翁静怡1, 步绪亮2, 徐俊2, 徐岷涓1
1. 上海交通大学系统生物医学教育部重点实验室, 系统生物医学研究院, 上海 200240;
2. 上海交通大学微生物代谢国家重点实验室, 生命科学技术学院, 上海 200240
收稿日期：2019-03-13；修回日期：2019-04-10；网络出版日期：2019-04-22
基金项目：上海交通大学“转化医学交叉研究基金”（ZH2018ZDB08）
*通信作者：徐岷涓, Tel:+86-21-34207540;Fax:+86-21-34206059;E-mail:minjuanxu@sjtu.edu.cn.
摘要：[目的] 通过基因组挖掘的方法，研究红树林来源白骨壤链霉菌Streptomyces avicenniae 9-9中多环稠合大环内酰胺（PTMs）类化合物的结构多样性。[方法] 通过生物信息学分析白骨壤链霉菌基因组序列，寻找PTMs类化合物的生物合成相关基因；利用UPLC-MS/MS技术对该菌的次级代谢产物进行分析。[结果] 在白骨壤链霉菌基因组中发现PTMs生物合成基因簇（aviA-D）；从菌液提取物中鉴定出5个PTMs类化合物，其中包括ikarugamycin（化合物1）和capsimycin B（化合物2）；基于PTMs类化合物5-6-5环类型的MS/MS碎裂规律，对化合物3-5的结构进行了推测。[结论] 红树林来源白骨壤链霉菌S.avicenniae 9-9具有产生5-6-5环类型的PTMs类化合物的能力。
关键词：红树林白骨壤链霉菌次级代谢产物多环稠合大环内酰胺生物合成
Study on polycyclic tetramate macrolactam metabolites from mangrove-derived Streptomyces avicenniae
Jingyi Weng1, Xuliang Bu2, Jun Xu2, Minjuan Xu1
1. Key Laboratory of Systems Biomedicine, Ministry of Education, Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
2. State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Received: 13 March 2019; Revised: 10 April 2019; Published online: 22 April 2019
*Corresponding author: Minjuan Xu, Tel: +86-21-34207540; Fax: +86-21-34206059; E-mail: minjuanxu@sjtu.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Fund of Shanghai Jiao Tong University (ZH2018ZDB08)
Abstract: [Objective] Based on genome mining, we analyzed the secondary metabolites from mangrove-derived Streptomyces avicenniae 9-9, targeting on polycyclic tetramate macrolactams (PTMs). [Methods] Bioinformatics analysis was carried out to analyze the genome sequence of Streptomyces avicenniae 9-9. We searched PTMs by the method of high-performance liquid chromatography and mass spectroscopy. [Results] We found four genes, named aviA-D involved in PTMs biosynthetic gene clusters in Streptomyces avicenniae 9-9. Two PTMs, 1 and 2, were identified as ikaruganmycin and capsimycin B, respectively. Compound 3 through 5 also belonged to PTMs family, and their structures were proposed based on MS/MS fragmentation pattern. [Conclusion] Mangrove-derived Streptomyces avicenniae 9-9 can produce PTMs compounds with the 5-6-5 fused tricyclic skeleton.
Keywords: mangroveStreptomyces avicenniaesecondary metabolitepolycyclic tetramate macrolactamsbiosynthesis
红树林是生长于热带和亚热带海岸潮间带的木本植物群落，是高生产力、高盐度和高湿度特征的近海生态系统中的生产者。已报道从红树林放线菌中发现的天然产物有122个，其中新天然产物有73个[1-4]，这些化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种显著的生物活性[5-6]。
多环稠合大环内酰胺化合物(polycyclic tetramate macrolactams，简称PTMs)是一类独特的天然产物。这类化合物由大环内酰胺环(macrolactam ring)和多环稠合的三环结构(carbocyclic ring)两部分组成，依据碳环的不同环合方式，可主要分为5-6-5、5-5-6、5-4-6和5-5环等四种类型[7-8]。此类化合物具有多个手性中心，结构变化多样，天然来源的新结构层出不穷。Ikarugamycin是首个被报道的PTMs类化合物，属于5-6-5环结构[9]。随后不断有PTMs类化合物被发现，如图 1所示。例如，从海洋异壁放线菌WH1-2216-6发酵产物中分离得到16-hydroxymaltophilin等6个5-5-6环PTMs类化合物[10]；从海洋来源Streptomyces pactum SCSIO 02999发现了6个新的PTMs类化合物pactamides A–F[11]；从链霉菌SCSIO 40060中分离得到3个新化合物hydroxyikarugmycins A–C[12]；通过Umezawaea sp. RD066910和Tsukamurella pulmonis TP-B0596的联合培养可以得到2个新化合物umezawamides A–B[13]；陆地来源链霉菌S10可以产生5-5环结构的化合物combamides A–D[14]；我们也从红树林源厦门链霉菌318分离得到5-6-5环系列化合物capsimycin C–D[15]。目前，共报道了50多个PTMs类化合物[8, 10-15]，发现其具有抗原生动物[9]、抗真菌[9, 16]、抗细菌[16]和抗病毒[17]多种生物活性，还可抑制多种肿瘤细胞的生长，如MCF-7、HepG2、Huh7、HL-60及PANC-1[8, 15, 18-20]，因此PTMs类化合物不仅结构多样，而且生物活性显著。
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| 图 1 近年来发现的PTMs类化合物结构 Figure 1 Chemical structures of selected PTMs compounds. |
| 图选项 |
PTMs类化合物虽然具有复杂的骨架结构，但是其生物合成途径由简洁的聚酮合成酶和非核糖体肽合成酶(PKS/NRPS)的杂合基因簇编码[8]。张长生等将链霉菌ZJ306菌株中ika基因簇导入变铅青链霉菌[21]，Antosch等将链霉菌Tue6239菌株中ika基因簇导入大肠杆菌中[22]，分别实现了PTMs类化合物ikarugamycin在异源宿主中的生物合成。这些结果显示了ikaABC这3个基因是负责PTMs骨架结构形成的充分条件，其中ikaB和ikaC基因决定了PTMs类化合物的环合方式。
此外，PTMs基因簇中还包括羟化酶(sterol desaturase)，可以对大环进行羟基修饰，将ikarugamycin转化为butremycin[23]。在前期研究中，我们测定了红树林来源的厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis 318)的全基因组序列，通过生物信息学分析预测并确定其具有合成PTMs类化合物的能力[24]。我们还发现P450细胞色素氧化酶IkaD在厦门链霉菌318中发挥环氧化和羟基化两种后修饰作用，负责ikarugamycin和capsimycin在体内的生物转化和降解[15]。
白骨壤链霉菌S. avicenniae 9-9是本课题组从福建漳江口红树林沉积物样本中分离和鉴定的新种[25]。本文通过基因组信息挖掘发现白骨壤链霉菌具有PTMs生物合成基因簇，对该菌的发酵产物进行UPLC-MS分析，通过MS/MS方法对白骨壤链霉菌中多个PTMs类化合物的结构类型进行快速判断。
1 材料和方法 1.1 实验材料
1.1.1 菌株: 本研究使用的白骨壤链霉菌9-9菌株保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，索取号MCCC 1A01535 (=NRRL B-24776)。
1.1.2 培养基: 固体平板培养基(g/L)：燕麦粉20，琼脂18，FeSO4·7H2O 0.001，MnCl2·4H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，pH 7.3。种子培养基TSB：胰蛋白胨大豆肉汤30 g/L。发酵培养基GYM培养基(g/L)：葡萄糖4，酵母提取物4，麦芽提取物10，pH 7.3；ISP3培养基(g/L)：燕麦粉20，FeSO4·7H2O 0.001，MnCl2·4H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，pH 7.3；ISP4培养基(g/L)：可溶性淀粉10，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 1，NaCl 1，(NH4)2SO4 2，CaCO3 2，FeSO4·7H2O 0.001，MnCl2·4H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，pH 7.3。1×105 Pa灭菌30 min。痕量元素溶液组成为FeSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，0.2 μm滤膜过滤除菌，获得无菌痕量盐溶液，接种前再分别加入到培养基中。
1.1.3 试剂: 甲醇、乙酸乙酯，购自上海凌峰化学试剂公司；色谱级乙腈(Acetonitrile，ACN)、三氟乙酸(TFA)，购自Sigma-Aldrich公司；ZORBAX Extend-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，购自Agilent公司。化合物标准品ikarugamycin和capsimycin B是本课题组前期从厦门链霉菌318的发酵产物中分离得到[15]。
1.1.4 仪器: 隔水式恒温培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；恒温培养摇床，购自上海智诚仪器设备有限公司；旋转蒸发仪，购自日本EYELA东京理化器械株式会社；模块化高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography, HPLC)，购自日本Shimadzu公司；液质联用ACQUITYTM UPLC、Q-TOF MS Premier，购自Waters公司。
1.2 生物信息学分析 利用AntiSMASH数据库[26]，预测白骨壤链霉菌9-9全基因组序列中与次级代谢合成相关的基因簇。在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上使用BLASTP对PTMs生物合成基因簇编码的蛋白进行比对分析。
1.3 菌株的培养与发酵 将菌种划线接种于固体平板，30 ℃恒温培养箱培养7–8 d，挑选长势良好的单菌落接入100 mL种子培养基中，30 ℃、220 r/min振荡培养72 h。活化后的种子液，按8%接种量接种于100 mL发酵培养基，30 ℃、220 r/min振荡培养7 d，每种发酵培养基设置3个平行，每个平行发酵100 mL，期间保持对发酵情况的观察和记录。
1.4 代谢产物的提取 将发酵后的菌液分别分装在50 mL的离心管中，8000 r/min离心10 min，取上清。上清液与等体积的乙酸乙酯充分混匀，室温静置24 h后，用500 mL分液漏斗进行反复萃取3次。3次萃取后的乙酸乙酯合并，于37 ℃水浴减压旋转蒸干，去除有机溶剂，得到发酵粗提物。GYM培养基3个平行发酵粗提物分别为13.2、12.7和12.9 mg；ISP3培养基3个平行发酵粗提物分别为20.5、23.1和21.8 mg；ISP4培养基3个平行发酵粗提物分别为26.6、29.8和28.1 mg。
1.5 代谢产物的HPLC分析 使用HPLC对发酵粗提物进行检测，分离柱为Agilent ZORBAX Extend-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温为40 ℃，流动相A为含0.5‰ TFA的超纯水，流动相B为含0.5‰ TFA的乙腈，洗脱梯度为25%–90% B，总时长43 min，流速为1 mL/min。上样量为10 μL，检测波长为190–800 nm。使用LC Solution工作站查看和分析数据。
1.6 代谢产物的UPLC-MS分析 使用上海交通大学分析测试中心UPLC- QTOF-MS对发酵粗提物进行检测。色谱分离柱为ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱温为45 ℃，流动相A为1‰甲酸水溶液，流动相B为含1‰甲酸的乙腈，洗脱梯度为5%–100% B，流速为0.40 mL/min。使用搭载ESI源的Q-TOF质谱仪进行质量分析，根据化合物的不同性质采用正离子模式，离子源温度设定为120 ℃，毛细管和锥形电压分别设置为3000 V和35 V。MS扫描的碰撞能量为6 eV，MS/MS扫描的碰撞能量为15–30 eV。扫描持续时间为0.2 s，锁定喷射频率为30 s，质荷比为100–1500。质谱数据使用MetabolynxTM和Masslynx 4.1软件进行分析。
2 结果和分析 2.1 白骨壤链霉菌9-9中PTMs生物合成基因簇(avi)的生物信息学分析 白骨壤链霉菌9-9菌株分离自红树林沉积物样本，该菌株的全基因组测序已经完成[27]，基因组大小为6.48 Mb。基于AntiSMASH数据库，从白骨壤链霉菌基因组中预测出与次级代谢相关的基因簇，包括萜类、硫肽类抗生素、PKS-NRPS、肽类、四氢嘧啶等类型，其中包括一个被推测为编码PTMs类化合物的生物合成基因簇(表 1)。
表 1. 白骨壤链霉菌9-9基因组中次级代谢生物合成基因簇的预测 Table 1. Predicted gene clusters involving in the biosynthesis of secondary metabolites in S. avicenniae 9-9
| Cluster No. | Product type | Length/bp | Putative function | Cluster blast similarity/%* |
| 1 | Terpene | 21823 | Hopene biosynthetic gene cluster | 30 |
| 2 | Siderophore | 8980 | Desferrioxamine B biosynthetic gene cluster | 60 |
| 3 | Siderophore | 13803 | Ficellomycin biosynthetic gene cluster | 10 |
| 4 | Type Ⅱ PKS | 58686 | Galbonolides biosynthetic gene cluster | 33 |
| 5 | NRPS | 85645 | Pacidamycin biosynthetic gene cluster | 31 |
| 6 | NRPS/PKS | 49276 | Ikarugamycin biosynthetic gene cluster | 20 |
| 7 | Lanthipeptide | 22580 | SAL-2242 biosynthetic gene cluster | 100 |
| 8 | Thiopeptide | 40215 | Diisonitrile antibiotic biosynthetic gene cluster | 11 |
| 9 | Ectoine | 10405 | Ectoine biosynthetic gene cluster | 100 |
| PKS: polyketide synthase; NRPS: non-ribosomal peptide synthetase. *: Threshold level > 10% | ||||
表选项
我们将白骨壤链霉菌中的PTMs基因簇与链霉菌ZJ306及厦门链霉菌318中已经证实的ika基因簇进行比较发现：白骨壤链霉菌中存在的aviA–D与PTMs类化合物的生物合成基因簇ikaA–D是一一对应的。其特点在于，从基因排列上来看，白骨壤链霉菌中aviD基因位于aviC的直接下游，而在另两种链霉菌ZJ306及厦门链霉菌318中，ikaC和ikaD被多个不相关基因隔开。进一步对aviA–D分别进行BLASTP分析发现，这4个蛋白与IkaA–D均具有较高的序列相似性，相似性值从53%到75%不等，覆盖率为99%–100% (表 2)。因此，白骨壤链霉菌9-9具有产生PTMs类化合物的潜能。
表 2. 白骨壤链霉菌9-9中PTMs类化合物生物合成基因簇的BLASTp分析结果 Table 2. BLASTp analysis of major proteins encoded by the PTMs biosynthetic gene clusters in S. avicenniae 9-9
| Protein name | Access No. | Amino acid numbers | Identity of homologue in Streptomyces sp. ZJ306/%* | Identity of homologue in S. xiamenensis 318/%* |
| AviA | WP_052848987.1 | 3091 | 70 | 70 |
| AviB | WP_052848986.1 | 586 | 75 | 75 |
| AviC | WP_052848985.1 | 352 | 66 | 66 |
| AviD | WP_052848984.1 | 397 | 53 | 53 |
| *: Coverage > 98% | ||||
表选项
2.2 多环稠合大环内酰胺类化合物的分析 基于以上生物信息学分析，我们对白骨壤链霉菌9-9的代谢产物进行分析。采用UPLC-QTOF-HRMS的分析方法，对其中具有PTMs类化合物特征紫外吸收的多个成分进行分析，并对目标峰二级质谱(MS/MS)的碎裂规律进行归纳，快速分析并推测PTMs类化合物的结构。
首先，我们选择了3种不同的发酵培养基，即GYM培养基、ISP3培养基和ISP4培养基，对其进行发酵培养。发酵培养3 d后，观察到ISP3组和ISP4组发酵液颜色明显加深，均由灰白色变为深绿色，GYM组发酵液颜色由金黄色变为棕色。发酵培养7 d后，ISP3组和ISP4组发酵液完全变为黑褐色，GYM组发酵液呈现深棕色。随即对其进行产物提取，通过HPLC-UV初步分析发现，在PTMs类的特征吸收325 nm波长下[12, 15]，3组培养基均能产生5个明显的PTMs类特征峰，即化合物1–5(图 2)。与标准品比对后发现，化合物1的保留时间与ikarugamycin一致，化合物2的保留时间与capsimycin B一致。进一步通过UPLC-HRMS验证，如图 3所示，在正离子模式下，化合物1中准分子离子峰为m/z 479.2910 [M+H]+，分子组成为C29H38N2O4，可确定化合物1为ikarugamycin；化合物2中准分子离子峰为m/z 495.2859 [M+H]+，分子式为C29H38N2O5，可确定化合物2为capsimycin B。
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| 图 2 不同培养基条件下白骨壤链霉菌发酵粗提物HPLC色谱图 Figure 2 HPLC profiles of extracts from Streptomyces avicenniae 9-9 cultured in different media. |
| 图选项 |
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| 图 3 化合物1、2的质谱图 Figure 3 Mass spectra of compounds 1 and 2. |
| 图选项 |
此外，不同培养基条件下，白骨壤链霉菌9-9中不同PTMs类化合物的产量有明显变化。我们建立了ikarugamycin和capsimycin B的定量标准曲线，5个样品浓度分别为0.0125、0.025、0.05、0.1和0.2 mg/mL，如图 4-A所示。对化合物1和2的产量进行定量分析可得，在GYM培养基中，ikarugamycin和capsimycin B的产量分别为20和32 mg/L；ISP3培养基中，ikarugamycin产量明显提高，达到103 mg/L，为GYM培养基的5.15倍；在ISP4培养基中，情况正好相反，capsimycin B成为主量化合物，产量达到166 mg/mL，比GYM培养基提高5.19倍(图 4-B)。
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| 图 4 不同培养基对化合物1、2产量的影响 Figure 4 The production of compounds 1 and 2 in different cultures. A: Standard curves of compounds; B: The production of compounds in different cultures. The error bars in the figure indicate the standard deviations from three independent samples. |
| 图选项 |
2.3 多环稠合大环内酰胺类化合物的二级质谱分析 在前期工作中，我们建立了一种根据MS/MS阳离子碎裂规律快速判断PTMs类化合物的方法，可以用于分析5-6-5环类型PTMs类化合物的结构，特别是C-13、C-14和C-30的取代情况[15]。由此我们总结了化合物1–5的二级质谱碎裂规律，结果如表 3所示。
表 3. 化合物1–5的碎片离子数据(正离子模式) Table 3. Fragment ions of compounds 1–5 in the positive mode
| Compound | Observed m/z | Relative abundance/% | Formula | Mass error (mDa) | Mass error (ppm) |
| Compound 1 | 479.2901 | 100 | C29H39N2O4 | –0.8 | –1.7 |
| (ikarugamycin) | 461.2791 | 58 | C29H37N2O3 | –1.2 | –2.6 |
| 443.2685 | 31 | C29H35N2O2 | –1.5 | –3.4 | |
| 323.1992 | 14 | C22H27O2 | –1.2 | –3.7 | |
| 281.1893 | 51 | C20H25O | –1.3 | –4.6 | |
| 181.0977 | 25 | C9H13N2O2 | 0.0 | 0.0 | |
| 139.0868 | 40 | C7H11N2O | –0.3 | –2.2 | |
| Compound 2 | 495.2871 | 100 | C29H39N2O5 | 0.6 | 1.2 |
| (capsimycin B) | 477.2757 | 70 | C29H37N2O4 | 0.0 | 0.0 |
| 459.2645 | 28 | C29H35N2O3 | –0.4 | –0.9 | |
| 321.1845 | 9 | C22H25O2 | –1.0 | –3.1 | |
| 279.1742 | 26 | C20H23O | –0.7 | –2.5 | |
| 181.0982 | 51 | C9H13N2O2 | 0.2 | 1.1 | |
| 139.0873 | 32 | C7H11N2O | 0.1 | 0.7 | |
| Compound 3 | 511.2806 | 100 | C29H39N2O6 | –0.4 | –0.8 |
| 493.2692 | 52 | C29H37N2O5 | –0.8 | –1.6 | |
| 475.2586 | 30 | C29H35N2O4 | –1.0 | –2.1 | |
| 321.1839 | 24 | C22H25O2 | –1.2 | –3.7 | |
| 279.1738 | 27 | C20H23O | ––0.6 | –2.1 | |
| 179.0826 | 11 | C9H11N2O2 | –0.7 | –3.3 | |
| 137.0713 | 10 | C8H7N2O2 | –0.2 | –1.0 | |
| Compound 4 | 493.2693 | 100 | C29H37N2O5 | –0.8 | –1.6 |
| 475.2585 | 62 | C29H35N2O4 | –1.2 | –2.5 | |
| 457.2478 | 20 | C29H33N2O3 | –1.3 | –2.8 | |
| 319.1679 | 19 | C22H23O2 | –1.0 | –3.1 | |
| 277.1579 | 55 | C20H21O | –1.1 | –4.0 | |
| 181.0986 | 41 | C9H13N2O2 | 0.4 | 2.2 | |
| 139.0867 | 54 | C7H11N2O | –0.3 | –2.2 | |
| Compound 5 | 495.2847 | 100 | C29H39N2O5 | –1.5 | –3.0 |
| 477.2740 | 81 | C29H37N2O4 | –1.5 | –3.1 | |
| 459.2631 | 43 | C29H35N2O3 | –1.7 | –3.7 | |
| 321.1835 | 18 | C22H25O2 | –1.0 | –3.1 | |
| 279.1736 | 77 | C20H23O | –0.4 | –1.4 | |
| 181.0981 | 32 | C9H13N2O2 | 0.4 | 2.2 | |
| 139.0868 | 46 | C7H11N2O | –0.4 | –2.9 |
表选项
化合物1的主要子离子峰有m/z 461.2791、323.1992、281.1893、181.0977和139.0868，如表 3所示。其中离子强度最高的峰m/z 461.2791是由结构中大环内酰胺环中的酰胺键断裂、重排形成，随后进一步断裂成为m/z 281.1893和五元酰亚胺环m/z 181.0977两部分碎片。化合物1的质谱裂解规律与ikarugamycin一致[15]，如图 5所示。
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| 图 5 化合物1的(+) MS/MS碎裂规律 Figure 5 (+) MS/MS fragmentation pattern of compound 1. |
| 图选项 |
化合物2，主要的碎片离子m/z 477.2757、459.2645、321.1845、279.1742、181.0982和139.0873，质谱裂解规律与capsimycin B一致[15]，如图 6所示。
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| 图 6 化合物2的(+) MS/MS碎裂规律 Figure 6 (+) MS/MS fragmentation pattern of compound 2. |
| 图选项 |
化合物3，在HR-MS正离子模式下其准分子离子峰为m/z 511.2806 [M+H]+，计算分子式为C29H38N2O6。m/z 511.2806、493.2692和475.2586三个主要的碎片推测是发生了两步脱水。其碎片离子中存在与化合物2一致的m/z 321.1839和m/z 279.1738，推测化合物3的C-13/14位上存在三元氧环。而另一部分m/z 137.07139和m/z 179.0826均比化合物2少2个原子质量单位，推测是由于在大环内酰胺环断裂后的五元环结构部分中多了1个不饱和度。PTMs类化合物可以在固醇去饱和酶(sterol desaturase，简称SD)的作用下在大环C-3位置上加载羟基，如5-6-5环的butremycin或5-5-6环的HSAF[23, 28]。我们在白骨壤链霉菌下游16685-17599区域也发现存在SD基因，由此可推测在化合物3为C-3羟基取代epoxyikarugamycin。
化合物4，在HR-MS正离子模式下其准分子离子峰为m/z 493.2693 [M+H]+，计算分子式为C29H36N2O5。其碎片离子m/z 181.0986和m/z 139.0867与化合物1和2是一致的，则大环部分没有改变。而m/z 475.2585、457.2478、319.1679和277.1579均比化合物2少2个原子质量单位，推测是在化合物2的基础上侧链上形成双键的结构，双键的位置可能在C-16、C-30之间或C-30、C-31之间。
化合物5，在HR-MS正离子模式下其准分子离子峰为m/z 495.2847 [M+H]+，计算分子式为C29H38N2O5，与化合物2的分子组成相同，但是保留时间不同。主要子离子峰m/z 477.2740、459.2631、321.1835、279.1736、181.0981和139.0868均与化合物2一致，可知化合物5大环内酰胺环部分与化合物2是保守的。推测化合物5是保留了ikarugamycin的基本结构，在侧链的C-30位羟基取代。
3 讨论 白骨壤链霉菌9-9中存在的PTMs类化合物主要是5-6-5环的类型，以ikarugamycin和capsimycin B为代表，这两个化合物结构上的区别只在于13位和14位的取代不同。前期从厦门链霉菌318中还分离得到其他5个5-6-5环类型的PTMs类化合物。这些化合物都是在ikarugamycin基础上，在C-13/14位被环氧化，或者分别被羟基、甲基、甲氧基或氯取代，以及侧链的C-30位被羟基或甲氧基取代。体外抗肿瘤活性筛选发现，ikarugamycin、capsimycin和capsimycin B能够显著抑制胰腺癌细胞PANC-1的生长，IC50为1.30–3.37 μmol/L[15]。初步构效关系分析可知，C-13/14位为双键或者环氧结构时，抗肿瘤活性相当；而C-13/14位的三元氧环开环后形成双羟基的结构，则活性消失。而IkaD在PTMs合成基因簇中决定了C-13/14位环氧结构的形成，因此在白骨壤链霉菌9-9中通过对aviD的改造可以实现靶向生产抗肿瘤活性较高的PTMs类化合物。
从西非加纳红树林沉积物分离的小单胞菌产生的butremycin也是5-6-5环PTMs类化合物，其结构中C-13/14位为双键，并在大环C-3位有羟基取代。构效关系研究显示在大环结构中C-3位的羟基化能显著提高化合物的细胞毒活性，IC50在0.26–4.10 μmol/L[8]。本研究中的化合物3经推测C-13/14位为环氧结构并在大环C-3位也有羟基取代，因此该类C-3位羟基化类型的化合物对于后期构效关系的研究具有重要意义。
PTMs类化合物的生物合成基因簇广泛存在于多种链霉菌中[7]。虽然PTMs类化合物的生物合成基因簇在序列相似性和基因排列方式上都较为保守，但在不同链霉菌菌株中激活沉默的PTMs基因簇的表达不乏获得新的PTMs结构类似物的例子，如Olano等在S. albus J1074菌株中获得2类新的PTMs类化合物[29]；Saha等将来源于S. pactum SCSIO 02999菌株的PTMs基因簇在体外重构后导入异源表达宿主，获得了6个新的PTMs类化合物[11]。因此，基于合成生物学理念，将红树林源的链霉菌基因组中的PTMs基因簇置于通用强启动子控制下，导入遗传背景清晰的链霉菌宿主中进行表达，有可能获得新的PTMs类化合物。
此外，大多数链霉菌细胞膜中主要的甲基萘醌(menaquinone)都是MK-9，而白骨壤链霉菌9-9菌株细胞膜的甲基萘醌组成较为特殊，主要成分为MK-10。迄今为止，已报道具有此类异常醌型的链霉菌只有S. specialis GW41-1564[30]菌株和S. hainanensis YIM 47672菌株[31]。这两株菌和白骨壤链霉菌在16S rRNA基因系统发育亲缘关系最近，可能代表了一类生理特性独特的链霉菌。以此类“稀有”链霉菌基因组序列预测的潜在次生代谢产物生物合成基因簇信息为指导，展开系统的化学分离鉴定，有望发现新的天然产物。
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