曾秀丽1, 王志1, 罗利2, 王旭1, 陈宣钦3, 周育1,2
1. 安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室, 安徽 合肥 230036;
2. 上海大学上海市能源作物育种与应用重点实验室, 上海 200444;
3. 昆明理工大学生命科学与技术学院, 云南 昆明 650500
收稿日期：2019-11-10；修回日期：2020-01-07；网络出版日期：2020-01-21
基金项目：安徽省自然科学基金（1608085QC57）；上海市能源作物育种与应用重点实验室开放基金；茶树生物学与资源利用国家重点实验室开放基金（SKLTOF20190110）
*通信作者：周育, Tel:+86-551-65786701;E-mail:microbes@ahau.edu.cn.
摘要：[目的] 以紫娟茶树分离的内生菌水生草螺菌ZXN111为研究对象，通过分子遗传学方法证实该菌株植物生长素吲哚3-乙酸（IAA）合成的主要分子途径。[方法] 参考草螺菌基因组信息中IAA合成基因簇，选取与IAA合成密切相关的候选基因，即芳香族氨基酸转氨酶基因（tyrb），通过基因插入突变与基因互补方法，结合茶树组培苗体内促生能力分析，初步验证水生草螺菌生长素合成的主要机制。[结果] 植物生长素IAA合成候选基因tyrb突变后，突变株tyrb：：pK19mobΩ2HMB 48 h的IAA合成量显著低于野生型菌株ZXN111，且tyrb基因互补后，互补株tyrb：：pK19mobΩ2HMB（+）的IAA合成能力得到了显著恢复。茶树促生实验发现，突变株tyrb：：pK19mobΩ2HMB接种组的茶树组培苗根长、根重及植株鲜重指标上均显著低于野生菌处理组。[结论] 水生草螺菌ZXN111有多条IAA合成途径，其中的吲哚-3-丙酮酸（IPA）是最主要途径，其生长素合成对寄主茶树具有显著的促生功能。
关键词：茶树内生菌水生草螺菌生长素合成tyrb基因
Auxin synthesis in tea plant endophytic Herbaspirillum sp. ZXN111 and the plant growth promotion on Yunkang-10
Xiuli Zeng1, Zhi Wang1, Li Luo2, Xu Wang1, Xuanqin Chen3, Yu Zhou1,2
1. State Key Laboratory of Tea Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Heifei 230036, Anhui Province, China;
2. Shanghai Key Laboratory of Bio-Energy Crops, Shanghai University, Shanghai 200444, China;
3. School of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Received: 10 November 2019; Revised: 7 January 2020; Published online: 21 January 2020
*Corresponding author: Yu Zhou, Tel:+86-551-65786701;E-mail:microbes@ahau.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Anhui Natural Science Foundation (1608085QC57), by the Foundation from Shanghai Key Laboratory ofBio-Energy Crops, Shanghai University and by the Open Fund of State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization(SKLTOF20190110)
Abstract: [Objective] The predicted mechanism of indole-3-acetic acid (IAA) synthesis was investigated by molecular method on an endophytic bacterium Herbaspirillum aquaticum ZXN111 that was isolated from Zijuan tea. [Methods] Aromatic-amino-acid aminotransferase gene (tyrb) in indole-3-pyruvicacid (IPA) pathway responsible for IAA synthesis was selected on the basis of Herbaspirillum seropedicae genomic analytical results. Gene tyrb was mutated by recombinant plasmid pK19mobΩ2HMB-P-tyrb to produce mutant tyrb::pK19mobΩ2HMB, and a complementation strain tyrb::pK19mobΩ2HMB(+) was further constructed by recombinant plasmid pSRK-Gm-tyrb. IAA synthesis activities of mutant tyrb::pK19mobΩ2HMB, strain tyrb::pK19mobΩ2HMB(+) and wide type ZXN111 were analyzed, and the three strains' plant growth promotion (PGP) activity was evaluated by tissue cultured seedling of Yunkang-10. [Results] After tyrb gene mutated by pK19mobΩ2HMB-P-tyrb insertion, IAA synthetic activity of mutant tyrb::pK19mobΩ2HMB was much lower than that of wild-type ZXN111 in 48 h culture, but IAA synthesis activity of complementary strain tyrb::pK19mobΩ2HMB(+) was restored by plasmid pSRKGm-tyrb. The wide-type strain ZXN111 positively regulated the plant growth of Yunkang-10, while the mutant tyrb::pK19mobΩ2HMB lose the plant promotion activity significantly. [Conclusion] The indole-3-pyruvate (IPA) pathway is the primary IAA synthesis pathway in Herbaspirillum aquaticum ZXN111 and the tyrb is the key gene of IPA pathway, but other alternative pathways are also existed. Auxin production was one of the important contributors to PGP activity of Herbaspirillum aquaticum ZXN111.
Keywords: tea plant endophyteHerbaspirillum aquaticusmauxin synthesistyrb gene
植物内生菌是生活于健康植物生活史一定阶段、分布于植物各种器官内部(如根、茎、叶、花、果实等)且多数对宿主植物没有危害的微生物群落[1-2]。研究表明，植物内生菌几乎存在于所有植物中，其中内生草螺菌多分布于根茎部，且多具有合成植物生长素、联合固氮等植物促生功能，从而对植物生长起调节作用[3-4]。大部分植物与内生菌之间为互作关系，植物信号可以调节细菌体内黏附素、鞭毛和脂多糖合成酶基因表达，激发细菌附着于根表面；内生菌定殖又有利于内生菌向寄主植物中释放蛋白质和植物激素，刺激植物生长、调控植物防御反应[5]。植物生长素为植物生长发育重要信号分子，由吲哚-3-乙酸(IAA)和相关的内源性物质组成[6]。研究表明，IAA合成不局限于高等植物，亦存在于细菌、真菌、酵母菌中，在内生细菌中合成IAA最重要的作用是促进植物生长，同时IAA的合成也有助于细菌在宿主植物上定殖及适应[7-10]。
植物本身可通过吲哚-3-乙酰胺(IAM)、吲哚-3-丙酮酸(IPA)、色胺、吲哚-3-乙醛肟(IAOx)等不同分子途径合成生长素IAA[11-12]。近年研究显示，很多细菌(尤其是G–细菌)合成IAA的途径也多种多样，主要包括吲哚乙酰胺(IAM)、吲哚丙酮酸(IPA)、色胺(Tryptamine)、吲哚乙醛肟(IAOx)和衍生自色氨酸的吲哚-3-乙醛(Indole-3-acetaldehyde)等五种不同生物合成途径[7, 13-15]。在Pedrosa等公布的植物内生菌——织片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)基因组信息中，菌株SmR1可能含有IPA、IAM、色胺和吲哚乙醛肟4条不同途径，并预测IPA途径可能为最主要途径，但未作进一步的生物学验证[5]。本研究以实验室前期从紫娟茶树中分离获得的具有生长素合成、ACC脱氨酶、联合固氮等多种植物促生活性的水生草螺菌ZXN111为研究对象[16]，依据已公布的草螺菌基因组信息为参考[5]，选取IPA合成途径中关键酶(芳香族氨基酸转氨酶)基因tyrb为候选基因，对草螺菌属细菌生长素合成的分子机制作进一步的验证。在此基础上，应用组培苗侵染方法，对野生菌株及生长素突变株的茶树促生功能进行体内验证，明确生长素合成在菌株ZXN111植物促生功能中的作用。
1 材料和方法 1.1 材料和试剂 实验所用菌株为水生草螺菌(Herbaspirillumaquaticum) ZXN111，该菌株从紫娟茶树叶片中分离获得，为茶树内生菌，菌株具有显著的植物生长素IAA合成能力[16]。本实验所用其他菌株、质粒与引物等相关材料如表 1所示，所有引物均由本实验室设计，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表 1. 本实验中所用到的菌株、质粒和引物 Table 1. Strains, plasmids, and primers used in this study
| Strains/plasmids/primers | Description | References |
| Strains | ||
| ZXN111 | Isolated from Zijuan tea | [16] |
| tyrb::pK19mobΩ2HMB | The partial tyrb insertion mutant strain of ZXN111, Kmr | This study |
| tyrb::pK19mobΩ2HMB(+) | tyrb::pK19mobΩ2HMB carrying the expression plasmid pSRK-Gm-tyrb, Gmr | This study |
| E. coli DH5α | Cloning strain | TransGenBiotech, Beijing, China |
| Plasmids | ||
| pK19mobΩ2HMB | Suicide plasmid, Kmr | [17] |
| pSRK-Gm | Expression vector, Gmr | [18] |
| Primers | Sequence | Restriction sites |
| tyrb-F | ATGAACGCACCTGTCTCCG | No restriction sites |
| tyrb-R | TTACAGCACCTTGGCGATG | No restriction sites |
| ins-F | GGGTGTACAGCCATACAGCGAGAACGA | Bsp1407Ⅰ (underlined) |
| ins-R | CCCAAGCTTGGTCAACGCCTATCCCTAC | Hind Ⅲ (underlined) |
| ver1-F | GCGCTTCAGTTGCGACAGC | No restriction sites |
| ver1-R | GACAACGGCAAGGTCCCCC | No restriction sites |
| comp-F | GGAATTCCATATGATGAACGCACCTGTCTCCG | NdeⅠ (underlined) |
| comp-R | CCGCTCGAGTTACAGCACCTTGGCGATG | XhoⅠ (underlined) |
表选项
用于抗性筛选的卡那霉素(Km)、硫酸庆大霉素(Gm)等抗生素为分析纯，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。用于细菌培养基配制的酵母粉、蛋白胨均为Oxoid公司产品，色氨酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸标准品购自于北京索莱宝科技有限公司。用于液相色谱分析用的色谱纯的乙腈和乙酸为美国天地公司(TEDIA)产品。质粒小提试剂盒及DNA回收试剂盒购于天根公司(TIANGEN)；Bsp1407Ⅰ、Hind Ⅲ限制性内切酶、Easytaq酶、T4 DNA Ligase购于TaKaRa公司；用于茶树组织培养用的MS培养基为青岛海博生物技术有限公司产品。其他试剂与培养基均为国产分析纯。IAA合成所用的有氮培养基配方为：葡萄糖10.0 g、硫酸铵1.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、七水合硫酸镁0.5 g、氯化钠0.1 g、酵母粉0.5 g、水1000 mL，pH 7.2，115 ℃灭菌30 min。LB培养基配方为：胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化钠10.0 g，去离子水1000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。茶苗组织培养所用培养基配方为：在MS培养基(4.43 g/L)中加入30 g/L的蔗糖以及8 g/L的琼脂，加水定容，用NaOH调节pH至5.8，然后分装到组培瓶中，121 ℃灭菌20 min，冷却备用。
1.2 菌株ZXN111基因组中tyrb基因验证 参照Pedrosa等公布的草螺菌基因组[5]，选取IPA途径中的关键酶tyrb基因序列两端设计引物tyrb-F及tyrb-R (表 1)，以水生草螺菌ZXN111为出发菌株(野生菌)，提取ZXN111的DNA为模板，扩增完整的tyrb基因。PCR反应体系为：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，tyrb-F 0.5 μL，tyrb-R 0.5 μL，DNA模板2 μL，Easytaq酶0.2 μL，加入去离子水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增结果采用琼脂糖凝胶电泳和测序验证。
1.3 菌株ZXN111基因组中tyrb基因突变 图 1为重组质粒pK19mobΩ2HMB- P-tyrb构建及插入突变遗传操作原理。以上一步扩增获得的tyrb基因序列为依据，在tyrb基因序列近中间位置，设计插入突变片段(P-tyrb)的上游引物ins-F和下游引物ins-R，引物上下游分别加酶切位点Bsp1407Ⅰ和Hind Ⅲ[17] (表 1)。PCR反应体系为：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，ins-F 0.5 μL，ins-R 0.5 μL，基因组DNA模板2 μL，Easytaq酶0.2 μL，加入去离子水至20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；然后94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，反应32循环；72 ℃ 10 min。用1.5%的琼脂糖凝胶在80 V电压下进行电泳检测，将目的条带依照DNA胶回收试剂盒说明书操作步骤进行胶回收纯化。
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| 图 1 pK19mobΩ2HMB-P-tyrb插入突变重组质粒遗传操作示意图 Figure 1 Schematic description on pK19mobΩ2HMB-P-tyrb construction. |
| 图选项 |
将纯化目的基因及质粒pK19mobΩ2HMB分别在37 ℃条件下孵育1 h进行酶切反应，再将酶切体系置于65 ℃水浴20 min终止反应(酶切体系：Bsp1407 Ⅰ 0.5 μL，Hind Ⅲ 0.5 μL，DNA/质粒17.0 μL，10×Buffer 2 μL)。酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并对酶切产物进行胶回收。将回收后的目的片段及pK19mobΩ2HMB质粒片段，用T4 DNA连接酶完成目的片段和质粒的连接。质粒与目的片段连接体系为：T4 DNA连接酶1.0 μL，DNA酶切产物13.0 μL，pK19mobΩ2HMB酶切产物4.0 μL，10×Buffer 2.0 μL；于16 ℃温度下连接4 h以上，构建重组质粒pK19mobΩ2HMB-P-tyrb。将构建好插入突变质粒pK19mobΩ2HMB-P-tyrb转化至E. coli DH5α中，37 ℃过夜培养后，以ins-F和ins-R为引物进行菌落PCR验证插入突变质粒是否成功。采用质粒小提试剂盒，依据产品说明书提取插入突变重组质粒，双酶切验证、保存备用。
经LB平板活化后的野生菌株ZXN111，转接至100 mL的LB液体培养基于28 ℃、160 r/min振荡培养至OD值约为0.8，取10 mL新鲜菌液，在7000 r/min条件下冷冻离心10 min获得菌体，用10%的甘油10 mL清洗菌体4次，最后加600 μL 10%甘油重悬菌体，分装于3支干净的离心管，向每个重悬液中加入5 μL插入突变重组质粒(对照组不加质粒)混匀。取200 μL重悬液，加入到已用75%乙醇和去离子水处理过的电击杯中，将电击杯放置于电击槽中在2.5 kV条件下电击5 ms (电转仪：BTX ECM 399)。电击转化后，立即向转化液加入1.0 mL无抗LB液体培养基，于28 ℃、160 r/min条件下振荡培养3 h，然后7000 r/min离心3 min，将收集的菌体涂布于卡那霉素抗性的LB平板上。挑取候选阳性克隆，以上下游引物ver1-F和ver1-R (表 1)，进行PCR验证，筛选阳性突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB。PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，32个循环；72 ℃ 10 min。
1.4 基因互补株构建 图 2为互补重组质粒pSRK-Gm-tyrb构建原理及遗传操作示意图。
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| 图 2 pSRK-Gm-tyrb基因互补重组质粒遗传操作示意图 Figure 2 Schematic description on pSRK-Gm-tyrb construction. |
| 图选项 |
依据tyrb基因全长序列，重新设计基因互补上游引物comp-F和下游引物comp-R，引物上下游分别引入酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ (表 1)，以基因互补引物，扩增完整目的基因。PCR反应体系为：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，comp-F 0.5 μL，comp-R 0.5 μL，模板DNA 2 μL，Easytaq酶0.2 μL，加入去离子水至20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32个循环；72 ℃ 10 min。参照上述同样方法，进行PCR产物及互补质粒pSRK-Gm双酶切、产物回收与连接转化，构建tyrb基因互补的重组质粒pSRK-Gm-tyrb。质粒构建完成后，以comp-F和comp-R为验证引物完成PCR验证，并以上述同样方法完成NdeⅠ和XhoⅠ双酶切验证。以1.3中的方法步骤，将互补质粒pSRK-Gm-tyrb电击转化至突变株tryb::pK19mobΩ2HMB，构建功能互补株，将电击转化菌液涂布于含庆大霉素抗性(Gmr)的LB平板，挑选候选阳性克隆，以验证引物对comp-F和comp-R，按照前述PCR条件，进行菌落PCR验证和测序，筛选出阳性互补菌株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)。
1.5 菌株培养、生长素提取与检测 参照已报道的植物生长素IAA检测方法，进行菌株培养和生长素提取净化，采用超高效液相色谱(UPLC)检测含量。将营养琼脂上活化后待测菌株，接种于营养肉汤，于28 ℃、160 r/min条件下，培养菌液至OD600为0.6，然后取250 μL菌液加入到含有5.0 mL色氨酸(终浓度为0.5 mg/mL)的25 mL有氮培养基中，28 ℃、160 r/min条件下避光培养1–2 d，以12000 r/min离心10 min，取上层清液，用HCl/H3PO4溶液调节pH至2.5。以体积比1:1比例加入的乙酸乙酯萃取，反复萃取3次，最后将萃取液混匀，取3.0 mL萃取液氮气吹干，再加入1.0 mL流动相复溶，参照已发表的文献条件，用UPLC检测含量[16]。
1.6 内生菌侵染与促生功能检测
1.6.1 云抗-10组培苗的制备: 以“茶树生物学与资源利用国家重点实验室”组培平台，已成功培养和保存的紫娟的近缘种云抗-10号为茶树材料，挑选长势较好的无菌组培苗，在超净工作台中用无菌剪刀剪下上部约3 cm的粗壮枝条，基部浸泡于无菌的0.5 mg/mL吲哚丁酸(IBA)溶液中约5 min，无菌滤纸吸干茶苗表面水分后，插入未加任何生长激素的培养基中，于温度25±2 ℃、光照黑暗交替12 h、光强1500–2000 lx的组培室中培养，直至组培苗生根。
1.6.2 菌株接种: 本实验的突变株为植物生长素合成基因突变株，与植物侵染定殖相关的三型分泌系统基因簇未做任何遗传改变，突变株与野生菌对茶树的定殖特性不变，实验以野生菌作为侵染定殖研究材料[5]。将待测菌株接种于50 mL无抗液体LB中28 ℃振荡培养至OD值为0.6–0.9，取1 mL菌液9000 r/min离心10 min，倒掉上清，用无菌水洗菌体3次，然后用1 mL无菌水悬浮菌体，轻轻接种于组培苗根部(以1 mL无菌水为空白对照)，放置于组培室中继续培养30 d。培养结束后，将各组茶树组培苗取出，测量根长、根数以及称量根重、植株鲜重。
1.6.3 茶苗内生菌定殖数量测定: 将培养结束后的组培苗取出，于超净工作台中进行消毒。以75%乙醇浸泡1 min，3.25% NaClO浸泡6 min，75%乙醇浸泡1 min，无菌水清洗5–6次，取200 μL最后一次无菌水清洗液涂布于无抗营养琼脂(NA)，检查是否消毒完全。取1 g消毒后植物组织(根、茎、叶)于无菌研钵中，分别加10 mL生理盐水，进行无菌研磨，制备10–1稀释液；对稀释液进行梯度稀释，获得10–2，10–3、10–4、10–5梯度稀释，取200 μL 10–3、10–4和10–5稀释液，分别均匀涂布于无抗NA上。将涂布后平板放置于30 ℃培养箱中，倒置培养3 d后，进行菌落计数，并随机挑选菌落进行16S rRNA基因测序验证。
1.7 数据分析 本实验检测数据均在3次生物学重复下，使用单因素方差分析(One-wayANOVA)和T-test检验(*P < 0.05)对数据进行统计分析。所有统计分析都是在Graphpadprism (5.0)软件下进行。
2 结果和分析 2.1 基因突变与功能验证
2.1.1 ZXN111中tyrb基因克隆与突变株构建: 以tyrb-F和tyrb-R为引物，野生菌株ZXN111基因组DNA为模板，PCR克隆获得一条约1.2 kb的单一条带(图 3)，将阳性条带进行T-A克隆测序后，获得一条1218个碱基对的基因序列(GenBank accession：MN603494)，经NCBI网站比对，确认为tyrb基因。
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| 图 3 菌株ZXN111的tyrb基因扩增结果 Figure 3 The PCR products of gene tyrb from strain ZXN111. Lane 1:negative control; lanes 2–3: positive results. |
| 图选项 |
以ins-F及ins-R为扩增引物对，PCR扩增获得250–500 bp的tyrb基因，且为单一条带(图 4-A)，扩增产物经克隆测序后，确认与预期序列匹配率为100%，表明该部分基因克隆成功。通过PCR产物及pK19mobΩ2HMB质粒双酶切，产物回收及酶连反应，构建pK19mobΩ2HMB-P-tyrb插入突变重组载体。所构建的pK19mobΩ2HMB-P-tyrb重组质粒，用Bsp1407Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳验证，发现有两条线性条带，并且分别与质粒(3.3 kb)和目的基因条带(346 bp)大小相对应，表明重组载体构建成功(图 4-B)。
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| 图 4 菌株ZXN111的tyrb基因突变体构建 Figure 4 The tyrb mutant construction from strain ZXN111. A: The PCR product of partial tyrb gene. M: DNA marker; lanes 1–3: partial tyrb gene. B: Double enzymes digestion of pK19mobΩ2HMB-P-tyrb. M: DNA marker; lane 1: pK19mobΩ2HMB; lane 2: double enzymes digestion of pK19mobΩ2HMB; lane 3: double enzymes digestion of partial tyrb gene; lane 4: double enzymes digestion of pK19mobΩ2HMB-P-tyrb. C: Verification of tyrb gene mutant. M: DNA marker; lanes 1–3: PCR products. |
| 图选项 |
重组质粒pK19mobΩ2HMB-P-tyrb经电击转化后，随机挑取在含卡那霉素NA平板上长出的阳性候选菌株，以ver1-F和ver1-R为引物对，进行菌落PCR验证。结果显示，重组质粒已正确插入预期位置(条带大小为4035bp)，初步判断成功获得插入突变子(图 4-C)。同时，在约750bp的位置出现非特异性扩增条带，通过多次重新设计引物仍然无法避免，猜测突变株基因组上还存在与这个4035bp片段有一定相似性的小片段，但这两个片段大小差异明显，不干扰鉴定结果。在此基础上将PCR产物目的片段胶回收纯化测序，结果比对正确，表明突变成功。
2.1.2 突变菌株tyrb::pK19mobΩ2HMB生物活性验证: 在有氮培养基培养24 h时，野生株ZXN111和突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB生长素IAA合成量并无显著性差别(图 5)，此时培养液还较为澄清，菌体仍处于延滞期末期或对数期的初期。随着培养时间延长，野生菌ZXN111培养液中IAA含量将会逐步增多。经过48 h培养，突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB的IAA合成量有所增加，但是整体增幅有限，野生型菌株却比24 h生长素IAA合成量增加了近10倍(图 5)。野生型菌株48 h的IAA合成量为40.64 μg/mL，突变型IAA合成量为10.78 μg/mL。水生草螺菌ZXN111在tyrb基因突变后，生长素IAA合成能力显著降低，说明芳香族氨基酸氨基转移酶基因tyrb是该菌株生长素IAA合成的关键性基因，IPA途径为水生草螺菌合成植物生长素IAA的最主要途径。但是，该合成途径阻断后，突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB的IAA合成能力未完全丧失，表明菌株ZXN111仍存在IAA合成补救途径。
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| 图 5 植物生长素突变菌株的表型验证 Figure 5 Auxin IAA synthetic activities of mutant tyrb::pK19mobΩ2HMB. T test was used (P < 0.001), n=3. |
| 图选项 |
2.2 基因互补与功能验证
2.2.1 tyrb基因功能互补菌株构建: 以野生型菌株DNA为模板，comp-F为comp-R引物对(表 1)，扩增获得tyrb完整基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在1.2 kb位置有单一条带(图 6-A)，经测序验证，与预期序列匹配率为100%，表明互补基因克隆成功。
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| 图 6 基因tyrb功能互补表达载体及互补株的构建 Figure 6 Construction of tyrb complementary strain. A: The PCR product of tyrb. M: DNA marker; lanes 1–3: PCR products. B: The tyrb PCR product from constructed pSRK-Gm-tyrb. M: DNA marker; lanes 1–3: PCR products. C: Verification of double enzymes digestion. M: DNA marker; lane 1: pSRK-Gm; lane 2: double enzymes digestion of pSRK-Gm; lane 3: double enzymes digestion of tyrb; lane 4: double enzymes digestion of pSRK-Gm-tyrb. D: Verification of complementary strain containing pSRK-Gm-tyrb. M: DNA marker; lanes 1–3: PCR product of gene tyrb. |
| 图选项 |
经胶回收纯化后的目的片段与互补载体pSRK-Gm分别进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物纯化后，用T4连接酶进行酶连，构建互补表达载体pSRK-Gm-tyrb，并转入E. coli DH5α。然后以comp-F及comp-R引物对，进行菌落PCR验证，在约1.2 kb位置有单一条带(图 6-B)，初步证明互补质粒构建成功。在此基础上，提取互补重组质粒，经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，获得两个预期条带，分别为约5.5 kb的pSRK-Gm互补载体和约1.2 kb的tyrb基因(图 6-C)，表明载体构建成功。经电击转化后，转化子候选菌落经PCR验证，随机挑取的克隆在1.2 kb位置有单一条带(图 6-D)，经测序确认互补菌株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)构建成功。
2.2.2 功能互补菌株表型验证: 将野生型ZXN111、突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB和互补株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)，同步培养36 h后(此时3个菌株菌液OD600均为0.6左右)，其中互补株培养基加入了终浓度为0.2 mmol/L的异丙基- β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，检测各菌株IAA合成量。结果显示，ZXN111、tyrb::pK19mobΩ2HMB和tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)的IAA合成能力，分别为野生菌 > 互补株 > 突变株(图 7)。野生型菌株ZXN111的36 h生长素IAA合成量高达15 μg/mL，而突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB的IAA合成量仅为0.11 μg/mL，互补菌株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)的IAA合成能力，在突变株的基础上得到了显著恢复，但与野生型菌株IAA合成量仍有一定差距，达到13.1μg/mL (恢复了87.3%)。互补实验再次证明了tyrb基因是草螺菌ZXN111合成生长素途径中的关键性基因，IPA是水生草螺菌IAA合成的重要途径。
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| 图 7 基因tyrb互补菌株的表型验证 Figure 7 Auxin IAA synthetic activities of complementary strain tyrb::pK19mobΩ2HMB(+). One-way ANOVA was used, n=3. Different letters indicated statistical differences between treatments. |
| 图选项 |
2.3 菌株促生功能与定殖情况 茶苗促生功能结果显示，与空白对照组(无菌水)相比，野生型菌株ZXN111处理组茶苗的根长、根数、根重和植株鲜重均显著高于对照组，说明菌株ZXN111能显著地促进无菌组培茶苗的生长。与接种野生型菌株处理组相比，突变型菌株tyrb::pK19mobΩ2HMB处理组在根长、根重及植株鲜重几个生物学性状，显著低于野生菌处理组，说明生长素IAA突变株对无菌茶苗的植物促生功能显著减弱(图 8)。生物学性状的统计结果，与图中茶苗在组织培养瓶中的生长情况基本吻合，菌株ZXN111的植物生长素合成功能的丢失，会显著影响该菌株对茶树生长的调节能力。
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| 图 8 不同菌株侵染处理对云抗-10号组培苗生长的影响 Figure 8 The effect of different inoculants on the growth of Yunkang-10 cultivar. A: root length; B: root numbers; C: root weight; D: fresh weight; E–F: the effect of ZXN111 and tyrb::pK19mobΩ2HMB on the growth of Yunkang-10 cultivar. One-way ANOVA was used, n=3. Different letters indicated statistical differences between treatments. |
| 图选项 |
内生菌定殖分离结果显示(图 9)，水生草螺菌ZXN111在云抗-10号中主要定殖于茎部和叶部，定殖于茎部的草螺菌数量达到3.65×106 CFU/g鲜茎，定殖于叶部的数量达到2.2×104 CFU/g鲜叶，因此水生草螺菌定殖于茎部的数量居多。在本次试验中植物内生菌研磨材料涂布的稀释度统一为10–3–10–5，可能由于稀释度过大，在根中未检测出有效定殖的内生菌，由此也说明定殖于茶树根中的草螺菌是比较少的。内生草螺菌是在紫娟茶树叶片中分离得到，茶树侵染实验也证明，该菌株主要定殖于茎叶中，可能该菌株对茶树茎叶中物质有趋化性相关，其明确的因素仍有待进一步探索。
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| 图 9 草螺菌ZXN111在云抗-10号组培苗不同部位定殖数量 Figure 9 The colonized population in different tissues of Yunkang-10 culture seeding. Values are mean of three replicates±standard deviation. |
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3 讨论 国内外对于茶树内生菌，尤其是内生细菌-茶树互作调节茶树生长的研究尚不多见，这项研究对茶树种植过程中化学肥料减施、茶叶品质提升及生态农业具有重要意义。研究证明，植物内生草螺菌可以通过联合固氮、表达ACC脱氨酶和合成植物生长素等多种方式，调节寄主植物生长，协助植株适应不良环境[2-5, 16]。王婷等在武汉东湖磨山公园栽培的茶树叶片分离出两株茶树内生草螺菌WT00C和WT00F[4]，其亲源关系与本研究菌株ZXN111一致，16S rRNA基因相似性与水生草螺菌(Herbaspirillumaquaticum)达到99%以上。草螺菌WT00C和WT00F能够产生IAA、NH4+和嗜铁载体，但无固氮酶活性。结合本研究结果，认为内生草螺菌可能较广泛存在于茶树植物中[4, 16]，研究内生草螺菌对寄主茶树促生长机制，尤其是内生草螺菌IAA合成机制，对茶树栽培过程中产量和品质提升有重要意义。
Pedrosa等对织片草螺菌(H. seropedicae) SmR1及其链霉素抗性突变株Z78进行了完整的基因组测序和注释，发现菌株SmR1含有包括IPA在内4条不同的IAA生物合成途径，并预测，以tyrb为关键基因的IPA途径可能为最主要途径，但未作进一步的生物学验证[5]。本研究以织片草螺菌SmR1基因组预测信息为基础，选取草螺菌IAA合成的IPA途径中关键酶基因tyrb为研究对象，对tyrb基因进行插入突变和功能互补。结果发现tyrb基因插入后的突变菌株tyrb::pK19mobΩ2HMB，其生长素IAA合成能力显著低于野生型菌株(降低了90%)；而基因互补后的互补株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)，其生长素IAA的合成能力显著提升(恢复至野生菌的87.3%)。因此，验证了tyrb基因是草螺菌ZXN111合成IAA的关键酶基因。在已报道的G–细菌合成IAA的5条不同途径中，tyrb基因为吲哚-3-丙酮酸(IPA)途径中的关键酶基因，该结果证实了水生草螺菌ZXN111合成IAA的主要途径为IPA，这与Pedrosa等对织片草螺菌(H. seropedicae) SmR1的功能基因预测结果相一致。然而IPA合成途径阻断后，突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB的IAA合成能力未完全丧失，说明水生草螺菌ZXN111基因组中仍存在其他IAA合成的补救路径，尽管这些路径的IAA合成能力显著低于IPA途径。
此外，通过茶树无菌组培苗侵染实验发现，水生草螺菌ZXN111能够有效定殖于云抗-10茶树茎部和叶部(主要定殖于茎部)，在本次试验中，茶苗根部可能因为定殖数量较少未能检测到有效定殖菌株。定殖的野生菌株ZXN111对云抗-10号茶树无菌组培苗具有显著的正向生长调节作用(促生长作用)；然而，与野生菌株ZXN111相比，其生长素IAA突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB对云抗-10号无菌组培苗的促生效果显著减弱，由此说明水生草螺菌植物生长素IAA的合成功能对茶树的生长调节具有重要意义。
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