谱测定：将适量充分干燥的发酵产物溶于D2O中，使用400 MHz核磁共振波谱仪测定其1H-NMR和13C-NMR，并与ε-PL标准品对比。
1.3.7 抑菌性试验: 选取经活化后的供试菌(大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、产黄青霉、红曲霉)，制成含菌量或孢子含量为106–107个/mL的菌悬液，取1 mL倒于灭菌平皿中，然后再加入冷却至45–50 ℃的培养基30 mL，制成含菌平板，采用打孔法(孔径5 mm)测定ε-PL对不同微生物的抑菌能力。
2 结果和分析 2.1 ε-PL产生菌的分离筛选 因为ε-PL分子带有正电荷，与亚甲基蓝因静电而产生排斥现象，会使亚甲基蓝变色，从而产生透明圈。在本研究中，富集后的样品在含有0.02 g/L亚甲基蓝的SG分离培养基中培养5–7 d后，在ε-PL产生菌的菌落周围形成透明圈，结果如图 1所示。对初筛到的菌株进行定性检测，其中X-3、X-7、X-18三株菌产ε-PL，这3株菌在高氏一号固体培养基中培养5 d，结果如图 2，可以看到明显菌落形态，菌落隆起，较小而分散呈地衣状，不蔓延，最初表面光滑，然后发育一层短菌丝体，表面呈较紧密的绒状，符合放线菌特征。
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| 图 1 产ε-PL菌株在含亚甲基蓝的SG固体培养基上的透明圈 Figure 1 The transparent zone of the ε-PL-producing strain on SG solid medium with methylene blue. |
| 图选项 |
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| 图 2 产ε-PL菌株在高氏一号培养基上的形态(培养5 d) Figure 2 The colony of ε-PL-producing strains on Gauze's medium for 5 days. A: X-3; B: X-7; C: X-18. |
| 图选项 |
X-3、X-7和X-18经M3G发酵培养基摇瓶发酵96 h后，发酵液采用Itzhaki方法定量检测，ε-PL产量分别为0.13、0.2、0.8 g/L，选择产量较高的X-18进行菌种鉴定以及其产物结构鉴定。
X-18菌分别接种在高氏一号固体培养基(培养5 d)和M3G发酵培养基(培养3 d)中，扫描电镜下观察菌丝形态和孢子的特征。从图 3可以看出其菌丝体直径约0.5 μm，在固体平板中，菌丝和孢子堆砌在一起，相互交叉重叠，大量孢子附着在菌丝上；在液体培养基中，菌丝粗壮，表面略有褶皱，菌丝体形态正常。
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| 图 3 X-18菌在高氏一号固体培养基(5 d)和M3G发酵培养基(3 d)的菌丝扫描电镜图 Figure 3 Scanning electron micrograph of strain X-18. A: The strain X-18 was cultured on Gauze's medium for 5 days and the mycelium was observed by scanning electron microscope (5000×); B: The strain X-18 was cultured on M3G medium for 3 days and the mycelium was observed by scanning electron microscope (10000×). |
| 图选项 |
2.2 X-18菌株的生理生化特征 X-18菌株的生理生化试验包括接触酶试验、革兰氏染色试验、明胶液化试验、淀粉水解试验和糖类利用试验等。由表 1可知，X-18菌株为革兰氏阳性，在温度为15–40 ℃、pH 2.0–10.0之间均能生长，接触酶试验、明胶液化试验、亚硝酸还原和淀粉水解试验为阳性，V-P试验和纤维素利用试验为阴性，能够代谢利用葡萄糖、D-甘露醇和麦芽糖等。
表 1. X-18菌株的生理生化特征 Table 1. Physiological and biochemical characteristics of strain X-18
| Objects | Results |
| 15 ℃ growth | + |
| 40 ℃ growth | + |
| pH 2.0 growth | + |
| pH 10.0 growth | + |
| Catalase test | + |
| Gram stain | + |
| Gelatin liquefaction test | + |
| V-P test | – |
| Nitrite reduction test | + |
| Utilization of cellulose | – |
| Starch hydrolysis test | + |
| Utilization of glucose | + |
| Utilization of D-mannitol | + |
| Utilization of maltose | + |
| +: positive reaction; –: negative reaction. | |
表选项
2.3 X-18菌株的分子生物学鉴定 X-18菌株用DNA提取试剂盒提取DNA后，使用通用引物PCR扩增目的基因，测序由上海生工生物公司完成。所获得16S rRNA基因序列在GenBank数据库进行BLAST比对，并构建系统发育树(图 4)，结果显示X-18菌株16S rRNA基因与链霉菌属白色链霉菌Streptomyces albulus NBRC 13410T (NR112393)序列显示出99%的相似性。
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| 图 4 基于菌株X-18的16S rRNA基因构建的系统发育树 Figure 4 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequence of strain X-18 and reference strains. The phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0 software using random concatenation of aligned core genes as the dataset. The numbers at each branch points is the percentage supported by bootstrap; Bar 0.005 at the bottom is the sequence divergence; Those in parentheses are the accession numbers in GenBank. |
| 图选项 |
DNA促旋酶B亚基基因(gyrB)在进化速率上较16S rRNA基因快，常用于属内种水平上的分类鉴定，将已获得的该菌株gyrB基因在NCBI中进行BLAST比对，系统发育树显示其与Streptomyces albulus AS 4.1585T的相应基因序列高度相似，说明该菌株与Streptomyces albulus AS 4.1585T亲缘关系最近(图 5)。综合菌体形态、生理生化特征、16S rRNA基因及gyrB基因鉴定结果，该菌株被鉴定并命名为白色链霉菌X-18 (Streptomyces albulus X-18)。
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| 图 5 基于菌株X-18的gyrB基因构建的系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree based on the gyrB gene sequence of strain X-18 and reference strains. The numbers at each branch points is the percentage supported by bootstrap; Bar 0.02 at the bottom is the sequence divergence; Those in parentheses are the accession numbers in GenBank. |
| 图选项 |
2.4 产物鉴定
2.4.1 紫外全波长扫描: 将纯化得到S. albulus X-18的发酵产物溶于重蒸水中，以重蒸水作对照，用紫外可见分光光度计检测其紫外吸收光谱，测定波长范围为190–1100 nm。紫外全波长扫描结果如图 6所示，该物质的最大吸收峰在192 nm，该图谱与ε-PL的标准品基本一致。
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| 图 6 发酵产物全波长扫描图 Figure 6 Full-wavelength scanning of the fermentation product. UV spectrum was recorded on a spectrophotometer with the wavelength from 190 nm to 1100 nm. |
| 图选项 |
2.4.2 红外光谱测定: 为获取该发酵产物的基团信息，取充分干燥的S. albulus X-18发酵产物，采用KBr压片法，使用红外光谱仪测定该物质在4000–400 cm–1范围内的吸收光谱，分辨率1 cm–1。红外光谱如图 7所示，从图中可以看出，3389 cm–1和3258 cm–1左右为N-H的不对称伸缩振动和对称伸缩振动，属第一峰区。1670 cm–1左右为酰胺的特征谱带酰胺Ⅰ带，1510 cm–1左右为N-H弯曲振动(C-N伸缩振动)即酰胺的特征谱带酰胺Ⅱ带，1263 cm–1为C-N伸缩振动(N-H弯曲振动)，是酰胺的特征谱带酰胺Ⅲ带。2360 cm–1可能是未能全扣除空气背景中的二氧化碳。红外光谱表明，S. albulus X-18的发酵产物为一种由氨基酸以酰胺键聚合的聚合物，和ε-PL标准品的红外光谱基本相符。
 |
| 图 7 发酵产物红外光谱图 Figure 7 Infrared spectrum of fermentation product. The figure was obtained using KBr pressing method. The adsorption peak was measured from 4000 to 400 cm–1. |
| 图选项 |
2.4.3 质谱分析: 为了获得该发酵产物的分子结构和聚合度，采用MALDI-TOF-MS测定该发酵产物的质谱信息，并与标准品作对比。S. albulus X-18的发酵产物质谱图如图 8所示，从图中可以看出，丰度最高的分子离子峰[M+Na]+在3370–3883之间，并且相邻离子峰之间的质荷比相差128，为赖氨酸缩去1个H2O分子的赖氨酸残基质量(单体赖氨酸分子量为146.19)，所合成ε-PL聚合度在25–30个赖氨酸之间。
 |
| 图 8 发酵产物的MALTI-TOF-MS Figure 8 MALTI-TOF-MS of fermentation product. The high-resolution MS was obtained by MALTI-TOF-MS in the positive ESI mode and the spectral data were processed by MassLynx 4.1 software. |
| 图选项 |
2.4.4 核磁共振波谱(NMR)测定: 将适量充分干燥的发酵产物溶于D2O中，使用400 MHz核磁共振波谱仪测定其1H-NMR和13C-NMR，并与标准品作对比。S. albulus X-18的发酵产物的1H-NMR如图 9所示，图中H的化学位移从低场到高场分别为δH 3.72、3.09、1.68、1.42和1.23，其峰面积比约为1:2:2:2:2，从左到右依次为CHα、CH2ε、CH2β、CH2δ及CH2γ的质子峰，酰胺中的氢与重水的快速交换作用引起在高场信号的消失。以上特征与ε-PL的理论特征和标准品的1H-NMR谱图相符。
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| 图 9 发酵产物的1H-NMR图 Figure 9 1H-NMR of fermentation product. The data of 1H-NMR was detected with 400 MHz varian inova in D2O. |
| 图选项 |
S. albulus X-18的发酵产物的13C-NMR如图 10所示，C原子化学位移分别为δC 170.66、53.32、38.95、30.89、27.86和21.66，从左到右分别为Cε-NHCO、Cα、Cε、Cβ、Cγ和Cδ，与标准品的13C-NMR谱图特征一致。
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| 图 10 发酵产物的13C-NMR谱图 Figure 10 13C-NMR spectrum of fermentation product. The data of 13C-NMR was detected with 400 MHz varian inova in D2O. |
| 图选项 |
2.5 抑菌性试验 检测ε-PL对不同种类微生物生长的抑制能力，结果如表 2所示。ε-PL对酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及枯草芽孢杆菌等生长有明显的抑制效果，对红曲霉和产黄青霉等霉菌的抑制能力要差一些(表 2)。实验结果显示，ε-PL对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的最低抑制浓度(MIC)为40 mg/L，对金黄色葡萄球菌MIC为20 mg/L，对酿酒酵母的MIC为15 mg/L，对产黄青霉和红曲霉的MIC为70 mg/L。
表 2. ε-PL对不同菌株生长的抑制作用 Table 2. Inhibition effects of ε-PL on the growth of different kinds of microbiology
| Test organisms (Inhibition zone diameter/mm) | Concentration of ε-PL/(mg/L) | |||||||||
| 10 | 15 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | |
| Escherichia coli | + | + | + | + | 7.2 | 10.8 | 11.6 | 13.3 | – | – |
| Salmonella | + | + | + | + | 6.5 | 9.2 | 10.9 | 13.0 | – | – |
| Staphylococcus aureus | + | + | 6.0 | 8.7 | 11.1 | 11.8 | 13.9 | – | – | – |
| Bacillus subtilis | + | + | + | + | 5.6 | 6.7 | 9.1 | 11.2 | – | – |
| Saccharomyces cerevisiae | + | 5.8 | 7.2 | 9.1 | 12.6 | 13.4 | 14.8 | – | – | – |
| Penicillium chrysogenum | + | + | + | + | + | + | + | 5.6 | 6.8 | 8.1 |
| Monascus | + | + | + | + | + | + | + | 6.3 | 8.3 | 9.4 |
| The diameter of the pore was 5 mm. +: no inhibition zone; –: the experiment was not performed. | ||||||||||
表选项
3 讨论 目前，日本和我国对ε-PL产生菌的研究较多，发酵产量较高的菌株主要集中在链霉菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和北里孢菌，但产量较高的菌株大多数为日本研究者所筛选，如摇瓶发酵ε-PL产量最高的菌株Streptomyces aureofaciern为日本研究者所筛选，产量达到了4.5 g/L，而我国摇瓶发酵产量最高的菌株Streptomyces sp. AF3-44为3.11 g/L[17]。不同的链霉菌发酵生产ε-PL的能力差别较大，最低的不到1 g/L，最高的可达到4.5 g/L，因此，生产性能良好的菌株是提高ε-PL产量的基础。在本研究中，以亚甲基蓝为指示剂，从土壤中分离出3株具有ε-PL生产能力的放线菌，其中X-18菌株的ε-PL发酵产量最高，为0.8 g/L，根据该菌的菌体生理生化特征、16S rRNA基因和gyrB基因序列比对，鉴定该菌株为白色链霉菌，该菌的ε-PL初始产量高于已报道的 S. albulus No.410 (0.5 g/L)，但与S. albulus NBRC 14147 (2.8 g/L)相比仍有差距[18]。
不同ε-PL产生菌株所合成ε-PL的聚合度不同，ε-PL聚合度大小与抑菌活性密切相关，分子量在3600–4300 Da间的ε-PL具有高抑菌活性[19]，当分子量小于1300 Da时，ε-PL失去抑菌活性[20]，通常25–35个氨基酸残基的ε-PL用作食品防腐剂。在本研究中，通过对S. albulus X-18发酵产物的紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁谱等波谱学特征进行分析，并与ε-P标准品比较，波谱特征基本一致，确定该代谢产物为ε-PL，且该ε-PL的聚合度在25–30之间，抑菌能力实验显示该物质具有较好的抑菌能力，特别是对细菌和酿酒酵母的生长抑制能力较好，具有良好的应用前景。但是该菌的ε-PL产量较低，在后期的研究中将对该菌进行选育，并优化其培养基组成和调控其发酵条件，为其工业化应用奠定基础。
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