赵晶1, 邢志富1, 田茂雄2, 刘晓宇3, 王媛媛2, 刘丹1, 陈立杰1, 段玉玺1
1. 沈阳农业大学植物保护学院, 辽宁沈阳 110866;
2. 沈阳农业大学生物科学技术学院, 辽宁 沈阳 110866;
3. 沈阳农业大学理学院, 辽宁沈阳 110866
收稿日期：2019-12-27；修回日期：2020-02-21；网络出版日期：2020-06-16
基金项目：公益性行业(农业)科研专项(201503114-12)
*通信作者：段玉玺, Tel/Fax:+86-24-88487180;E-mail:duanyx6407@163.com.
摘要：[目的] 有关Microbacterium maritypicum在植物线虫生物防治方面的研究较少，探究菌株M.maritypicum Sneb159的杀线虫活性，明确菌株发酵液中具有杀线虫活性的物质，为生物农药的开发提供理论依据。[方法] 本研究检测了菌株Sneb159发酵液对大豆胞囊线虫二龄幼虫的触杀活性；并以触杀活性为追踪，采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析及半制备高效液相色谱等技术对菌株Sneb159发酵滤液中的活性物质进行分离纯化；采用核磁共振波谱对纯化物进行结构鉴定。[结果] 菌株Sneb159具有杀线虫活性，在24 h和48 h处理组中线虫的死亡率均显著高于对照组。从菌株Sneb159发酵滤液中分离得到杀线虫活性物质A6，经结构鉴定确定该物质为苯乙酰胺。[结论] 首次发现M.maritypicum对大豆胞囊线虫的触杀作用，并且明确活性物质为苯乙酰胺。结果表明菌株M.maritypicum Sneb159和苯乙酰胺在大豆胞囊线虫的生物防治方面具有较好的应用潜力。
关键词：微杆菌苯乙酰胺大豆胞囊线虫杀线虫活性物质分离纯化
Isolation and identification of nematicidal compound from Microbacterium maritypicum Sneb159
Jing Zhao1, Zhifu Xing1, Maoxiong Tian2, Xiaoyu Liu3, Yuanyuan Wang2, Dan Liu1, Lijie Chen1, Yuxi Duan1
1. College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning Province, China;
2. College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning Province, China;
3. College of Sciences, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning Province, China
Received: 27 December 2019; Revised: 21 February 2020; Published online: 16 June 2020
*Corresponding author: Yuxi Duan. Tel/Fax: +86-24-88487180; E-mail: duanyx6407@163.com.
Foundation item: Supported by the Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest of China (201503114-12)
Abstract: [Objective] Few studies have been reported about the biological control of plant parasitic nematodes by Microbacterium maritypicum. The purpose of this study was to determine the nematicidal activity of M. maritypicum Sneb159. In addition, nematicidal active compounds were separated from the culture supernatant of strain Sneb159. The study will provide fundamental knowledge about the development of biological pesticides. [Methods] We evaluated the direct antagonism to the second-stage juveniles (J2s) of Heterodera glycines in vitro. The nematicidal compound was separated and purified from culture supernatant of strain Sneb159 using organic solvent extraction, followed by silica gel chromatography and semi preparative high performance liquid chromatography according to the mortality of J2s. We characterized the compound by nuclear magnetic resonance spectrum. [Results] Strain Sneb159 showed strong nematicidal activity. The mortality of H. glycines J2s in Sneb159 treatment was significantly higher than that in the control after 24 h and 48 h incubation. One active compound, phenylacetamide, was obtained from culture supernatant of strain Sneb159. [Conclusion] To our knowledge, this is the first report to describe the nematicidal activity of M. maritypicum against H. glycines. The results suggested that strain Sneb159 and phenylacetamide have potential applications for biological control of H. glycines.
Keywords: Microbacterium maritypicumphenylacetamideHeterodera glycinesnematicidal compoundseparation and purification
大豆胞囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe，soybean cyst nematode)病是大豆生产中最常见的病害之一。该病害的发病特点为分布广泛、传播途径多、为害时间长，严重影响大豆的产量和品质，一般造成减产10%–20%，严重地块高达70%–90%，甚至颗粒无收[1]。大豆胞囊线虫病的防治手段有种植抗病品种、农业措施、化学防治及生物防治。种植抗病品种是经济有效且简单易行的方法，但是长期种植单一品种可能会造成抗性丧失，因此还需要结合农业措施使用[2]。化学防治效果明显，但是长期使用化学农药破坏环境危害人畜健康，因此许多化学农药已经被禁止使用[3-4]。随着人们环保意识的增强，植物线虫的防治也要朝向低毒、低残的方向发展。生物防治绿色环保对非靶标生物安全，已经逐渐成为现阶段的研究热点。
近年来越来越多的研究表明微生物的代谢产物对植物线虫具有防治作用。条纹炭角菌(Xylaria grammica) KCTC 13121BP产生的grammicin显著抑制南方根结线虫二龄幼虫的活性[5]。谭卓等[6]研究发现，从委内瑞拉链霉菌Snea253的发酵液中分离出来的物质邻苯二甲酸二丁酯对南方根结线虫具有触杀活性。2, 4-二乙酰基间苯三酚是荧光假单胞菌产生的次生代谢产物，研究发现该物质对马铃薯胞囊线虫和爪哇根结线虫二龄幼虫的活性均具有抑制作用[7-8]。坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus) DS-1代谢产生的丝氨酸蛋白酶Sep1可以降解线虫的肠道和表皮相关蛋白[9]。
1998年，Takeuchi和Hatano[10]首次提出将Flavobacterium maritypicum更名为Microbacterium maritypicum。目前，关于微杆菌在植物病害生物防治方面的研究较少。史应武等[11]于2013年申请了关于应用甜菜内生的微杆菌M. maritypicum TNJK2011防控甜菜病害的发明专利，研究发现M. maritypicum TNJK2011对立枯病、根腐病、褐斑病和蛇眼病均有显著的防治效果。我们之前的研究发现，采用M. maritypicum Sneb159的发酵液包衣处理大豆可以显著降低大豆胞囊线虫的胞囊数量，Sneb159通过诱导大豆产生抗病性来减少线虫的侵染，并且可以延缓线虫的发育[12]。
本研究检测了Sneb159发酵液的杀线虫活性；采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析和半制备高效液相色谱等技术对菌株Sneb159发酵滤液的杀线虫活性物质进行分离纯化；以大豆胞囊线虫二龄幼虫为指示物进行活性追踪；利用核磁共振波谱对活性物质进行结构解析。本研究为大豆胞囊线虫的生物防治提供了更多的资源，为生物农药的开发应用提供了理论依据。
1 材料和方法 1.1 主要仪器与试剂 SMZ800体式显微镜(日本Nikon公司)，旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)，冷冻干燥机(丹麦Gene公司)，高速冷冻离心机(美国Thermo公司)，Agilent 7890B分析用高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Waters 600半制备高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Bruker Avance 600 MHz核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)。
硅胶为200–300目(上海五四化学试剂厂)，色谱用乙腈(天津四友精细化学品有限公司)，其他化学试剂均采购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 供试线虫和细菌菌株的培养 供试线虫为大豆胞囊线虫3号小种，胞囊土样采自沈阳农业大学大豆试验田[13]。供试菌株为M. maritypicum Sneb159，由沈阳农业大学北方线虫研究所提供。
菌株Sneb159发酵液的制备：将保藏于–80 ℃的菌株Sneb159接种于LB固体培养基，30 ℃培养48 h后移接到新的LB固体培养基上，重复此步骤2次，保证菌株充分活化。将活化后的菌株Sneb159接种到LB液体培养基中，以200 r/min转速振荡培养48 h得到种子液，将种子液以1%的接种量接种到新的LB液体培养基中，培养72 h后使用，准备发酵液9 L。
1.3 菌株Sneb159发酵液杀线虫活性测试 取300 μL的Sneb159发酵液加入到0.5 mL的离心管中，加入大豆胞囊线虫二龄幼虫的虫悬液10 μL (30条)，26 ℃黑暗条件下培养。以无菌蒸馏水为对照组，每个处理3次重复，试验重复3次。培养24 h和48 h后镜检，统计线虫的死亡数量，计算线虫的死亡率。
死亡率(%)=[(处理前活线虫数量–处理后活线虫数量)/处理前活线虫数量]×100
1.4 杀线虫活性物质有机溶剂萃取 将发酵液在4 ℃、6000 r/min条件下离心10 min去除菌丝体，上清液为发酵滤液。将发酵滤液经过旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后4 ℃静置24 h。将醇沉后的上清液抽滤，在50 ℃的条件下旋转蒸发浓缩后冷冻干燥备用。
将干燥滤液用无菌蒸馏水溶解，分别按照3倍体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的顺序萃取，分别收集石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层及水层。将收集的各层溶液利用旋转蒸发进行浓缩，加入少量无菌蒸馏水溶解后分别冻干，冻干粉末用1% DMSO溶解，配制成500 μg/mL的工作液。以1% DMSO溶液为对照，每个处理3次重复，试验重复3次。培养24 h后镜检，统计线虫的死亡数量，计算校正死亡率，校正死亡率的公式参考Schneider-Orelli公式[14-15]。
校正死亡率(%)=[(处理组死亡率%–对照组死亡率%)/(100–对照组死亡率%)]×100
1.5 杀线虫活性物质硅胶柱层析分离 对有机溶剂萃取粗提物中乙酸乙酯层组分采用硅胶柱层析法进行初步分离。称取200–300目硅胶70 g石油醚浸泡，充分搅拌均匀。取1 g粗提物加入少量甲醇溶解，按照1:1.5加入硅胶，干法上样，硅胶柱的尺寸为3.0 cm×30 cm。用10种不同极性的洗脱液洗脱，分别是石油醚-乙酸乙酯(9:1，7:3，5:5，3:7，1:9)和乙酸乙酯洗脱；然后用乙酸乙酯-甲醇(1:9，5:5)洗脱；最后用甲醇和甲醇-水(8:2)洗脱，同时为了减少拖尾现象在各层洗脱液中加入0.1%的甲酸。每管收集40 mL，采用薄层层析色谱法检测每个管中洗脱液组分，将相同的斑点合并，浓缩干燥后进行活性测试。
将各组分以1% DMSO溶液溶解，配制成200 μg/mL的工作液，以1% DMSO溶液为对照，每个处理3次重复，分别检测24、48、72 h线虫的死亡情况，计算校正死亡率。
1.6 杀线虫活性物质分离及制备 将利用硅胶柱层析分离的活性组分溶解于甲醇中，经过0.45 μm有机滤膜过滤，利用分析型高效液相色谱分析后，再利用半制备高效液相色谱进一步分离制备。色谱条件为Ultimate AQ-C18 (10 mm×250 mm，10 μm)，流动相为乙腈和水(3:7)，检测波长为213 nm，流速为2 mL/min，进样量为0.5 mL。收集吸收峰A6的洗脱液，减压旋转蒸发除去乙腈，冷冻干燥得到活性化合物。
1.7 杀线虫活性物质纯度检测 取少量A6样品溶解于甲醇，通过0.45 μm有机滤膜过滤后经过高效液相色谱检测。色谱条件为Ultimate AQ-C18 (4.6 mm×250 mm，10 μm)，乙腈和水为流动相(4:6)，检测波长为213 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。
1.8 杀线虫活性物质结构鉴定 核磁共振波谱工作条件：样品用氘代氯仿溶解后在Bruker Avance 600 MHz上扫描，测定氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)，测试温度为25 ℃，氢谱的扫场范围为–2–16 ppm，碳谱的扫场范围为–20–220 ppm。
2 结果和分析 2.1 菌株Sneb159发酵液杀线虫活性结果 经过菌株Sneb159发酵液处理大豆胞囊线虫二龄幼虫24 h和48 h，线虫的死亡率分别为87.2%和93.7%；对照组中线虫的死亡率分别为11.8%和13.7% (图 1)。Sneb159处理组中的线虫死亡率显著高于对照组。
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| 图 1 菌株Sneb159发酵液对大豆胞囊线虫二龄幼虫的体外致死率 Figure 1 Nematicidal activity of Sneb159 against Heterodera glycines J2s in vitro. * indicates significant differences at P < 0.05 according to t-test. |
| 图选项 |
2.2 菌株Sneb159有机溶剂萃取结果 利用不同极性的有机溶剂对菌株Sneb159的发酵滤液进行初步分离，比较各层组分的杀线虫活性。结果表明(图 2)，其中乙酸乙酯层组分杀线虫活性最高，校正死亡率为75.4%；水层组分杀线虫活性次之，校正死亡率为69.3%；正丁醇层组分的杀线虫活性最低，校正死亡率为49.6%。因此，对乙酸乙酯层组分进行下一步的分离。
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| 图 2 菌株Sneb159有机溶剂萃取各组分对大豆胞囊线虫的致死效果 Figure 2 Nematicidal activity of the organic extraction components of strain Sneb159 against Heterodera glycines. |
| 图选项 |
2.3 有机溶剂萃取粗提物硅胶柱层析结果 对有机溶剂萃取试验中杀线虫活性最高的乙酸乙酯层组分进行硅胶柱层析分离，共收集112管组分，经过薄层层析检验，合并获得12个组分。检测各组分在处理24、48、72 h的杀线虫活性，结果表明(表 1)，其中组分20–23在各个时间点的杀线虫活性均为最高，在24、48、72 h的校正死亡率分别为47.8%、79.0%和94.6%。处理72 h线虫的校正死亡率高于50%的组分有24–34、47–57、68–75和76–83，校正死亡率分别为55.9%、57.9%、55.0%和65.2%。选择其中杀线虫活性最高的组分20–23进行下一步的分离。
表 1. 不同组分处理大豆胞囊线虫的校正死亡率 Table 1. Corrected mortality of Heterodera glycines in the treatment of different components
| Components | Corrected mortality of 24 h treatment/% | Corrected mortality of 48 h treatment/% | Corrected mortality of 72 h treatment/% |
| 1–19 | 0.4 | 29.7 | 31.6 |
| 20–23 | 47.8 | 79.0 | 94.6 |
| 24–34 | 2.1 | 3.9 | 55.9 |
| 35–41 | 13.5 | 30.4 | 30.4 |
| 42–46 | 16.0 | 19.7 | 41.7 |
| 47–57 | 8.7 | 21.3 | 57.9 |
| 58–67 | 9.5 | 12.4 | 17.6 |
| 68–75 | 8.4 | 4.5 | 55.0 |
| 76–83 | 9.4 | 0.9 | 65.2 |
| 84–96 | 9.4 | 16.3 | 36.2 |
| 97–109 | 14.8 | 17.8 | 34.4 |
| 110–112 | 24.3 | 10.2 | 27.0 |
表选项
2.4 组分20–23分离纯化结果 利用高效液相色谱对组分20–23分析，检测波长为213 nm，洗脱液为乙腈和水。在洗脱3–5 min出现峰A2和A4，为溶剂的吸收峰，8.22 min开始出现单一样品吸收峰(图 3)。采用半制备高效液相色谱对该单一样品峰进行制备，合并收集管得到纯品物质A6。利用高效液相色谱分析该物质的纯度，经检测该物质的含量为90.27%，达到结构鉴定要求(图 4)。
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| 图 3 组分20–23的高效液相色谱洗脱图谱 Figure 3 The HPLC elution spectrum of component 20–23. |
| 图选项 |
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| 图 4 组分A6的高效液相色谱纯度检验结果 Figure 4 Purity test of the compound A6 by HPLC. |
| 图选项 |
2.5 组分A6化学结构鉴定 采用核磁共振波谱对A6进行结构鉴定，从图 5可以看出：1H NMR (600 MHz，CDCl3)谱图显示7.272–7.342 ppm (5H，m，H-Ph)为苯环上的H，说明苯环上为单取代结构；3.64 ppm (2H，S，H-2)为亚甲基质子信号。13C NMR (151 MHz，CDCl3)谱图显示(图 6)：177.49 ppm为羰基的特征信号；133.21、129.30、128.57和127.27 ppm为一组苯环信号，进一步证明该苯环为单取代；40.97 ppm为连有吸电子基团的亚甲基碳信号。根据核磁数据分析与宋福行等[16]的报道，鉴定该化合物为苯乙酰胺(图 7)。
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| 图 5 组分A6的1H NMR谱图 Figure 5 1H NMR spectrum of compound A6. |
| 图选项 |
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| 图 6 组分A6的13C NMR谱图 Figure 6 13C NMR spectrum of compound A6. |
| 图选项 |
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| 图 7 苯乙酰胺的化学结构式 Figure 7 The chemical structural formula of phenylacetamide. |
| 图选项 |
3 讨论 本研究发现M. maritypicum Sneb159的发酵液对大豆胞囊线虫二龄幼虫具有显著的致死作用。许多生防菌株都已经被报道具有毒杀线虫的活性，Yang等[17]检测了包括Trichoderma viride、T. harzinaum、T. hamatum和T. longbrachiatum等在内的329株木霉菌对全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的致死作用，其中15株对全齿复活线虫具有杀线虫活性，14株对秀丽隐杆线虫具有杀线虫活性。用稀释2倍的黑曲霉菌(Aspergillus niger) NBC001和草酸青霉(Penicillium oxalicum) NBC008和NBC012的发酵液处理大豆胞囊线虫的二龄幼虫，校正死亡率仍高于85%[18]。Lu等[19]的研究发现气生微杆菌(M. aerolatum)产生的挥发性气体对秀丽隐杆线虫和南方根结线虫均有致死作用。而关于M. maritypicum对大豆胞囊线虫的触杀作用，本研究为首次报道。
本研究通过有机溶剂萃取、硅胶柱层析和半制备高效液相色谱等技术对M. maritypicum Sneb159发酵滤液中的杀线虫活性物质分离纯化，得到一个活性物质苯乙酰胺。秦伟瀚等[20]从尼泊尔虫草中检测到N, N-二乙基苯乙酰胺，该物质是尼泊尔虫草与青海、西藏产冬虫夏草的差异成分，可能是尼泊尔虫草的一个特异性成分。除此之外，张应阔等[21]研究表明该物质还是驱虫剂的成分。侯宝宏[22]从解淀粉芽孢杆菌TS-1203中分离得到苯乙酰胺，该物质对苹果树腐烂病菌的抑菌活性为62.67%。关于苯乙酰胺防治植物线虫方面的研究较少，仅有研究表明芽孢杆菌的代谢物苯乙酰胺对松材线虫和甘薯茎线虫均有触杀活性，致死中浓度分别为232.98 μg/mL和206.38 μg/mL[23]。
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