解琳1, 郝宇2, 齐欣1, 刘本松1, 温昱晨1, 刘丽杰1, 杨晓杰1, 金忠民1
1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161000;
2. 海南地质综合勘察设计院, 海南 海口 570100
收稿日期：2019-07-19；修回日期：2019-10-26；网络出版日期：2020-01-21
基金项目：黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目（135309483）；齐齐哈尔市科学技术计划（2017GG1989）
*通信作者：金忠民. E-mail:yyy6768@163.com.
摘要：[目的] 以扎龙湿地污染的土壤为材料，进行耐铅镉菌株的分离鉴定，研究不同条件对菌株吸附铅镉的影响。[方法] 采用平板划线法，逐级驯化，筛选出一株耐铅镉菌株，通过生理生化特征及ITS序列分析对菌株进行鉴定，探究该菌吸附的最佳条件，并进行Langmuir和Freundlich等温吸附模型拟合。[结果] 本研究分离得到一株菌株JB15，最高耐受浓度为Pb2+ 1200 mg/L、Cd2+ 200 mg/L，经鉴定为球孢白僵菌，最佳吸附条件温度为30，pH为7.0，接菌量为8.0 g/L，吸附时间为60 min，铅镉吸附率分别为52.27%和62.38%；铅镉吸附量分别为19.60 mg/g和3.98 mg/g，符合Langmuir等温吸附模型。[结论] 菌株JB15具有较好的吸附效果，可为微生物修复重金属土壤污染提供理论基础。
关键词：铅镉分离鉴定球孢白僵菌生理生化生物吸附
Isolation, identification and biosorption characteristics of a lead and cadmium resistant fungus
Lin Xie1, Yu Hao2, Xin Qi1, Bensong Liu1, Wen Yuchen1, Lijie Liu1, Xiaojie Yang1, Zhongmin Jin1
1. Life Sciences and Agriculture and Forestry College, Qiqihar University, Qiqihar 161000, Heilongjiang Province, China;
2. Hainan Geological Survey and Design Institute, Haikou 570100, Hainan Province, China
Received: 19 July 2019; Revised: 26 October 2019; Published online: 21 January 2020
*Corresponding author: Jin Zhongmin, E-mail:yyy6768@163.com.
Foundation item: Supported by the Heilongjiang Provincial Higher Education Fund Research Project (135309483) and by the Qiqihar City Science and Technology Plan Project (2017GG1989)
Abstract: [Objective] A lead and cadmium resistant strain was isolated from the polluted soil of Zhalong wetland, and the influences on lead and cadmium adsorption under different conditions are discussed. [Methods] The streak plate method and progressive domestication were used for screening lead and cadmium resistant strain. The strain was identified by physiological and biochemical tests, and by ITS sequence analysis. The optimal condition of the lead and cadmium resistant strain was explored, and Langmuir and Freundlich isothermal adsorption models were used. [Results] A lead and cadmium resistant strain JB15 was isolated as Beauveria bassiana, and the maximum tolerant Pb2+ and Cd2+ concentration of the strain was 1200 mg/L and 200 mg/L, respectively. Optimum conditions for adsorption were found at pH of 7.0 with inoculation quantity of 8.0 g/L, at 30℃ for 60 min. Under such conditions, the lead and cadmium adsorption rate reached 52.27% and 62.38%, and the lead and cadmium adsorption capacity reached 19.60 mg/g and 3.98 mg/g, respectively. The adsorption process of the strain was fitted well on Langmuir adsorption isotherm model. [Conclusion] The isolated strain JB15 has a good adsorption effect and provides theoretical foundation for microbial remediation of soil heavy metal contamination.
Keywords: lead and cadmiumisolation and identificationBeauveria bassianaphysiological and biochemicalbioadsorption
工业废弃物堆放、施用化肥农药等都能使铅、镉在土壤中大量积累。铅、镉污染的土壤会对农作物产生严重的危害，进而通过食物链影响人类健康[1-2]。解决土壤重金属污染问题，确保土壤质量和粮食安全，对人们的健康和发展至关重要[3]。
土壤中有大量种类的微生物，在治理重金属污染的土壤中有不可忽视的作用。微生物吸附法具有效果好、成本低廉、操作简单、无二次污染等优点，具有广阔的应用前景，已经成为微生物修复重金属污染土壤的研究热点[4-6]。细菌、真菌和微藻类均可被制成吸附剂用于吸附去除重金属[7]。目前大部分的研究为细菌对重金属离子的吸附特性及机理机制等方面[8]。
本实验从扎龙湿地污染土壤中筛选铅镉抗性菌株，通过生理生化实验和ITS序列对该菌株进行鉴定，并对该菌株吸附铅镉进行研究，以期为微生物修复治理铅镉污染土壤提供菌种资源，并为其进一步研究提供理论基础。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌种来源: 从黑龙江省齐齐哈尔市扎龙自然保护区土壤中筛选。
1.1.2 培养基: ① 基础培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1.0 L，pH=7.0。②筛选培养基：在基础培养基中加入Pb(NO3)2、3CdSO4·8H2O，调至所需浓度。
1.2 菌种筛选 称取经0.5 mm筛子的土壤1.0 g，于含有灭菌玻璃珠的100 mL无菌水中，30 ℃、120 r/min振荡2 h，静置后取上清液1.0 mL，稀释制备10–3–10–5浓度的菌悬液，分别取0.1 mL于Pb2+/Cd2+浓度为300/50下的筛选培养基，均匀涂布，倒置于30 ℃培养箱中，培养3 d。挑取生长良好的单菌落，采用平板划线法接种于Pb2+/Cd2+浓度更高的培养基中，Pb2+/Cd2+分别为600/100、900/150、1200/200 mg/L，经过多次驯化，直至菌株不再生长，将获得的铅镉抗性菌株纯化后于4 ℃冰箱封存备用。
1.3 菌种鉴定
1.3.1 形态学观察及生理生化特征测定: 将菌株接种到基础培养基中，培养4 d后，观察菌落生长速度、菌落形态、颜色等，用结晶紫染色后，在光学显微镜下观察。将筛选出的菌株进行淀粉水解实验、纤维素水解实验、明胶液化实验、麦芽糖和纤维素利用实验、生长温度和pH范围测定。
1.3.2 分子生物学鉴定: 将筛选后的菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，PCR扩增引物为ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系为Template (基因组DNA 20–50 ng/μL) 0.5 μL、10×Buffer (with Mg2+) 2.5 μL、dNTPs (各2.5 mmol/L) 1 μL、酶0.2 μL、正向引物(10 μmol/L) 0.5 μL、反向引物(10 μmol/L) 0.5 μL、加双蒸水至25 μL。循环条件为94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃终止反应。测得序列在NCBI中进行BLAST同源比对，利用MEGA 5.0软件构建ITS基因系统发育树。
1.4 不同条件下耐铅镉菌株对铅镉吸附能力的研究 本实验分离得到菌株JB15，最高耐受浓度为Pb2+ 1200 mg/L、Cd2+ 200 mg/L，菌株吸附铅镉浓度范围在最高耐受浓度之内，复合铅镉的毒性也比单一铅、镉毒性大，故溶液中铅镉浓度分别为300、50 mg/L，以吸附温度、吸附时间、溶液pH、接菌量为单因素，确定菌株的最佳吸附条件。设置温度为15、20、25、30、35、40 ℃，吸附时间120 min，溶液初始pH，接菌量10.0 g/L，150 r/min振荡培养，吸附后以8000 r/min离心3 min，倾倒取上清液，采用原子吸收分光光度法测定铅镉浓度，确定最适吸附温度，依次确定吸附时间20、40、60、80、100、120 min，pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接菌量2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L。用公式(1)计算吸附率p和公式(2)吸附量q。
 | 公式(1) |
 | 公式(2) |
1.5 等温吸附模型 配制铅、镉浓度均为50、100、150、200、250、300 mg/L，温度为30 ℃，pH为7.0，接菌量为4.0 g/L，在150 r/min下振荡培养至吸附平衡，测定溶液中铅镉浓度。将试验数据进行Langmuir和Freundich模型拟合。
2 结果和分析 2.1 菌种鉴定
2.1.1 形态学观察及生理生化特征测定: 通过分离筛选得到1株能在铅浓度1200 mg/L、镉浓度200 mg/L下生长的菌株。菌株呈白色，棉絮状，表面凸起，背面呈淡黄色，在光学显微镜下菌丝呈树枝状分叉，分生孢子梗呈束状，周围有大量卵圆形孢子(图 1)。菌株生理生化鉴定见表 1，菌株的明胶液化、淀粉水解、纤维素水解、麦芽糖和纤维素利用实验结果均为阳性，在温度范围为15–45 ℃、pH为3.0–9.0下菌株都能正常生长，通过前期实验室筛选对比，该菌株生存能力较强，能够适应环境变化带来的不利影响。
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| 图 1 光学显微镜下菌株形态 Figure 1 Morphology of the strain under light microscope. A: Colony morphology; B: Mycelial morphology; C: Conidiophore; D: Conidia. |
| 图选项 |
表 1. 菌株JB15的生理生化实验 Table 1. Physiological and biochemical experiments of strains
| Experiment name | Starch hydrolysis | Cellulose hydrolysis | Gelatin liquefaction | Maltose | Cellulose | T/℃ | pH |
| Experimental result | + | + | + | + | + | 15–45 | 3–9 |
表选项
2.1.2 分子生物学鉴定: PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳如图 2显示，菌株ITS1和ITS4基因片段为553 bp。PCR产物纯化后进行测序，获得的序列在NCBI上进行BLAST比对，并构建系统发育树(图 3)。结果表明，菌株与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)有较高的同源性，通过NCBI数据库进行比对同源性可达100%，经鉴定为球孢白僵菌，菌株编号为JB15，在GenBank数据库中的登录号为MK034753。
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| 图 2 分离菌株JB15的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of strain JB15. |
| 图选项 |
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| 图 3 菌株JB15基于ITS基因序列的系统发育树 Figure 3 Strain JB15 is based on the phylogenetic tree of the ITS gene sequence. |
| 图选项 |
2.2 不同条件下耐铅镉菌株对铅镉吸附能力的研究
2.2.1 吸附温度对JB15吸附能力的影响: 温度是微生物的重要影响因素[9]，会破坏其细胞壁的稳定性，从而对微生物吸附重金属产生影响[10]。从图 4看出，随反应体系温度的升高，JB15对铅、镉的吸附率呈先增加后减少的趋势。在15 ℃时，铅镉吸附率分别为48.79%和37.86%。当温度为30 ℃时，铅镉吸附率均达到最大，分别为64.81%和63.69%。当温度进一步升高至40 ℃时，菌株JB15吸附铅镉的吸附率分别为47.42%和50.25%。综上，JB15对300 mg/L铅吸附、50 mg/L镉吸附的最适温度为30 ℃。
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| 图 4 吸附温度对JB15吸附能力的影响 Figure 4 Effect of adsorption temperature on the adsorption capacity of JB15. |
| 图选项 |
2.2.2 吸附时间对JB15吸附能力的影响: 随吸附时间的增加，菌体表面活性剂位点吸附能力将趋于饱和，控制吸附时间能提高微生物修复效率[11]。如图 5，随吸附时间的增加，铅镉吸附率呈先增加后减少的趋势。吸附时间在10 min时铅镉吸附率就达到了41.49%和42.91%，说明该菌吸附铅镉是一个快速的过程。当吸附时间在60 min时，铅镉吸附率均达到最大，为56.49%和72.99%。随吸附时间增加，铅镉吸附率有所下降，但基本趋向饱和，可能出现脱附现象。所以，JB15的最适吸附时间为60 min。
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| 图 5 吸附时间对JB15吸附能力的影响 Figure 5 Effect of adsorption time on JB15 adsorption capacity. |
| 图选项 |
2.2.3 溶液pH对JB15吸附能力的影响: 菌体吸附能力与菌体表面所带电荷有关[12]，电荷通过与重金属离子结合来达到吸附效果，pH值也是吸附过程中的一个重要因素。图 6可看出，随pH的增加，铅镉吸附率逐渐增加。pH为3.0–6.0时，铅镉吸附速率幅度较大，pH对JB15吸附有显著的影响。pH为6.0–7.0时，铅镉吸附趋于平缓。pH在7.0–9.0时，可能是反应体系中OH–过多引起的，OH–与金属离子发生反应形成氢氧化物沉淀从溶液中析出，从而导致吸附率增加。林海等[13]研究发现pH较高时，细胞表面带有负电荷的官能团暴露，吸附位点增加，从而使吸附效果增加。张敏等[14]研究发现当pH值大于离子沉淀点时，溶液中铅离子与氢氧根结合形成沉淀，使吸附率增加。综合实际利用，该菌最适pH为7.0。
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| 图 6 pH对JB15吸附能力的影响 Figure 6 Effect of pH on the adsorption capacity of JB15. |
| 图选项 |
2.2.4 接菌量对JB15吸附能力的影响: 随接菌量的增加菌体表面活性位点的数量也增加[14]。如图 7，随接菌量的不断增加，JB15对铅镉的吸附率也不断增加，而吸附量不断减少。当接菌量为8.0 g/L时，镉吸附率为62.38%且逐渐趋向平稳，铅吸附率为52.27%，铅镉吸附量为19.60 mg/g和3.89 mg/g。当接菌量为10.0 g/L，铅镉吸附率为54.11%和63.78%，铅镉吸附量为16.23 mg/g和3.18 mg/g。增大接菌量可以增加吸附率，但是接菌量过大，菌丝会聚集成菌丝球，不利于JB15对铅镉的吸附。考虑到铅镉吸附率、吸附量及该菌的利用率，最适接菌量为8.0 g/L。
 |
| 图 7 接种量对JB15吸附能力的影响 Figure 7 Effect of inoculum on JB15 adsorption capacity. |
| 图选项 |
2.3 等温吸附模型 采用Langmuir和Freundlich[15]等温吸附模型进行拟合，结果如图 8、9所示。JB15吸附铅、镉Freundlich等温吸附模型相关系数R2分别为0.9334和0.8214；JB15吸附铅、镉Langmuir等温吸附模型相关系数R2分别为0.9898和0.9921，Langmuir等温吸附模型R2高于Freundlich等温吸附模型R2，说明JB15吸附铅镉的过程更符合Langmuir等温吸附方程。
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| 图 8 Freundlich吸附等温线 Figure 8 Freundlich adsorption isotherm. |
| 图选项 |
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| 图 9 Langmuir吸附等温线 Figure 9 Langmuir adsorption isotherm. |
| 图选项 |
3 讨论 本实验从黑龙江省齐齐哈尔市扎龙自然保护区污染土壤中筛选出一株铅镉抗性真菌，经生理生化和ITS鉴定，该菌为球孢白僵菌，菌株编号为JB15。该菌株对铅镉有较高的吸附能力，这可能与菌体表面的活性位点及官能团羧基、羟基、氨基、酰胺基等基团有关，通过一系列化学反应将有害重金属转化为化合物[16-17]。
通过吸附温度对JB15吸附铅镉的影响实验可见，随温度的升高，铅镉吸附率呈先升高后降低的趋势，最适温度为30 ℃。Fan等[18]研究发现，简青霉(Penicillium simplicissimum)吸附镉时，改变温度会影响菌体表面的吸附活性位点，温度过高会造成细胞壁被破坏，进而吸附位点减少，影响吸附率。吸附时间对JB15吸附铅镉也有影响，本实验随吸附时间的增大，铅镉吸附率均呈先增大后减少的趋势，在吸附前10 min，铅镉吸附率就达到了41.49%和42.91%，是一个快速的过程。Volesky[19]研究表明生物吸附过程是一个快速的过程，随时间的增加，吸附率有下降的趋势，出现了脱附现象，可能与吸附反应是放热的过程有关，反应体系温度过高，影响吸附位点。pH对JB15吸附铅镉的影响较大，溶液pH较低时，大量H+和H3O+与金属离子产生竞争关系，影响菌体吸附金属离子，当反应体系的pH大于7.0时，过量的OH–可能与溶液中的铅离子形成氢氧化铅沉淀，影响吸附效果。Kiran等[20]研究表明pH可以影响菌株的吸附位点及溶液中重金属离子的状态，pH是影响吸附过程的一个因素。随接菌量的增加，菌体表面活性位点增加，吸附铅镉效果较好，但接菌量过大，菌体活性位点之间易发生静电排斥，导致单位每克菌体的吸附量降低，阻碍JB15吸附铅镉离子。菌株JB15更好地符合Langmuir等温吸附模型，说明JB15对铅镉是单分子层吸附。目前关于球孢白僵菌吸附重金属的研究鲜有报道，但是有研究表明球孢白僵菌具有一定的潜在应用价值，Mascarin[21]研究表明，球孢白僵菌可作为真菌杀虫剂，是许多虫害治理的一个工具。费泓强等[22]研究表现球孢白僵菌D1-5对玉米幼苗期的生长发育有一定的促进作用，可以影响酶活性变化。隋丽等[23]发现亚洲玉米螟幼虫在球孢白僵菌-玉米共生体的取食率比未接种球孢白僵菌玉米叶片的取食率低，球孢白僵菌可应用于玉米叶片上，对亚洲玉米螟幼虫的取食行为有抑制作用。
本实验筛选出一株耐铅镉菌株JB15，实验结果表明，该菌株对铅镉有一定的抗性且能对铅镉有较高的吸附性，可为后续微生物修复重金属污染提供理论基础。
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