夏银河#, 王坤芃#, 刘盼盼, 王新卫, 常洪涛, 彭志锋, 刘红英, 陈陆, 杨霞
, 王川庆 河南农业大学牧医工程学院, 河南郑州 450002
收稿日期：2019-12-20；修回日期：2020-03-18；网络出版日期：2020-04-15
基金项目：河南省科技厅科技攻关项目(172102110046);河南省自然科学基金(162300410153)
*通信作者：杨霞, E-mail:yangxia66@163.com.
#共同第一作者。
摘要：[目的] 为探究RTX样毒素GtxA及外膜蛋白（OmpW）对鸭源鸡杆菌生物学特性和致病力的影响。[方法] 本研究采用自然转化法对突变株RZΔompW进一步缺失gtxA构建突变株RZΔompWΔgtxA，通过分析其生长特性、黏附能力、引起细胞凋亡程度及对小鼠致病性等，探究其与生物学特性及致病性可能的关系。[结果] 结果显示，RZΔompWΔgtxA能稳定遗传gtxA的缺失；单双基因突变株溶血活性均消失、与RZ株相比菌落形态及生长速率并未出现显著改变；相比RZ、RZΔompW和RZΔgtxA，双基因缺失株RZΔompWΔgtxA在不同时段对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力显著降低（P < 0.05），诱导鸡输卵管上皮原代细胞发生凋亡的能力明显减弱，对小鼠的致病力显著降低。[结论] GtxA毒素和外膜蛋白OmpW在鸭源鸡杆菌毒力、黏附宿主细胞及诱导其细胞凋亡中起重要作用，且可能存在明显的协同关系。本研究为鸭源鸡杆菌感染机制的阐明奠定基础。
关键词：鸭源鸡杆菌RZΔompWΔgtxA缺失株生物学特性致病性
Construction and characterization of Gallibacterium anatis ΔompWΔgtxA double deletion strain
Yinhe Xia#, Kunpeng Wang#, Panpan Liu, Xinwei Wang, Hongtao Chang, Zhifeng Peng, Hongying Liu, Lu Chen, Xia Yang
, Chuanqing Wang College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Received: 20 December 2019; Revised: 18 March 2020; Published online: 15 April 2020
*Corresponding author: Xia Yang. E-mail: yangxia66@163.com.
Foundation item: Supported by the Henan Science and Technology Project (172102110046) and by the Natural Science Foundation of Henan (162300410153)
#Those authors contributed equally to this work.
Abstract: [Objective] To understand the biological characteristics and pathogenicity of the virulence factor RTX-like toxin GtxA and outer membrane protein W of G. anatis. [Methods] Based on the G. anatis OmpW gene deletion strain, we successfully constructed the OmpWgtxA double gene deletion strain by natural transformation. The differences in biological characteristics and virulence between single and double gene deletion strains and parental strain were investigated. [Results] The hemolytic activity of the OmpWgtxA double gene deletion strain was inactivated, while the deletion was stable in vitro and in vivo. Compared with gtxA, ompW single gene deletion strain and parental strain Yu-PDS-RZ-1-SLG, the growth of the double gene deletion strain was not significantly altered, while its adhesion ability and lesions of primary chicken oviduct epithelial cells were decreased to some extent; and its ability to induce apoptosis in cells of chicken oviduct epithelium was lessened; its pathogenicity was also reduced. [Conclusion] GtxA toxin and outer membrane protein W were suggested to play important roles in G. anatis virulence, adhesion to host cells and induction of apoptosis and there may be synergies. This study laid the foundation for further revealing the pathogenesis of G. anatis.
Keywords: Gallibacterium AnatisRZΔompWΔgtxA gene deletion strainbiological characterpathogenic
鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis，G. anatis)是巴氏杆菌科的一种条件性致病细菌，该菌主要感染鸡、鸭、鹅、火鸡等[1]，是一种革兰氏阴性菌。鸭源鸡杆菌主要定殖于上呼吸道及下生殖道，输卵管是其主要靶器官，感染后造成输卵管膨大部和子宫部的黏膜充血、水肿，引起输卵管炎、输卵管囊肿和腹膜炎，导致蛋鸡产蛋高峰延迟、产蛋率下降，死亡率增加[2-6]。目前，关于鸭源鸡杆菌的致鸡输卵管炎、输卵管囊肿等的机制和毒力因子的探究成为科学研究的热点[7]，已报道的鸭源鸡杆菌毒力相关因子包括GtxA毒素(Gallibacterium toxin，GtxA)、外膜蛋白(Outer membrane proteins，Omps)、菌毛(Fimbrial)、外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)及金属蛋白酶(Metalloproteases)等[8]。OmpW是普遍存在于革兰阴性菌中的一类特殊的孔蛋白，与疏水性分子的跨膜转运功能密切相关[9-11]。据报道OmpW有许多重要的性能，包括免疫原性、抗环境压力、抗药性、抗补体杀伤作用等，且与细菌毒力的增加及感染疾病的产生相关[12-15]。RTX毒素是一种通过Ⅰ型分泌系统分泌到细胞外的成孔蛋白，可直接袭击宿主细胞，支配病原菌对宿主细胞的作用[16-18]。鸭源鸡杆菌RTX样毒素GtxA对多种宿主的红细胞具有溶血活性，且对鸡巨噬细胞株HD11具有白细胞毒活性[19-20]。GtxA与OmpW都是鸭源鸡杆菌重要的毒力因子，明确两者对鸭源鸡杆菌的影响及其相互关系对探究鸭源鸡杆菌的致病机理具有重要意义。
鉴于此，本研究以中国分离株鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG (RZ)为研究对象，在缺失株RZΔompW的基础上进一步构建突变株RZΔompWΔgtxA，分析突变株生物学特性变化，同时利用实验室前期成熟的鸡原代输卵管上皮细胞感染模型[21-22]及小鼠感染模型[23]，探究OmpW及GtxA毒素在鸭源鸡杆菌感染中的作用及二者的互作关系，为更深一步研究鸭源鸡杆菌的致病机理提供依据。
1 材料和方法 1.1 菌株与质粒 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG(RZ)株由本实验室分离鉴定并保存[24]；鸭源鸡杆菌缺失株RZΔompW及RZΔgtxA由本实验室构建保存[12, 25]；pBC-Tn903质粒(哈尔滨兽医研究所，郭东春副教授惠赠)；pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 试剂和培养基 Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、DNA Marker、限制性内切酶(大连宝生物工程有限公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(天津三箭生物股份有限公司)，兔抗重组蛋白rGtxA多抗(实验室制备保存)[25]，超灵敏ECL化学发光即用型底物(AR1173)购自博士德生物工程有限公司；L-天冬氨酸，L-谷氨酸，富马酸(反丁烯二酸)，NaCl，K2HPO4，KH2PO4，吐温80，L-胱氨酸，L-酪氨酸，L-瓜氨酸，L-苯丙氨酸，L-丝氨酸，L-丙氨酸，CaCl2，MgSO4，无维生素酪蛋白氨基酸和BHI培养基(北京索莱宝科技有限公司)；血琼脂平板(郑州贝瑞特有限公司)，酵母浸膏、蛋白胨(大连宝生物工程有限公司)。
1.3 引物的设计与合成 参照文献[25]从NCBI(GenBank登录号NC015460.1)获得gtxA基因序列，设计上游同源臂引物gtxA-U-F/gtxA-U-R、下游同源臂引物gtxA-D-F/ gtxA-D-R、转化片段引物PSKX-F/PSKX-R及突变菌株鉴定引物gtxA-T-F/gtxA-T-R。同时根据质粒pBC-Tn903的序列信息，设计卡那霉素的引物Kan-F/Kan-R。本研究所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 1)。
表 1. 构建突变株RZ ΔompWΔgtxA所需引物 Table 1. Primer used in establishing RZΔompW ΔgtxA mutant strain
| Primer name | Primer sequence (5'→3') | Amplicon size/bp |
| gtxA-U-F | TCCCCCCGGGCCAAAATGGAGTAGTGAT | 1507 |
| gtxA-U-R | CGCGGATCCCTGTTGCAGATTGACAAC | |
| gtxA-D-F | CGCGGATCCAAGCAAGAAAACAGCCA | 1498 |
| gtxA-D-R | AACTGCAGCTCGGTGAAATGGTTAA | |
| Kan-F | CGCGGATCCACATAAACAGTAATACAA | 966 |
| Kan-R | CGCGGATCCTTGTCGGGAAGATGCG | |
| gtxA-T-F | ACCTTATGTATGCTCCTATG | Wild: 2677 Mutant: 1396 |
| gtxA-T-R | AAAAATCGGGCAGGAAATCT | |
| PSKX-F | CTCCAAAATGGAGTAGTGAT | 4001 |
| PSKX-R | GCTCGGTGAAATGGTTAAT | |
| Underlined are protective bases and restriction sites. | ||
表选项
1.4 同源重组质粒pMD18T-U-K-D的构建 以鸭源鸡杆菌基因组为模板，利用引物gtxA-U-F/gtxA-U-R与gtxA-D-F/gtxA-D-R扩增获得gtxA基因上下游同源臂。同时以pBC-Tn903质粒为模板PCR扩增获得卡那霉素筛选标记。用XmaI和BamH I对回收纯化上游同源臂双酶切构建pMD18T-U质粒。回收纯化的下游同源臂和pMD18T-U质粒经BamH I和Pst I双酶切构建pMD18T-U-D，然后将该质粒和抗性标记片段经Bam H I单酶切、碱性磷酸酶处理后进行连接构建pMD18T-U-K-D，将其转入DH5α感受态细胞，挑选转化菌落，PCR、酶切鉴定为阳性的转化子进一步序列测定，序列鉴定正确后，保存备用。
1.5 RZΔompWΔgtxA基因突变株的构建及筛选 以重组质粒pMD18T-U-K-D为模板，用引物gtxA-T-F/gtxA-T-R进行PCR扩增U-K-D片段。依据Poje等[10]报道的方法制备鸭源鸡杆菌RZΔompW株感受态细胞，加1 μg转化片段U-K-D到1 mL感受态细胞中，37 ℃、100 r/min培养25 min；加2 mL含5 %犊牛血清的BHI，37 ℃、100 r/min培养100 min后涂于卡那霉素抗性平板，37 ℃、48 h后挑选转化子。对挑选到的能够稳定表达Kan+的菌株提取基因组，用gtxA-T-F/gtxA-T-R引物进行PCR鉴定。鉴定阳性的转化子扩增物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.6 Western blotting鉴定 将鸭源鸡杆菌RZ株和RZΔompWΔgtxA单一菌落接种至不含Kan+抗性的BHI液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养12 h，当其OD600=1.0时，收集菌体先进行SDS-PAGE，然后以兔抗重组蛋白rGtxA多抗为一抗，辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体为二抗，进行Western blotting分析。
1.7 突变株RZΔompWΔgtxA生物学特性分析 采用分区划线法分别将鸭源鸡杆菌RZ株、RZΔompW、RZΔgtxA和RZΔompWΔgtxA接种于绵羊血琼脂平板，37 ℃培养24 h，观察各菌株的溶血活性、菌落特征。另外，在相同培养条件下，取上述各菌株分别同步接种于BHI液体培养基中，37℃、200 r/min培养，间隔1 h测定OD600，每个测定均重复3次，绘制每株细菌的生长曲线。
1.8 突变株的遗传稳定性分析
1.8.1 突变株的体外遗传稳定性检测: 取RZΔompW ΔgtxA单菌落划线于BHI固体培养基中连续盲传10代，从不同代次中随机挑取单菌落于5 mL含Kan+抗性的BHI液体培养基中培养，用gtxA-T-F/gtxA-T-R引物PCR扩增鉴定RZΔompWΔgtxA中gtxA基因缺失的遗传稳定性。
1.8.2 突变株的小鼠体内遗传稳定性检测: 挑取RZΔompWΔgtxA株单菌落于5 mL的BHI液体培养基中，培养至菌体量为1.6×108 CFU/mL后重悬菌体，每只小鼠(购自河南省实验动物中心，体型大小一致的8周龄清洁级昆明小鼠)腹腔注射500 μL RZΔompWΔgtxA株，给对照组小鼠腹腔注射等剂量PBS作为对照，7 d后剖检存活小鼠并取各组织器官进行细菌分离，PCR进行鉴定。采用分区划线法将鉴定正确的鸭源鸡杆菌菌株继续培养并对小鼠进行腹腔注射，检测观察RZΔompWΔgtxA株中gtxA基因缺失株在小鼠体内的遗传5代的稳定性。
1.9 突变株RZΔompWΔgtxA对原代输卵管上皮细胞的黏附的测定 鸡原代输卵管上皮细胞的制备与黏附试验参照文献[11, 21-22, 26-27]提供的方法并稍加改动。长满单层的细胞更换新培养液并以感染复数(MOI=100)加入待测细菌，置37 ℃、5%的CO2培养30–120 min，期间每间隔30 min取样，弃培养基，经PBS洗涤及胰酶-EDTA消化，离心收集细胞，用1%的Triton X-100溶解细胞，并用PBS混匀制成悬液做10倍倍比稀释，各稀释度取100 μL进行活菌计数，计算每孔溶解液中的细菌数量。每个样品均设置4个重复，试验重复3次，取每孔黏附细菌的数量的对数值作为结果。
1.10 RZΔompWΔgtxA感染鸡原代输卵管上皮细胞后细胞凋亡检测 鸡原代输卵管上皮细胞制备方法同1.9。根据Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行试验操作；设RZ、RZΔompW、RZΔgtxA、RZΔompWΔgtxA和对照组，共5个试验组，将感染2、4、6 h后的细胞分别用胰酶(无EDTA)消化后收集，PBS洗涤2次(2000 r/min，5 min)；依次加入5 μL Annexin V-FITC于洗涤后的细胞中，混匀，然后分别加入5 μL Propidine iodide混合均匀；室温避光作用10 min后置荧光显微镜下观察凋亡情况。Annexin V与凋亡早期细胞膜结合后荧光显微镜下呈绿色荧光；Propidium iodide结合中晚期凋亡和死细胞后，细胞核呈红色荧光，由此来判断RZΔompWΔgtxA致鸡原代输卵管上皮细胞凋亡程度的检测。
1.11 半数致死量(LD50)的测定 对鸭源鸡杆菌RZ株、RZΔompW株、RZΔgtxA和RZΔompWΔgtxA株分别进行LD50测定，具体操作如下：在BHI培养基中37 ℃、200 r/min振荡培养至OD600值约为0.8，收集菌体，用PBS洗涤2次，并用PBS将菌液浓度调整为2.0×109 CFU/mL，以5倍倍比法稀释成4个稀释度；取60只体型大小一致的8周龄清洁级昆明小鼠(购自河南省实验动物中心)，随机分为5组(12只/组)，其中1–4组分别腹腔注射倍比稀释的菌液0.4 mL；第5组为对照组，注射0.4 mL PBS，连续7 d观察小鼠的死亡情况，按改良寇氏法分别计算RZ株、RZΔompW株、RZΔgtxA和RZΔompWΔgtxA的LD50。
1.12 统计分析 对试验结构采用Graphpad Prism 7作图表示，IBM SPSS Statisitics26软件进行数据分析，同时采用方差分析T检验进行统计学处理，以P < 0.05为差异显著。
2 结果和分析 2.1 重组质粒pMD18T-U-K-D构建与鉴定 以鸭源鸡杆菌基因组为模板，经PCR扩增分别得到与预期大小一致的gtxA基因1508 bp左右上游同源臂、966 bp左右下游同源臂；以pBC- Tn903质粒为模板PCR扩增获得大小为1484 bp左右的卡那抗性片段。对构建的重组质粒pMD18T-U-K-D分别采用PCR、BamH I单酶切和用Xma I和PstI双酶切鉴定，酶切片段与预期片段大小一致(图 1)，经测序结果正确，表明重组质粒pMD18T-U-K-D正确构建。
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| 图 1 质粒pMD18T-U-K-D PCR及酶切鉴定 Figure 1 Plasmid pMD18T-U-K-D PCR and digestion identification. M: DL15000 DNA marker; lane 1: Plasmid pMD18T-U-K-D PCR product; lane 2: Plasmid pMD18T-U-K-D; lane 3: BamH I single digestion; lane 4: Xma I and Pst I double digestion. |
| 图选项 |
2.2 突变株RZΔompWΔgtxA的鉴定 用引物gtxA-T-F/gtxA-T-R对具有稳定Kan+的鸭源鸡杆菌菌液进行PCR鉴定。突变株RZΔompWΔgtxA和重组质粒约在1396 bp处出现目的条带，鸭源鸡杆菌RZ株在约2677 bp处出现目的条带(图 2)，通过进一步对目标序列测序分析，证实了突变株RZΔompWΔgtxA的扩增片段为靶片段U-K-D，证明gtxA基因缺失成功，突变株RZΔompWΔgtxA构建正确。
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| 图 2 G.anatis RZΔompWΔgtxA突变株PCR鉴定 Figure 2 PCR analysis of G. anatis strain RZΔomp WΔgtxA. M: 250 bp ladder DNA marker; lane 1: RZΔompW ΔgtxA; lane 2: Plasmid pMD18T-U-K-D; lane 3: Wild type strain RZ. |
| 图选项 |
2.3 突变株RZΔompWΔgtxA的Western blotting鉴定 对突变株RZΔompWΔgtxA及RZ株进行Western blotting验证，结果显示，突变株RZΔompWΔgtxA在相应大小的位置没有蛋白条带，而亲本株RZ在大约220 kDa处出现条带(图 3)，表明突变株RZΔompWΔgtxA不表达GtxA，从而在蛋白水平证明突变株RZΔompWΔgtxA构建成功。
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| 图 3 SDS-PAGE (A)及Western blotting (B)分析鸭源鸡杆菌RZ和RZΔompWΔgtxA Figure 3 Analysis of RZΔompWΔgtxA and RZ by SDS-PAGE and Western blotting. M1: Prestained protein ladder 10–250 kDa; M2: Prestained protein ladder 10–170 kDa. lane 1: RZ; lane 2: RZΔompWΔgtxA. |
| 图选项 |
2.4 突变株RZΔompWΔgtxA的生物学特性分析 鸭源鸡杆菌RZ株和突变株RZΔompW、RZΔgtxA、RZΔompWΔgtxA经37 ℃培养24 h后，均长出半透明、灰白色、有完整边缘、直径1–2 mm的圆形菌落；3株缺失突变株菌落大小形态与原始亲本株RZ无显著变化，但RZΔgtxA、RZΔompWΔgtxA溶血环均消失而RZΔompW溶血环无明显变化，表明gtxA的缺失改变了鸭源鸡杆菌溶血活性，ompW和gtxA单独或者同时缺失菌落形态及大小没有显著影响。
在相同培养条件下培养鸭源鸡杆菌RZ、RZΔompW、RZΔgtxA和RZΔompWΔgtxA，每隔1 h测定菌液OD600值并绘制细菌生长曲线(图 4)。结果显示，4株菌生长速率和生长状态相仿，虽生长曲线显示RZΔompWΔgtxA与其他3株相比生长速度稍缓慢，但无统计学差异(P值均大于0.05，差异不显著)。
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| 图 4 鸭源鸡杆菌生长曲线 Figure 4 The growth curve of G. anatis. The values shown are the means of at least three biological replicates, with the error bars representing standard deviations of the mean. Statistical significance was determined by T test. |
| 图选项 |
2.5 突变株RZΔompWΔgtxA遗传稳定性分析 将突变株RZΔompWΔgtxA接种BHI培养基中持续盲传至10代，依次挑取1至10代单菌落，用引物gtxA-T-F/gtxA-T-R进行PCR鉴定，结果显示，各代次突变株均扩增出1396 bp左右目的条带(图 5-A)。同时用RZΔompWΔgtxA在小鼠体内连续传递5代，分离各组织中细菌，分别使用鸭源鸡杆菌特异性鉴定引物和突变株RZΔompWΔgtxA特异性鉴定引物进行PCR鉴定，结果显示各代次均能使用鸭源鸡杆菌特异性鉴定引物扩增出3条目的条带，鉴定正确(图 5-B)；突变株RZΔompWΔgtxA特异性鉴定引物均能扩增出各代次长度约为1396 bp的目的条带(图 5-C)，由此表明在突变株RZΔompW基础上构建的突变株RZΔompWΔgtxA在普通培养基和小鼠体内均能稳定遗传gtxA基因片段的缺失。
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| 图 5 突变株小鼠体内、体外遗传稳定性分析鉴定 Figure 5 Identification of mutants by genetic stability analysis in mice in vitro. A: Analysis of the heredity stability in vitro. M: DNA marker DL2000; lane 1–10: RZΔompWΔgtxA; lane 11: Negative control. B: G. anatis specific PCR identification. C: Identification of mutants by genetic stability analysis in mice. M: 250 bp ladder DNA marker; lane 1–5: RZΔompWΔgtxA; lane 6: Negative control. |
| 图选项 |
2.6 突变株RZΔompWΔgtxA对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力 4株鸭源鸡杆菌均能黏附在鸡原代输卵管上皮细胞，由图 6可知，60 min至120 min 4组鸭源鸡杆菌的黏附能力随时间延长每个孔中黏附细菌数量也逐渐增加，在90 min时达到最大值；但突变株RZΔompW、RZΔgtxA和RZΔompWΔgtxA对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力始终低于鸭源鸡杆菌亲本株RZ，在3个时段组间亲本株RZ与RZΔompW、RZΔgtxA和RZΔompWΔgtxA对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力相比差异均显著(P < 0.05)。RZΔompWΔgtxA在不同时段对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力明显低于其他3组，且差异显著(P < 0.05)。
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| 图 6 鸭源鸡杆菌亲本株RZ、RZΔompW、RZΔgtxA和RZΔompWΔgtxA对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附 Figure 6 Kinetics of adherence of G. anatisYu-PDS- RZ-1-SLG, RZΔompW, RZΔgtxA and RZΔompW ΔgtxA strains to COECs primary chicken oviduct epithelial cells. The values shown are the means of at least three biological replicates, with the error bars representing standard deviations of the mean. Statistical significance was determined by T test; *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001. |
| 图选项 |
2.7 突变株RZΔompWΔgtxA的细胞凋亡试验 用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测各受试菌株感染鸡原代输卵管上皮细胞后不同时间点对细胞凋亡的影响。荧光染色显微镜观察结果显示(图 7)，与鸭源鸡杆菌RZ、突变株RZΔompW及RZΔgtxA相比，突变株RZΔompWΔgtxA感染鸡输卵管上皮原代细胞后诱导其发生凋亡的能力和程度明显减弱。
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| 图 7 鸭源鸡杆菌感染输卵管上皮细胞后对细胞发生凋亡的影响 Figure 7 The effect on COECs cell primary chicken oviduct epithelial cells apoptosis after infection with G. anatis. |
| 图选项 |
2.8 半数致死量(LD50)的测定 对小鼠注射鸭源鸡杆菌RZ、突变株RZΔgtxA、突变株RZΔompW及突变株RZΔompWΔgtxA不同稀释度的各菌液，并观察记录死亡数据，依据寇氏法得出亲本株RZ、RZΔompW、RZΔgtxA及RZΔompWΔgtxA的LD50分别为2.73×108 CFU、4.08×108 CFU、4.32×108 CFU、8.61×108 CFU(图 8)。
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| 图 8 小鼠半数致死量(LD50)的测定 Figure 8 Determination of the median lethal dose (LD50) in mice. |
| 图选项 |
3 讨论 鸭源鸡杆菌作为鸡杆菌属近期得以确认的条件性致病菌之一，已有大量研究表明其在临床致病和动物福利方面的重要影响，有关鸭源鸡杆菌的生物学特性分析、致病基因鉴定、毒力因子间的相互关系的探究已经成为国内外的研究热点[24, 28-33]。RTX毒素是革兰阴性菌中普遍存在的成孔蛋白，鸭源鸡杆菌分泌型毒素GtxA是当前研究最多的毒力因子，是溶血型鸭源鸡杆菌具有溶血活性的基础，有研究表明其还可能与细菌的免疫逃避有关[34-36]。OmpW属于外膜蛋白家族成员之一，在鸭源鸡杆菌中普遍存在，基因保守性较高，含有多个抗原表位，与抗环境应激能力、免疫原性、耐药性和细菌毒力相关[13-15]。
自然条件下有些细菌为适应环境变化而拥有自然转化能力，并由此获得外源DNA、得到稳定遗传的新性状。Kristensen等[11]在2012年发现鸭源鸡杆菌有自然感受性的特点，且发现通过电转化方式不能有效地对染色体整合，环形质粒转化效率远远低于线性DNA片段，而自然转化的效率明显高于电转化[20]。因此，本研究利用该菌的自然感受性特点，通过自然转化法将靶基因片段以线性化形式转化进入RZΔOmpW单基因缺失株中，成功构建了RZΔompW ΔgtxA双基因缺失株，并进行相关特性分析。相比RZ株，突变株RZΔompW、RZΔgtxA与RZΔompWΔgtxA菌落形态、生长特性无显著变化，但后两者溶血活性消失；且突变株RZΔOmpW/ΔgtxA能够稳定遗传gtxA基因的缺失；表明ompW、gtxA基因的缺失并未影响鸭源鸡杆菌正常的生长代谢，两个基因可能不是鸭源鸡杆菌正常生长过程中的必需基因，与实验室前期研究成果一致[12-14, 25, 36]；研究表明，鸭源鸡杆菌分泌型毒素GtxA是鸭源鸡杆菌具有溶血活性的基础[34-36]，本研究中突变株RZΔompW溶血活性正常而RZΔompWΔgtxA溶血活性消失，进一步验证了gtxA基因参与调控鸭源鸡杆菌的溶血作用。黏附力是决定细菌致病性的关键环节[37]，本研究结果显示突变株RZΔompW、RZΔgtxA和RZΔompWΔgtxA均能黏附鸡原代输卵管上皮细胞，且随着时间的增加而上升，90 min时达到最大值，但黏附力在各时段均低于RZ株，尤其是双基因缺失突变株RZΔompWΔgtxA的黏附力与各菌株差异更显著，黏附力下降尤其明显，由此表明，ompW与gtxA两基因均与鸭源鸡杆菌的黏附能力有关。在细胞凋亡测定试验中，荧光显微镜下能很清晰地显示出双缺失突变株RZΔompWΔgtxA诱导细胞凋亡的能力明显低于单缺失株RZΔompW、RZΔgtxA和原始株RZ，差异显著，且突变株RZΔompWΔgtxA、RZΔompW和RZΔgtxA诱导细胞凋亡的能力与原始分离株RZ相比均明显下降，该测定结果显示了ompW与gtxA均与鸭源鸡杆菌诱导宿主细胞发生凋亡能力有关，但ompW和gtxA基因在鸭源鸡杆菌诱导宿主细胞发生细胞凋亡的过程中发挥的作用机制仍有待进一步的研究；此外，我们在做荧光显微镜测定细胞凋亡的同时进行了流式细胞术检测，检测结果显示各菌株诱导细胞凋亡的趋势与荧光显微镜下测定是一致的，但数据分析差异不如荧光显微镜下观察显著，其主要原因可能由于原代细胞培养更易受化学试剂影响、试验处理难度系数高及实验操作等过程造成的影响，导致进行流式细胞术检测结果与荧光显微镜图片相比较显著度稍微降低，故我们仅仅展示了荧光显微镜下检测的结果。
小鼠半数致死量(LD50)测定结果显示亲本株RZ的LD50最低，RZΔOmpW/ΔgtxA最高(8.61×108 CFU)，对小鼠致病力也均比单基因缺失株明显降低，基于试验结果，我们认为两者可能具有协同作用。另外，该菌虽然也能通过电转化或自然转化法低效率摄入一些环形质粒，但其具有倾向于摄取自身DNA的特性(常用大肠杆菌载体质粒往往不行)[20]。鉴于细菌的上述特点，本研究尽管尝试用与鸭源鸡杆菌同科的其他菌的穿梭载体进行转化，但一直未能成功构建回补株。
本研究结果表明，毒力因子OmpW和GtxA的缺失对鸭源鸡杆菌的生长性能和菌落形态无明显影响，与细菌诱导细胞凋亡的能力、粘附细胞性能、毒力、致病力等密切相关，且ompW和gtxA基因同时缺失引起其黏附力、细胞凋亡等下降尤为显著。但鉴于细菌的感染是个复杂的过程，两基因之间呈累积作用还是协同作用，还有待进一步研究并结合其他因子深入分析。
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