刘亮, 刘佳文, 王若楠, 张瑜, 李宝珍, 袁红莉
中国农业大学生物学院, 农业生物技术国家重点实验室, 农业部土壤微生物学重点实验室, 北京 100193
收稿日期：2020-05-07；修回日期：2020-08-17；网络出版日期：2020-10-21
基金项目：农业生物技术国家重点实验室开放研究重点课题（2018SKLAB6-28）
作者简介：袁红莉, 博士, 教授, 博士生导师, 农业生物技术国家重点实验室固定研究人员。主要致力于纤维素、木质素和褐煤等生物质的微生物降解、转化、利用以及微生物肥料等应用基础研究。通过对典型系统中关键蛋白的水解模式和和蛋白间水解协作机制进行研究, 解析了多个包括细菌和真菌在内的生物转化系统; 在此基础上开发了具有商业化潜力的辅助酶系, 用于提高商业纤维素酶的转化效率; 从底物利用、营养互馈和空间占位等多个层面揭示天然菌群中不同物种在转化木质纤维素过程中的新型种间协作机制, 为木质纤维素的高效转化奠定了一定的理论和应用基础。获得农业部中华农业科技奖3项, 教育部科学技术奖1项, 国土资源部科学技术奖1项。主持或参加完成10多项国家及省部级科研项目, 发表文章70多篇, 其中在Biotechnol Biofuels, Bioresour Technol, Appl Environ Microbiol, Microb Cell Fact等杂志上发表SCI收录文章60多篇, 获得授权发明专利二十余项.
*通信作者：袁红莉, Tel/Fax:+86-10-82733349;E-mail:hlyuan@cau.edu.cn.
摘要：[目的] 分析鉴定高效木质纤维素降解菌群EMSD5来源的新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶44884，解析催化域间的协同关系，以及碳水化合物结合模块（CBM）对催化域特性的影响，拓展对该类双功能酶的认识，为甘露聚糖酶的升级改造和应用提供依据。[方法] 通过大肠杆菌异源表达甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶44884，并构建截短和定点突变的突变体，利用TLC和DNS法比较野生型和突变体的酶学性质。[结果] 成功对44884全长和突变蛋白进行克隆表达，并发现44884中2个催化域能够彼此促进各自产物的释放，而且以双功能酶形式存在时，这种促进效果更为明显。44884中的2个CBM65均有甘露聚糖和结晶纤维素结合活性，且CBM65的存在并不改变甘露聚糖酶和乙酰酯酶的最适反应条件和水解模式。虽然CBM65显著降低了2个催化域的热稳定性，但水解天然底物时，2个CBM65对各自临近催化域的水解具有明显的促进效果。[结论] 本研究首次发现并探究了新型甘露聚糖酶和乙酰酯酶形成的双功能酶44884的功能，解析了催化域之间高效的协同效应，以及新型甘露聚糖结合模块CBM65对双功能酶水解的促进作用。
关键词：双功能酶甘露聚糖酶乙酰酯酶结构域协同碳水化合物结合模块
Functional characterization of a novel bifunctional mannanase-acetyl esterase focusing on the synergistic mechanism between different domain
Liang Liu, Jiawen Liu, Ruonan Wang, Yu Zhang, Baozhen Li, Hongli Yuan
State Key Laboratory of Agrobiotechnology, Key Laboratory of Soil Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Received: 7 May 2020; Revised: 17 August 2020; Published online: 21 October 2020
*Corresponding author: Hongli Yuan, Tel/Fax: +86-10-82733349; E-mail: hlyuan@cau.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Project for Extramural Scientists of State Key Laboratory of Agrobiotechnology (2018SKLAB6-28)
Abstract: [Objective] A novel bifunctional mannanase-acetyl esterase 44884 from lignocellulose-degraded consortium EMSD5 was investigated, including its interdomain synergism. The effect of carbohydrate-binding module (CBM) on the properties of catalytic domain was also studied, to provide references for improving and applying bifunctional enzymes. [Methods] Mannanase-acetyl esterase 44884 and its truncated mutants, as well as site-directed mutant were expressed in E. coli. The differences in the enzymatic properties of the wild type strain and mutants were evaluated by thin-layer chromatography (TLC) and dinitrosalicylic acid (DNS) assay. [Results] Mannanase-acetyl esterase 44884 and its mutants were successfully overexpressed in E. coli. The mannanase domain and acetyl esterase domain showed synergistic effect, and mannanase-acetyl esterase 44884 showed higher production of reducing sugars and acetic acid than the combination of mannanase domain and acetyl esterase domain. Two CBM65 from mannanase-acetyl esterase 44884 could bind mannan and Avicel, and not change the optimal conditions of catalytic domains. Although two CBM65 significantly decreased the thermostability of catalytic domain, they specifically improved the natural substrate hydrolysis of their adjacent catalytic domains. [Conclusion] The synergistic action between different domain of mannanase-acetyl esterase 44884 was illustrated, in which two CBM65 could improve the mannan hydrolysis of mannanase-acetyl esterase 44884 by binding to substrate.
Keywords: bifunctional enzymesmannanaseacetyl esteraseinterdomain synergismcarbohydrate binding module
木质纤维素储量丰富且廉价的特性使其成为生产生物质能源和其他生物基产品的重要原料，但木质纤维素复杂的组分和特殊的抗降解结构仍然是目前酶解转化面临的巨大挑战[1]。其中半纤维素通过结合纤维素和木质素而对水解造成的阻碍是目前行业中面临的重大难题，因此，越来越多的研究通过挖掘高效的半纤维素酶制剂来促进商业纤维素酶的水解效率[2-4]。甘露聚糖是半纤维素的重要组分之一，其在木质纤维素中的占比能够达到15%–25%[5]。甘露糖通过β-1, 4-糖苷键连接形成主链结构，部分甘露糖可被葡萄糖单元取代或者发生半乳糖和高达20%–30%的乙酰化修饰[6-7]，这种侧链修饰极易对水解酶形成空间位阻，影响酶与底物的结合，水解效率下降和甘露糖的可发酵性[8]。利用预处理技术去除甘露聚糖及其侧链结构，提高木质纤维素的酶解效率是目前研究的普遍方法，但考虑到甘露聚糖较高的含量，以及对木质纤维素全组分高效转化的需求，最大化包括甘露聚糖在内的半纤维素的利用是目前生物质转化产业的重要目标。酶法转化甘露聚糖组分不仅可以提高木质纤维素的降解性，而且甘露寡糖等水解产物作为益生元可以进一步提高木质纤维素的商业价值[9]，是半纤维素资源高值、绿色转化的有效手段。
内切甘露聚糖酶是一类能够水解不同甘露聚糖主链的酶类，根据蛋白序列的相似性和结构特征，甘露聚糖酶主要分布在4个糖苷水解酶(glycosyl hydrolase，GH)家族，分别为GH5、26、113和134[10]，大部分集中于GH5和26家族。目前甘露聚糖水解转化的研究更多聚焦于主链的降解以及半乳糖侧链形成的位阻效应[11]，但乙酰基团在甘露聚糖水解过程中造成的阻碍作用却未获得足够的关注。在木聚糖的降解中，乙酰基团的去除能够同时促进木聚糖主链的水解[12]，而且该水解过程可以由木聚糖酶和酯酶形成的双功能酶一步完成[13-14]，然而同时包含甘露聚糖酶和乙酰酯酶催化域的双功能酶仍未见报道，其结构域间的协同模式仍有待进一步揭示。此外，基于对Cellvibrio属来源的甘露聚糖酶的分析，发现GH26家族甘露聚糖酶可能偏向于水解可溶性甘露聚糖，而GH5家族的甘露聚糖酶则更偏向于水解不溶性甘露聚糖[15-16]，这也暗示细菌来源的GH5家族甘露聚糖酶在木质纤维素水解转化中可能具有更高的实际应用价值。但是目前甘露聚糖酶促酶解研究几乎都集中于Trichoderma reesei[17]和其他真菌[18]来源的酶，而针对细菌来源的GH5家族的甘露聚糖酶的研究依然很少。
除了包含多个催化域，大量细菌来源的多功能酶同时含有多个碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module，CBM)[19-20]，并承担重要功能。高效双功能酶CelA中包含3个CBM (GH9-CBM3-CBM3-CBM3-GH48)，并发挥不同功能，其中2个CBM表现出极强纤维素结合能力，而另一个主要发挥辅助功能。当3个CBM同时存在时，该酶能够从主要水解底物表层转变为向深层降解，在底物中形成大量空腔结构[21]。Gavrilov等[22]将来源于Thermococcus sp.的多催化域酶MDG中的2个CBM3截掉后，发现该酶对葡聚糖、微晶纤维素、甘露聚糖和木聚糖的催化能力均显著下降。由此可见，多CBM在促进多催化域酶与底物的结合、改变酶的作用方式、提高酶的活性层面都发挥了重要作用，在木质纤维素的转化中具有巨大的应用潜力。细菌来源的甘露聚糖酶大部分携带一个或多个CBM，但是多CBM在甘露聚糖酶及其构成的双功能酶中所发挥的功能仍然不明确，这也限制了高效甘露聚糖酶制剂的开发与应用。
本实验室前期从自然环境中富集得到了一个高效且稳定的木质纤维素降解菌群EMSD5[23]。宏基因组和蛋白组分析结果表明该菌群中含有大量多催化域酶和多CBM酶，以秸秆为唯一碳源诱导菌群时，发现一个包含甘露聚糖酶催化域、酯酶催化域和2个CBM65结构的多功能酶44884始终处于高表达的状态，暗示其在天然甘露聚糖转化过程中的重要作用。本文对该双功能酶进行异源表达，并通过构建截短和突变蛋白研究两个催化域间的协同关系，以及2个CBM65对2个催化域的影响。这也是首次报道包含甘露聚糖酶催化域的双功能酶，并揭示了不同催化域间的协同作用和多CBM在该双功能酶中的功能，为高效多功能酶的构建及酶制剂的人工复配提供了实验和理论基础。
1 材料和方法 1.1 主要实验材料 棕榈粕由中国科学院过程工程研究所韩业君研究员惠赠，并进行汽爆处理[24]；油松采集自中国农业大学校园，粉碎后过50目筛，于60 ℃烘干备用。槐豆胶(locust bean gum，LBG)、瓜尔胶(guar gum，GG)、乙酸对硝基苯酯(4-nitrophenyl acetate，pNPAc)购自Sigma公司。魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)购自合肥博美生物科技有限责任公司。乙酰化魔芋葡甘聚糖A-KGM的制备如文献[7]所述。TLC Silica gel 60 F254购自Merck KGaA公司。Escherichia coli DH5α和Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司。原核表达质粒pET-30a(+)由本实验室保存。细菌菌群EMSD5由本实验室保存。
1.2 重组蛋白的表达及纯化 以EMSD5基因组DNA为模板，利用特异性引物(表 1)，扩增目的片段，连接至pET-30a(+)，构建重组质粒。将含有正确目的片段的重组质粒转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达后收集菌体，采用超声破碎法获取胞内目的蛋白，进一步采用Ni柱亲和层析法对胞内上清液进行纯化，得到重组蛋白。蛋白浓度按照5×Bradford Protein Assay Reagent说明书进行测定。
表 1. 引物名称和序列 Table 1. Primers used in this study
| Names | Sequences (5′→3′) |
| 44884-F1 | CGCGGATCCGCAACAGGTACAGCCGCTGGTTTCC |
| 44884-F2 | CGCGGATCCACTTTTATGCCTTCTTCC |
| 44884-F3 | CGCGGATCCCAAGAGTCAAAGGTACC |
| 44884-F4 | CGCGGATCCGGAACATTAAAAGCGCAGAC |
| 44884W362A-F | TGCATCTGCAGCGACAGATGTATTATCTTTCACAACTGTA |
| 44884-R1 | CCGCTCGAGCCAGCCCATAACATCTTTGATATAT |
| 44884-R2 | CCGCTCGAGATAGTCTGCTGACTCTAAT |
| 44884-R3 | CCGCTCGAGATAATCAAATGATTTTAA |
| 44884-R4 | CCGCTCGAGAAAAACAGAACAGATATTAG |
| 44884W362A-R | GATTTATTACCACTGA |
表选项
1.3 酶学特性的测定 甘露聚糖酶活性测定：用0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.5)配制0.4% (W/V) KGM底物，按以下体系进行反应：底物(90 μL)，适当稀释的酶液(10 μL)；涡旋混匀后于50 ℃准确反应5 min，加入300 μL DNS试剂终止反应，混匀后短暂离心。沸水浴5 min显色，用冰水混合物终止反应。加入800 μL水稀释，混匀，13523×g离心1 min，测量上清液的OD540。根据标曲计算还原糖释放量和酶活。
酯酶活性测定：称取0.0181 g pNPAc，用1 mL乙醇溶解后取100 μL加入到7.9 mL 0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中作为底物工作液。按照以下体系进行反应：950 μL底物，适当稀释的酶液(50 μL)，涡旋混匀后于50 ℃准确反应15 min，测量溶液的OD405。根据标曲计算pNP释放量和酶活。
最适温度的测定：用最适pH缓冲液配制底物溶液和酶溶液，在梯度温度条件下测量酶活性，确定最适温度。
最适pH的测定：配制梯度pH值的底物溶液和酶溶液。在酶最适反应温度条件下测量酶活性，确定最适pH。
温度稳定性的测定：将酶溶液置于50 ℃条件下酶孵育不同的时间后，在最适条件下测量酶活性。
1.4 酶动力学参数的测定 用最适pH值的缓冲液配制0.1%–1.0% (W/V)的底物溶液，在最适温度条件下测量酶活。利用双倒数作图法计算Km和kcat。
1.5 水解产物的TLC分析 用去离子水配制0.5% (W/V)的底物溶液和400 nmol/L的酶溶液。底物和酶溶液各5 μL，充分混匀后反应0.5 h。反应结束后取6 μL点样至硅胶板上，按文献所述方法进行显色[25]。
1.6 CBM65的底物结合实验 利用亲和电泳的方法检测CBM65对可溶性底物的结合能力。蛋白总上样量5 μg，以等量BSA作为对照样品。冰浴电泳后染色并脱色，观察蛋白条带在无底物和含底物胶上的迁移。计算各蛋白相对于BSA的迁移率Rf (Rf =目的蛋白条带与分离胶上沿距离/BSA条带与分离胶上沿距离)；计算蛋白在含底物胶上的Rf与无底物分离胶上Rf的比值Rs (Rs =目的蛋白在含底物分离胶中的Rf/无底物对照分离胶中的Rf)，Rs > 0.95时认为该蛋白与相应底物无结合能力，标记为“–”；0.95≥Rs＞0.8时认为该蛋白与相应底物具有弱结合能力，标记为“+”；0.8≥Rs＞0.2时认为该蛋白与相应底物具有中等结合能力，标记为“++”；Rs≤0.2时认为该蛋白与相应底物具有强结合能力，标记为“+++”。
1.7 天然底物及乙酰魔芋葡甘聚糖水解实验 天然底物水解反应的总体系为1 mL，底物为20 mg，酶量为4000 nmol/L (终浓度)，于37 ℃、200 r/min孵育24 h。乙酰魔芋葡甘聚糖(A-KGM)水解反应的总体系为1 mL，底物为4 mg，酶量为100 nmol/L (终浓度)，于50 ℃孵育5min。15871×g离心5 min，利用DNS法测量上清液的还原糖浓度。
乙酸产量测定：取样于18407×g离心5 min，取100 μL上清液用2 mol/L的HCl (记下体积)调节pH至2后用0.22 μm滤器过滤。取20 μL滤液上样，利用HPLC测定样液中乙酸根浓度，条件如下：色谱柱(MARS MOA保护柱，MARS MOA 10 U，50 mm×7.8 mm)，流动相(2.5 mmol/L H2SO4)，流速(0.6 mL/min)，柱温60 ℃，数据采集时间(20 min)。根据乙酸标准曲线计算样品中乙酸根浓度，再根据所加HCl体积折算反应体系中的乙酸产量。
2 结果和分析 2.1 重组蛋白r44884及其截短蛋白的异源表达 利用dbCAN数据库对44884蛋白各结构域进行注释，结果表明该蛋白从N端到C端依次是GH5甘露聚糖酶催化域、2个CBM65结构域(CBM65-1/2)和CE2乙酰酯酶催化域(图 1)。为了深入研究该蛋白的功能以及各模块间的协同关系，对不包含信号肽的基因片段进行扩增，在C端融合组氨酸标签后在大肠杆菌表达系统中对全长和突变蛋白进行异源表达。
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| 图 1 44884全长及截短蛋白模块结构展示 Figure 1 Domain organization of 44884 and its truncated mutants. M: the catalytic domain of mannanase; C: the domain of carbohydrate-binding module; E: the catalytic domain of esterase. |
| 图选项 |
2.2 44884中甘露聚糖酶结构域和乙酰木聚糖酯酶结构域的协同作用 双功能酶在共同进化的过程中，往往能够在不同催化域间形成高效的协同效应，相较于单功能酶，能够表现出更高的酶解效率。本研究通过制备乙酰化的甘露聚糖底物(acetylated konjac glucomannan，A-KGM)分析了44884内部2个催化域间的协作关系。如图 2-A所示，r44884-WT作用于A-KGM后，还原糖含量达到376 μg/mL，而当r44884-MC水解底物时，还原糖的产量仅能达到170 μg/mL，表明乙酰酯酶催化域的存在对于还原糖的释放至关重要，并推测其能够水解底物上的乙酰基团，促进甘露聚糖酶结构域与底物的结合，从而提高酶解效率。将酯酶催化域r44884-CE补充到r44884-MC水解体系中时，还原糖的释放显著提高，但仍然难以达到r44884-WT的水平，说明甘露聚糖酶和乙酰酯酶同时游离存在时仍不足以应对复杂的底物结构，只有形成双功能酶才能充分发挥结构域间的协同作用。此外，研究还发现这种促酶解效果是双向的，甘露聚糖酶催化域的存在同样能够促进乙酰酯酶的酶解，而这两种结构域相互游离存在时所释放的乙酸量同样无法达到r44884-WT的水平(图 2-B)。
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| 图 2 r44884-WT及其截短蛋白水解A-KGM的还原糖 Figure 2 The release of reducing sugar (A) and acetic acid (B) from A-KGM hydrolyzed by r44884-WT and its mutants. |
| 图选项 |
2.3 CBM65底物结合能力分析 在木质纤维素降解酶中，CBM的主要作用是通过与底物的特异性结合将酶富集在底物表面，增加局部酶浓度，从而提高催化域的降解效率[26]。本研究利用亲和电泳分析了44884中2个CBM65与不同底物的结合能力。结果如表 2所示，2个CBM65无法与榉木木聚糖(beechwood xylan)和无定形纤维素类底物(CMC和β-glucan)结合。但均对甘露聚糖底物LBG表现出一定的结合能力，这与44884中甘露聚糖酶催化域GH5的功能相一致。GG和LBG的主要成分同为半乳甘露聚糖，但GG中半乳糖侧链含量更高[27]，在本研究中的2个CBM都无法与GG相结合。进一步研究发现，2个CBM65对于KGM的结合能力存在差异，其中CBM65-1无法与KGM结合，而CBM65-2与KGM具有一定的结合能力。KGM主链同样由甘露聚糖组成，并含有少量葡萄糖单元，而且几乎没有侧链。考虑到2个CBM65均无法与β-glucan结合，这表明CBM-1与甘露聚糖的结合可能需要识别少量乙酰基团，而CBM65-2与KGM的结合是通过其与甘露糖单元相结合而实现的。综上，2个CBM65的结合特性高度相似，都是具有甘露聚糖和结晶纤维素结合活性的CBM，能够将甘露聚糖酶催化域带到底物附近，促进其水解。
表 2. CBM65与不同底物的结合能力 Table 2. Binding assay of CBM65 to different substrates
| CBM65 | CMC-Na | Beechwood xylan | β-glucan | GG | LBG | KGM | Avicel |
| CBM65-1 | – | – | – | – | + | – | + |
| CBM65-2 | – | – | – | – | + | + | + |
表选项
通过蛋白序列比对分析44884的2个CBM65中参与底物结合的氨基酸残基，进一步解释其与不同底物结合的原因。Luis等[28]结合点突变和结构解析确定了来源于Eubacterium cellulosolvens的EcCBM65-1和EcCBM65-2参与β-glucan结合的关键残基分别为第21位和22位的色氨酸，但是在44884的2个CBM65中，对应位置的残基分别是丝氨酸和谷氨酸，这可能也是这2个CBM65无法结合无定形纤维素的关键。此外，EcCBM65-1第68位和EcCBM65-2第72位谷氨酸分别为参与纤维寡糖结合的关键残基，上述残基在44884的2个CBM65中也未能找到，表明这2个CBM65可能也无法结合纤维寡糖(图 3)。由于目前CBM65家族中参与甘露聚糖结合的残基尚未见报道，44884中CBM65-1和CBM65-2与甘露聚糖结合的具体机制仍有待进一步研究。
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| 图 3 CBM65家族蛋白序列比对 Figure 3 Sequence alignment of CBM65. The conserved tryptophan residues were marked under the sequence; the residues highlighted by dark blue and red were conserved amino acids; the residues marked by light blue were amino acids played a key role in binding substrate. |
| 图选项 |
2.4 44884中CBM对催化域酶学特性的影响 除了影响催化域与底物的结合，CBM还可能影响酶学特性[29-30]。通过对44884全长及其截短蛋白最适反应条件的分析，探究了CBM65对2个催化域反应温度和pH的影响，结果显示r44884-WT中甘露糖酶的最适反应温度为50 ℃，属于中温酶，最适pH为6.5，在pH 5.0–7.0能够保持70%以上的酶活力(图 4-A、B)。与全长蛋白一致，3个截短蛋白r44884-MCC、r44884-MC、r44884-M的最适反应温度和pH均为50 ℃和6.5，且酶活变化曲线也与全长蛋白相似(图 4-C、D)。上述结果表明，44884中2个CBM65的存在并不改变甘露聚糖酶催化域的最适反应温度和pH。酯酶的最适反应条件则为40 ℃和pH 7.5，且最适反应条件同样不受CBM65的影响(数据未展示)。
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| 图 4 CBM65结构域对甘露聚糖酶催化域最适反应温度和pH的影响 Figure 4 Optimal temperature and pH for mannanase activity of r44884-WT and its truncated mutants. A: The optimum temperature of r44884-WT; B: The optimum pH of r44884-WT; C: The optimum temperature of the mutants of r44884-WT; D: The optimum pH of the mutants of r44884-WT. |
| 图选项 |
为了进一步研究44884中CBM65对2个催化域热稳定性的影响，将截短蛋白r44884-MCC、r44884-MC、r44884-M、r44884-CCE、r44884-CE和r44884-E分别于50 ℃孵育一段时间，并测定其活性变化。如图 5-A所示，r44884-M在孵育5 min后，活力下降至初始值的79%，孵育60 min后，该酶活力剩余47%。而r44884-MCC和r44884-MC在孵育5 min后，酶活力显著下降，分别剩余初始活力的15%和9%，孵育30 min后，二者完全失活。r44884-MCC和r44884-MC的酶活变化曲线相似，表明临近甘露聚糖酶催化域的CBM65 (CBM65-1)的存在对甘露聚糖酶热稳定性的影响更大，同时也说明甘露聚糖酶催化域与CBM间的互作是CBM65影响酶稳定性的关键。与甘露聚糖酶不同，CBM65的存在并不会大幅影响乙酰酯酶的活性，r44884-CCE、r44884-CE和r44884-E在分别孵育10 min后，酶活分别降至初始活性的48%、54%和61%，延长孵育时间至60 min，r44884-CCE、r44884-CE和r44884-E分别保留了初始活力的5%、8%和13% (图 5-B)，即2个CBM65的存在都会降低乙酰酯酶的热稳定性，但影响比较微弱。在同一个蛋白中，CBM65对2个催化域热稳定性的影响具有明显差异，这体现了CBM功能的多样性。
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| 图 5 CBM65对(A)甘露聚糖和(B)酯酶催化域热稳定性的影响 Figure 5 The influences of CBM65 on thermostabilities of mannanase (A) and esterase (B). The statistical significance indicated by different letters of numeric value was determined through one-way analysis of variance (ANOVA) followed by LSD test (P < 0.05). The same below. |
| 图选项 |
除了探究CBM65对不同催化域最适反应条件及热稳定性的影响，本研究进一步通过在KGM和LBG两种甘露聚糖底物上测定r44884-WT及其截短蛋白的kcat/Km分析CBM65对催化域酶活力的影响。结果如表 3所示，失去GH5远端的CBM65后(CBM65-2)，并不影响甘露聚糖酶在不同底物上的kcat/Km值，说明CBM65-2对甘露聚糖催化域的催化效率无显著影响。但失去靠近GH5的CBM65 (CBM65-1)后，r44884-M在KGM和LBG上的kcat/Km值相较于r44884-MC分别提高了2.24倍和3.15倍，表明CBM65-1的存在会显著抑制甘露聚糖酶在上述两种底物上的催化效率。考虑到r44884-M的热稳定性显著高于r44884-MC (图 5-A)，因此这种活性的提高可能是由于蛋白稳定性提高引起的。为了验证这种推测，我们构建了r44884-MC的突变蛋白r44884-MC (W362A)来排除热稳定性对蛋白催化能力的影响，该突变蛋白虽然保留了CBM65-1结构域，但是CBM65-1丧失了与底物的结合能力。与r44884-MC相比，r44884-MC (W362A)在两种底物上的kcat/Km值均下降了24.4%和17.9%，表明CBM65-1的存在能够显著提高甘露聚糖酶的催化能力。
表 3. CBM65对甘露聚糖酶催化域kcat/Km值的影响 Table 3. The influence of CBM65 on the kcat/Km[L/(g·s)] of mannanase catalytic domain
| Substrates | r44884-WT | r44884-MCC | r44884-MC | r44884-M | r44884-MC (W362A) |
| KGM | 44.88±0.11a | 43.26±0.22a | 42.49±1.07ab | 95.09±3.77d | 32.11±0.42c |
| LBG | 41.29±0.73bc | 39.57±0.56c | 39.62±0.61c | 124.7±4.06f | 32.51±1.67c |
表选项
通过测定r44884-CCE、r44884-CE和r44884-E对于模式底物pNPAc的催化活性进一步分析CBM65对于酯酶活性的影响。结果表明，2个CBM65的存在均不影响乙酰酯酶对pNPAc的催化能力(表 4)，这可能是由于CBM无法与pNPAc结合，因而无法体现CBM65对酯酶催化能力的影响。值得注意的是，44884中乙酰酯酶对于pNPAc的活力处于目前文献报道的最高水平。
表 4. CBM65对乙酰木聚糖酯酶比活力(U/μmol)的影响 Table 4. . The influence of CBM65 on the specific activity (U/μmol) of acetylxylan esterase catalytic domain
| Substrate | r44884-CCE | r44884-CE | r44884-E |
| pNPAc | 2782.5±26.8a | 2724.7±26.7a | 2741.2±15.9a |
表选项
研究表明CBM的存在可能会改变催化域的水解模式[31]。为了探究44884中GH5甘露聚糖酶的水解模式和CBM65对甘露聚糖酶水解模式的影响，本文进一步探究了r44884-MCC、r44884-MC和r44884-M对不同甘露寡糖的水解情况。结果如图 6-A、B和C所示，3个蛋白分别与甘露二糖和三糖共孵育后，底物组分并无变化，表明3个蛋白均无法水解二糖和三糖。当底物为甘露四糖时，3个蛋白的产物组成主要以三糖为主，并伴有少量的二糖和单糖，表明甘露聚糖催化域与底物结合至少需要4个糖单元，且水解四糖时水解位点主要位于第3个和第4个糖单元之间，从第2个和第3个糖单元间断裂的概率较低。对于甘露五糖，3个蛋白的水解产物主要以二糖和三糖为主，同时有少量单糖和四糖，综合水解四糖时的产物组成，表明3个蛋白主要从五糖的第3和第4个糖单元间断裂糖苷键，少量蛋白从第4和第5个糖苷键间进行水解(图 6-D)。上述结果说明CBM65的存在并不改变甘露聚糖酶的水解模式，但是从2个蛋白水解甘露五糖的结果来看，r44884-MCC和r44884-MC的产物浓度要高于r44884-M，表明CBM65的存在能够提高甘露聚糖酶的催化效率，尤其是CBM65-1，这也与表 3得出的结论一致。
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| 图 6 r44884-MCC (A)、r44884-MC (B)和r44884-M (C)水解甘露寡糖后产物分析及甘露聚糖水解模式推测(D) Figure 6 TLC analyses of hydrolysis products by r44884-MCC (A), r44884-MC (B) and r44884-M (C), and the hypothetical hydrolytic pattern (D). M1: mannose; M2: mannobiose; M3: mannotriose; M4: mannotetraose; M5: mannopentaose; NRE: non-reducing end of mannan oligosaccharides; RE: reducing end of mannan oligosaccharides. |
| 图选项 |
由于天然底物的结构和组分的复杂性，基于模式底物的分析并不能准确揭示CBM在水解天然底物时的真实功能。棕榈粕是甘露聚糖含量最高的木质纤维素原料之一，可以代表甘露聚糖在天然底物中的状态。因此本研究以汽爆后的棕榈粕为底物，分析r44884-MCC、r44884-MC和r44884-MC (W362A)对其水解情况，准确探究在天然底物上CBM65对甘露聚糖水解效果的影响。如图 7所示，随着CBM65数量的增加，甘露聚糖酶水解能力逐渐提高，而且随着反应时间的延长，临近甘露聚糖酶催化域的CBM65 (CBM65-1)对于甘露聚糖酶的水解促进作用更加显著，这与上述结论相一致。
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| 图 7 CBM65对甘露聚糖酶水解棕榈粕的影响 Figure 7 The influence of CBM65 on hydrolysis of palm meal by mannanase. |
| 图选项 |
在天然底物上，CBM65对乙酰木聚糖酯酶的酶解促进效果同甘露聚糖酶。r44884-CCE和r44884-CE对于油松中乙酸的释放速率分别达到6.95 μg/(mL·h)和6.73 μg/(mL·h)，但r44884-E的乙酸释放速率仅有4.58 μg/(mL·h)，显著低于携带CBM65的乙酰木聚糖酯酶(表 5)。与甘露聚糖酶一样，临近乙酰木聚糖酯酶结构域的CBM65 (CBM65-2)对酶解的促进效果更为显著。由于在模式底物pNPAc上未观察到CBM65的促酶解效果，表明CBM65-2是通过与底物结合，增加底物上局部的酶浓度来促进酯酶的水解。
表 5. CBM65对酯酶释放油松中乙酸速率的影响[(μg·h)/mL] Table 5. . The influence of CBM65 on the release of acetic acid from pine by eaterase [(μg·h)/mL]
| r44884-CCE | r44884-CE | r44884-E |
| 6.95±0.13a | 6.73±0.17a | 4.58±0.03b |
表选项
3 讨论 甘露聚糖作为重要的生物质资源，其酶法转化受到越来越多的关注。从菌株筛选、诱变到蛋白表达、纯化，再到基因工程、蛋白质工程改造，研究人员围绕甘露聚糖酶作了大量且深入的研究。但是这些研究大部分集中于对甘露聚糖主链的水解，甘露聚糖中独特的乙酰化结构及其产生的抗酶解屏障却未获得足够的重视。在木聚糖酶研究中，乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶间的协同水解作用已被广泛报道[12-14]。在利用甘露聚糖酶水解魔芋葡甘聚糖时，乙酰酯酶的加入同样能够有效提高体系中还原糖的得率[7]，这表明甘露聚糖酶和乙酰酯酶间同样存在协同作用，但是类似的双功能酶却未见报道。此外，大部分报道的双功能酶都是细菌来源，但目前研究更多集中于真菌来源的甘露聚糖酶，这可能也是该类双功能酶研究滞后的原因之一。除了催化域本身，大部分细菌来源的甘露聚糖酶都携带有CBM，这种非催化域结构对于催化域的水解效率、模式和稳定性都有巨大的影响[26, 30]。截止到目前，数据库中已收录的与甘露聚糖结合相关的CBM分别分布在CBM16、23、27、29、35、59、62、72、76和80家族，有晶体结构解析的仅有CBM16、23、27、29、35、59、62和80家族。相较于纤维素酶和木聚糖酶的CBM，甘露聚糖酶的CBM及其对催化域影响的研究仍然稍显滞后。
本研究从前期富集的高效木质纤维素降解细菌菌群中克隆表达了一个双功能酶44884，注释结果表明该蛋白包含2个分别来源于GH5家族和CE2家族的催化域，以及2个CBM65。通过比较全长蛋白和截短蛋白对于A-KGM的水解效率，发现44884中甘露聚糖催化域和乙酰酯酶催化域具有明显的协同效应，都能促进其各自产物的释放，而且当2个催化域相互连接形成双功能酶后，这种协同效果要显著优于2个催化域同时游离存在的情况。这一结果表明细菌作为潜在的双功能酶资源库，有大量新型酶系资源和水解协同机制值得深入挖掘。甘露聚糖酶和乙酰酯酶间形成双功能酶尚属首次发现，在该双功能酶44884中甘露聚糖酶催化域的活力与目前已经报道的文献相比处于中等水平，而乙酰酯酶的活力则处于最高水平，这一结果说明在甘露聚糖酶法转化过程中，提高侧链水解酶的催化能力可能是提高甘露聚糖转化效率的关键，这也为后续甘露聚糖酶的改造和酶系间的复配提供了依据，助力木质纤维素的充分转化利用。
通过对2个CBM65结合活性的分析，发现其与甘露聚糖底物LBG和结晶纤维素具有结合能力，这也是首次发现该家族的CBM能够与甘露聚糖底物结合，其参与结合的残基仍需进一步分析，这一结果进一步丰富了数据库中与甘露聚糖结合的CBM家族。44884中2个CBM65在不影响催化域最适反应条件的情况下却降低了2个催化域的热稳定性。Meng等[32]同样发现CBM的存在会降低木聚糖酶XynA的热稳定性，但也有研究指出CBM的存在能够提高酶的稳定性，Pham等[29]在来源于Aspergillus aculeatus的甘露聚糖酶C端融合一个CBM1后，该蛋白在65 ℃孵育6 h后仍能保留70%的活力，而野生型蛋白几乎失活。可见CBM对酶学性质的影响没有明显规律可循，需要具体问题具体分析。近年来，一些研究发现CBM的存在可能会延伸催化域与底物的结合范围从而导致酶催化模式的改变。Pan等[31]发现CBM会提高酶反应的持续性，从而使得产物中高聚合度寡糖的含量明显提高。在本研究中，2个CBM65并不改变催化域水解模式，但是均能提高各自临近催化域的水解效率，即CBM65-1能够提高其临近的甘露聚糖酶的催化效率，而CBM65-2可以提高其临近的乙酰酯酶的催化效率，而且这种提升效果在天然底物中更为明显，这有利于该酶在木质纤维素转化中的实际应用。
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