李晨晨1, 汪凡越2, 汪志平1
, 卢奇奇1, 陈子元1 1. 浙江大学原子核农业科学研究所, 农业农村部核农学重点开放实验室, 浙江 杭州 310058;
2. 浙江工业大学环境学院, 浙江杭州 310014
收稿日期：2019-03-25；修回日期：2019-05-30；网络出版日期：2019-11-11
基金项目：国家自然科学基金（30771669）；浙江省院士基金（2016J51701）
*通信作者：汪志平, Tel/Fax:+86-571-86971021;E-mail:zhpwang@zju.edu.cn.
摘要：[目的] 选育高沥水性的螺旋藻新品系，显著降低藻粉生产中干燥的能耗。[方法] 以用于工厂化培植的钝顶螺旋藻ZJU0115为出发品系，用组织匀浆-离心沉降法制得其原生质球，并先以0.6% EMS处理30min再用2.4 kGy的60Co γ射线辐照，经含0.02%黄原胶（xanthan gum）的Zarrouk’s培养液筛选、藻丝单体分离培养、藻泥持水率和胞外多糖（EPS）等检测及生产培植试验。[结果] 获得了一株产量、蛋白质和多糖含量与ZJU0115相当，而藻泥持水率和EPS含量分别下降5.9%和29.7%的突变体，命名为ZJU0115（HD）。超微结构与随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析结果显示，与其亲本ZJU0115相比，ZJU0115（HD）藻丝表面更光滑，可能为酸性多糖的乳白状粘附物也更少；ZJU0115（HD）细胞内的多磷酸盐颗粒显著变小且呈弥散状；基因组DNA在随机引物S90的扩增产物中显示出多态性差异。[结论] ZJU0115（HD）在工厂化培植中生产性状好、高沥水性能稳定，藻泥的干燥能耗降低了近50%，它的育成与应用，有助于推进当前螺旋藻产业迈向高效、节能、绿色、环保发展的新阶段。
关键词：钝顶螺旋藻高沥水性突变体育种超微结构随机扩增多态性DNA标记
Selection and ultrastructure and RAPD analysis of a new Spirulina platensis strain with high-efficiency dehydration performance
Chenchen Li1, Fanyue Wang2, Zhiping Wang1
, Qiqi Lu1, Ziyuan Chen1 1. Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, Key Laboratory of Chinese Ministry of Agriculture and Rural Affairs for Nuclear-Agricultural Sciences, Hangzhou 310058, Zhejiang Province, China;
2. College of Environment, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang Province, China
Received: 25 March 2019; Revised: 30 May 2019; Published online: 11 November 2019
*Corresponding author: Zhiping Wang, Tel/Fax:+86-571-86971021;E-mail:zhpwang@zju.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (30771669) and by the Academician Fundation of Zhejiang Province (2016J51701)
Abstract: [Objective] Breeding a new Spirulina strain with high-efficiency dehydration performance, and effectively reducing the energy consumption of dry powder production. [Methods] The spheroplasts of Spirulina platensis strain ZJU0115 that is widely used in large-scale cultivation, were prepared by tissue homogenate breaking and centrifugal sedimentation. They were treated by 0.6% EMS for 30 min and 2.4 kGy 60Co gamma rays, and then screened by Zarrouk's medium containing 0.02% xanthan gum, cultured by the single filament separating, detected of water-holding rate in algae sludge and extracellular polysaccharide (EPS) content in filtrate. [Results] A mutant named ZJU0115(HD) was obtained. The yield and contents of protein and polysaccharide in ZJU0115(HD) were similar to that in ZJU0115, but the sludge water-holding rate and EPS content of ZJU0115(HD) decreased by 5.9% and 29.7% respectively. Ultrastructure analysis showed that the filament surface of ZJU0115(HD) was smoother and had fewer milky-white adhesives considered acidic polysaccharides than that of ZJU0115. And the polyphosphate granules in ZJU0115(HD) cells were significantly smaller and more dispersed. Moreover, RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) analysis indicated that the amplifcation bands of primers S90 revealed significant polymorphisms between ZJU0115(HD) and ZJU0115. [Conclusion] ZJU0115(HD) has good production traits and stable high-efficiency dehydration performance in industrial cultivation. In particular, nearly 50% of the energy consumption of its sludge drying could be saved. The new strain will help promote the current Spirulina industry to a new stage of high efficiency, energy saving, green and environmental protection.
Keywords: Spirulina platensishigh-efficiency dehydration performancemutantbreedingultrastructureRAPD (randomly amplified polymorphic DNA)
螺旋藻(Spirulina)又称节旋藻(Arthrospira)，是一种古老的原核丝状光合放氧蓝藻，已成为当前全球培植与应用规模最大的经济微藻，我国螺旋藻粉产量约占世界总量的一半[1-4]。目前国内外螺旋藻粉生产普遍采用循环式跑道池培养，再用孔径约50 μm的滤网过滤采收与清洗藻体，并沥至自然不滴水时，将藻泥喷雾干燥制得干粉[4-6]。这一工艺虽成熟且已基本实现自动化，但因螺旋藻体的持水力强，沥至自然不滴水时，藻泥的含水量仍高达93%–96%，即100 kg藻泥干燥所得藻粉仅为4–7 kg，干燥1 kg藻粉至少需消耗6元的燃油或天然气[4-5, 7]。如此高的干燥能耗，不仅极大限制了螺旋藻粉作为优质饲料蛋白源在畜禽和水产养殖等需求量更大领域的大规模应用，而且一些生产基地为降低干燥成本而擅自燃烧煤炭甚至柴薪，严重破坏生态、污染环境。为此，国内外近20多年来，一直试图利用连续离心、减压抽滤、吸附交换等脱水工艺，降低螺旋藻藻泥的持水量，但因藻体的持水力强、藻细胞抗机械作用力性能差等原因，而均未能奏效[4-5, 7]。本文报道了1株利用诱发突变技术育成、可使藻粉干燥能耗降低近50%的高沥水性钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)新品系。
1 材料和方法 1.1 供试材料 工厂化生产性状优良的钝顶螺旋藻品系ZJU0115，保存于浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室。
1.2 方法
1.2.1 培养与生产条件：: 采用Zarrouk’s培养液培养[8]。实验室培养在全自动温控光照培养箱中进行，光照强度为54 μmol photons/(m2·s)，光照时间为12 h/d，光照时为28 ℃，黑暗时为20 ℃；工厂化培养试验在本实验室微藻试验合作基地进行，养殖池呈跑道型，盖有塑料薄膜，面积为380 m2，藻液的平均深度30 cm，平均流速5 m/min。当藻液的OD560接近0.8时，用孔径约50 μm的滤网过滤采收与清洗藻体，并沥至自然不滴水时，将藻泥直接用螺杆泵上样，电动高速离心式喷头雾化，在EPWG-200型喷雾干燥器中干燥，进口和出口温度依次为170 ℃和80 ℃[4-5]。
1.2.2 生物量测定：: 参照文献[9]，利用Ultrospec 2000紫外-可见分光光度计(瑞典)测定藻液在波长560 nm处的光密度值OD560，反映生物量。
1.2.3 诱变处理及突变体筛选：: 诱变处理及突变体筛选参照汪志平等[10]、崔海瑞等[11]的方法进行。将5 mL处于对数生长期、OD560约0.5的钝顶螺旋藻ZJU0115藻液中的藻丝，用组织匀浆-离心沉降法制备成原生质球，先以0.6% EMS处理30 min，再用剂量率为15 Gy/min的60Co γ射线辐照160 min后，转入盛有50 mL Zarrouk’s培养液的250 mL三角瓶中培养；待藻液见绿后，缓慢加入25 mL含0.06%黄原胶的Zarrouk’s培养液，充分摇匀后，静置培养3–5 d；连续光照培养4 h后，用吸管轻轻吸取悬浮且分散于液面的藻丝，用毛细吸管显微分离法[12]挑取螺距和直径均匀、长度≥300 μm、墨绿、健壮的藻丝单体，分别置于盛有0.5 mL Zarrouk’s培养液的1.5 mL Eppendorf管中培养；待藻液见绿后，转入盛有20 mL Zarrouk’s培养液的三角瓶中培养，并逐级扩大培养，直至繁育成250 mL、OD560≥1.0的藻丝群体；并从中选取生长快、上浮性和分散性好、形态均匀的，作为高沥水性钝顶螺旋藻的候选突变体。
1.2.4 藻体蛋白质和多糖含量测定：: 蛋白质含量采用凯氏定氮法测定(GB/T 6432-1994)；多糖含量测定参照文献[9]测定；胞外粗多糖提取与检测参照尤珊等[13]的方法进行。
1.2.5 显微形态、超微结构及随机扩增多态性DNA标记(RAPD)分析：: 参照李晋楠等[14]和Wang等[15]的方法，利用OLYMPUS BX53光学显微镜(日本)进行藻丝形态学分析；利用AMRAY KYKY- 1000B扫描电子显微镜(中国)进行藻丝表观超微结构分析；利用MGL96G梯度PCR仪(日本)进行RAPD分析。所用的23条随机引物购自上海生工Sangon (Canada)生物工程技术服务有限公司，编号依次为S24、S33、S38、S40、S53、S58、S59、S64、S65、S66、S67、S69、S73、S78、S80、S82、S83、S88、S90、S99、S112、S118、S119。参照郭亚华等[16]的方法，利用JEM-1200 EX透射电子显微镜(日本)进行藻细胞超微结构分析。
1.3 数据处理 采用SPSS 11.0对形态学参数、生产性状指标等，进行数理统计及差异显著性分析。
2 结果和讨论 2.1 高沥水性螺旋藻候选突变体的筛选 将钝顶螺旋藻ZJU0115藻丝(图 1)先制备成直径约6 μm、呈球体或椭球体的原生质球(图 1 S)，再经0.6%的EMS和2.4 kGy的60Co γ射线复合诱变处理。培养30 d后，从含0.02%黄原胶的藻液中，分离到176条形态均匀、长度≥300 μm、墨绿、健壮的藻丝单体，其中的103条经68–73 d逐级扩大培养后，繁育成250 mL、OD560达1.0以上藻丝群体，并从中选取3个生长快、上浮性和分散性好、形态均匀的，作为高沥水性钝顶螺旋藻的候选突变体，记为M1–3，它们的形态学特征如图 1和表 1所示。与亲本ZJU0115相比，M1–3藻丝的螺旋数、藻丝长均明显变小；M1和M3藻丝的螺距分别显著变大和变小，M2的变化不显著。同时，M1–3三者间，螺距呈显著差异，M1的是M3的近2.3倍；M1的螺旋数与M2和M3的呈显著差异；M3的藻丝长与M1和M2的呈显著差异。
 |
| 图 1 亲本ZJU0115及其原生质球S、候选突变体M1–3的光学显微形态 Figure 1 The optic micromorphology of parent ZJU0115 and its spheroplasts S and candidate mutants M1–3. ZJU0115 and M1–3: Bar=100 μm; S: Bar=10 μm. |
| 图选项 |
表 1. 候选突变体M1–3及其亲本ZJU0115的形态学参数 Table 1. The morphological parameters of candidate mutants M1–3 and its parent ZJU0115
| Strains | Helix number | Filament length/μm | Pitch/μm |
| ZJU0115 | 10.0+0.8 A | 700.7+81.6 A | 72.1+2.9 A |
| M1 | 3.4+0.5 B | 374.8+51.0 B | 122.2+6.3 B |
| M2 | 6.0+0.8 C | 373.1+57.7 B | 70.9+1.1 A |
| M3 | 5.8+0.8 C | 304.6+43.8 C | 54.0+2.3 C |
| *: The data is average of 100 replicates. In the same column, values with different superscripts mean significant difference at 0.05 level. | |||
表选项
螺旋藻由成熟藻丝形成藻殖段，进行无性繁殖[4]。上述候选突变体M1–3，均由其亲本ZJU0115的原生质球(图 1 S)经化学和物理因子复合诱变后，长成的藻丝单体繁殖而来，经1年多、30多次转接传代的藻丝群体，它们各自的形态学特征一致且稳定，也未出现嵌合体或回复突变体。与其他生物一样，形态学特征也是螺旋藻分类与种质鉴定最基本的依据[4, 15, 17-18]。从上述候选突变体M1–3的形态学特征和相对其亲本ZJU0115发生了显著变化且能稳定生长繁衍的事实推测，M1–3很可能是在遗传水平上发生变异的突变体。同时，包括作者在内的众多研究者[4-5, 9, 13]在实验室研究与生产实践中均发现，当螺旋藻生长至OD560超过0.8时，藻丝分泌到培养液中的胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)会明显增多。这些分泌物不仅增大了藻液粘稠度，会使藻体的上浮性能降低且易于聚结成团，严重影响藻体对光能和营养物质的有效利用，而且还会堵塞滤布的网孔，致使藻体过滤采收困难，并显著增大藻泥的持水量。在实际生产中，基于时效、产量、成本等多重考虑，一般会在藻液OD560接近0.8时即进行采收[4-5]。本文在高沥水性候选突变体的筛选体系中加入的黄原胶，是一种由假黄单胞菌属发酵产生的EPS，具有很好的水溶性及耐酸、碱、盐等特性，在食品、医药等行业广泛用作多种目的的增稠剂、稳定剂和加工铺助剂[19]。实验表明，在螺旋藻液中加入0.02%黄原胶，对藻体上浮性和分散性等方面的影响程度，与藻液OD560≈1.0时藻体分泌的EPS的相当。本文尝试用黄原胶使经诱变处理藻液中粘结性强的藻丝聚结成团、生长受阻，而将粘附性弱、分散性好、能自身趋光浮游至液面的藻丝筛选出来。所选出的M1–3，当OD560超过1.0时，它们的藻丝仍能分散并上浮于液面，与其亲本ZJU0115明显不同。因此，M1–3可望成为具高效沥水性能的钝顶螺旋藻候选突变体。
2.2 高沥水性螺旋藻候选突变体的工厂化培植试验 为进一步考察高沥水性螺旋藻候选突变体M1–3的沥水性能、产量和遗传稳定性等生产性状，于2017年5月–12月对M1–3及其亲本ZJU0115作了8个月的工厂化培植试验，每月采收2次共16次，测定每次的干燥100 kg藻泥柴油消耗量、干燥100 kg藻泥收获干藻粉量、干藻粉产量、干藻粉多糖和蛋白质含量、分泌至藻液的EPS含量。由表 2可知，与ZJU0115相比，干燥100 kg M1–3藻泥的柴油消耗量均无显著变化，但收获的干藻粉量依次增加了89.5%、98.2%、73.7%，也即藻泥的持水率依次下降了5.4%、5.9%、4.4%；M2的产量略有增加，而M1和M3依次下降了21.5%和18.5%；M1–3藻粉的多糖和蛋白质含量均无显著变化，但EPS含量则依次下降了32.4%、29.7%和24.3%。
表 2. 候选突变体M1–3及其亲本ZJU0115在工厂化培植中的生产性状 Table 2. Production traits of candidate mutant M1–3 and its parent ZJU0115 in large-scale cultivation
| Strains | ZJU0115 | M1 | M2 | M3 |
| Consumption of diesel oil/100 kg Spirulina sludge/L | 4.5±0.3 A | 4.7±0.4 A | 4.6±0.2 A | 4.5±0.4 A |
| Dried powder/100 kg Spirulina sludge/kg | 5.7±0.4 A | 10.8±0.3 B | 11.3±0.3 B | 9.9±0.2 B |
| Production of dry algae powder/[g/(m2·d)] | 6.5±1.4 A | 5.1±1.6 B | 6.7±1.2 A | 5.3±1.5 B |
| Polysaccharide content in algae/% | 6.4±1.9 A | 6.2±1.6 A | 6.5±1.2 A | 6.9±2.1 A |
| Protein content in algae/% | 57.2±3.6 A | 56.6±2.9 A | 57.8±3.2 A | 56.7±2.5 A |
| Extracellular polysaccharide content/(mg/L) | 3.7±0.6 A | 2.5±0.4 B | 2.6±0.5 B | 2.8±0.8 B |
| *: The data is average of 16 replicates. In the same line, values with different superscripts mean significant difference at 0.05 level. | ||||
表选项
蛋白质含量是螺旋藻、小球藻等微藻产品的重要质量技术指标，一般要求达到干藻重的50%以上；螺旋藻多糖是一类能显著提高人及畜禽和水产动物免疫力、抗病力等功效的生物活性物质，其含量一般占干藻重的4%–9%，也是衡量螺旋藻粉品质的重要指标[1, 4-5, 9]。由表 2可知，3个候选突变体M1–3藻体的蛋白质和多糖含量，均符合螺旋藻产品的基本质量技术指标。值得注意的是，截止M1–3采收时，分泌到培养液中的EPS比ZJU0115的下降了24%–32%。EPS是螺旋藻培植生产中不能有效采收、增大藻体采收难度和藻泥持水率的副产物，EPS分泌量的显著下降，正是M1–3藻泥大幅降低持水率的主要原因。M1–3的藻丝长虽比其亲本ZJU0115的短一半左右(表 1)，但均大于生产上普遍要求的下限300 μm，因而从产量、蛋白质含量等主要指标看，它们均可用于工厂化生产。而综合考虑采收效率、产量和干燥成本等因素，以M2为高沥水性的钝顶螺旋藻新品系为最佳，记之为ZJU0115(HD)。近10多年来，螺旋藻等经济微藻的生产技术与装备得到了很大发展。如将喷雾干燥器的上样泵由诺莫泵改为螺杆泵，雾化器喷头由气动式改为电动高速离心式，使进样藻泥的允许含固量至少提高了5%，即含固量高达15%的藻泥可直接进样干燥。由表 2可知，100 kg含固量为11.3%高沥水性钝顶螺旋藻新品系ZJU0115(HD)的藻泥，直接用螺杆泵上样、电动高速离心式喷头雾化干燥所得干藻粉的量，是100 kg含固量为5.7%的亲本ZJU0115的1.98倍，而二者的柴油消耗量相当。可见，ZJU0115(HD)藻粉的干燥能耗仅为ZJU0115等普通生产种的一半。2018年对ZJU0115(HD)所作800余亩的培植生产结果(未列出)表明，其形态、产量、适应性、沥水性、生化组成等生产性状均保持稳定。此外，作者还注意到，在半连续式生产后期，ZJU0115(HD)的藻液比ZJU0115等普通生产种的更澄清、流动性更好，且泡沫及杂菌和轮虫等污染生物也更少。这很可能与ZJU0115(HD)分泌到培养液中的胞外多糖含量大幅度减少相关。因此，进一步加大ZJU0115(HD)的研究与推广应用，有助于切实推进当前螺旋藻产业迈向高效、节能、绿色、环保发展的新阶段。
2.3 ZJU0115(HD)的超微结构解析 如图 2-A所示，在扫描电子显微镜下，高沥水性新品系ZJU0115(HD)与其亲本ZJU0115相比，藻丝表面更光滑，且藻丝间隙区几乎没有如箭头所指的乳白状粘附物。在扫描电子显微镜下，如图 2-B箭头所指，ZJU0115(HD)细胞内多磷酸盐颗粒呈弥散状、直径小于0.12 μm，而ZJU0115中的多磷酸盐颗粒大多聚集成块分布于细胞中央，直径可达0.53 μm。
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| 图 2 ZJU0115(HD)及其亲本的扫描和透射电子显微形态 Figure 2 The scanning and transmission electron microscopic morphology of ZJU0115(HD) and its parent. |
| 图选项 |
与大多数蓝藻一样，螺旋藻细胞外层具鞘(sheath)，其厚薄会因物种、温度等不同而存有差异；鞘的化学性质至今不甚清楚，但至少有一部分松懈的包裹物，可能是酸性多糖[4, 9]。高沥水性新品系ZJU0115(HD)藻丝外鞘不如其亲本ZJU0115的明显，且可能为酸性多糖的乳白状粘附物也更少，有利于减小藻体表面的粘性，且分泌到藻液中的EPS也更少。这一超微结构特征与表 2中ZJU0115(HD)的持水率、EPS含量均显著低于ZJU0115的结果相吻合。至于ZJU0115(HD)和ZJU0115细胞内多磷酸盐颗粒的聚集状态、大小、分布等显著差异是否与藻泥的沥水性能等相关，还需作专门探索。
2.4 ZJU0115(HD)的RADP分析 以ZJU0115(HD)及其亲本ZJU0115的基因组DNA为模板，S24等23条对螺旋藻DNA作PCR具清晰电泳条带、明显多态性的10-mer寡核苷酸为随机引物，进行RAPD (randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)分析，以检测ZJU0115(HD)与ZJU0115在分子遗传水平的差异性。如图 3所示，除S90扩增产物的电泳图谱中ZJU0115(HD)比ZJU0115少了1条约590 bp的条带，S58、S83、S67、S66、S65和S64等其他22条引物对ZJU0115(HD)和ZJU0115扩增的电泳条带均相同。
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| 图 3 ZJU0115(HD)及其亲本ZJU0115的RAPD电泳图谱 Figure 3 RAPD electrophoresis map of ZJU0115(HD) and its parent ZJU0115. M: DNA marker; 1: ZJU0115(HD); 2: ZJU0115; CK: control. |
| 图选项 |
RAPD技术可以简便、灵敏地检测基因组DNA的多态性，已广泛应用于包括螺旋藻在内许多生物的分子标记与鉴定及分类学研究[14-15, 20-21]。虽有****指出RAPD方法的灵敏度高而重复性较差，但我们经多次重复试验表明，RAPD结果的重复性主要与实验条件和操作者熟练程度等有关。只要操作熟练，保持反应条件、反应体系所用的试剂来源和浓度一致，并确保反应程序中各环节和各参数的稳定性，重复的结果是不难得到的。此外，对实验中可能出现的假阳性条带给统计分析带来干扰的问题，可通过设置阴性对照(图 3)、改善反应条件或增大样本分析数目等方法来解决。
3 结论 本实验室已将RAPD技术成功用于螺旋藻的种质鉴定与分类学等研究[14-15]。图 3中23条有效引物对ZJU0115(HD)和ZJU0115的扩增产物仅1条有显著的多态性差异，而其他的则完全一致，既反映了ZJU0115(HD)和ZJU0115分子遗传背景的高度统一性，又表明ZJU0115(HD)确为ZJU0115在DNA水平发生变异的突变体。目前我们正借助螺旋藻基因组序列等新近研究成果[22-23]，从上述RAPD差异条带序列分析及相关基因克隆等方面开展研究，以明确ZJU0115(HD)突变位点并阐明其高沥水性能及超微结构和EPS含量等发生变化的分子机理。
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