余中节, 赵洁, 宋宇琴, 孙志宏
内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室, 农业农村部奶制品加工重点实验室, 内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室, 内蒙古 呼和浩特 010018
收稿日期：2018-08-28；修回日期：2019-02-21；网络出版日期：2019-03-26
基金项目：国家自然科学基金（31622043）；内蒙古自然科学基金（2016JQ04）；内蒙古农业大学****科学基金（2017XJQ-2）
作者简介：孙志宏，男，国家优青，研究员，博士生导师。现就职于内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，从事乳酸菌生物多样性、基因组学和肠道微生物等方面的研究。主持承担了国家自然科学基金、“863计划”研究任务、中科院西部之光、内蒙古科技计划重点项目和内蒙古****培养基金等诸多项目，入选内蒙古自治区“草原英才”工程、内蒙古自治区“321人才工程”。发表学术论文98篇，其中作为第一作者或通信作者的SCI论文36篇，最高影响因子11.329 (Nature Communications)，授权发明专利11项，参编学术专著2部，参与起草2项质量安全地方标准。获内蒙古自治区科学技术进步一等奖、教育部科学技术进步二等奖、内蒙古自治区自然科学二等奖各1项，荣获内蒙古优秀科技工作者称号、内蒙古自治区优秀博士学位论文.
*通信作者：孙志宏, Tel/Fax:+86-471-4301591, E-mail: sunzhihong78@163.com.
摘要：[目的] 以下载自NCBI的分离自猪、家禽类、人类、啮齿类动物的116株L. reuteri和分离自内蒙古锡林郭勒牛、羊和马肠道中的16株L. reuteri为研究对象，解析L. reuteri不同分离株的遗传多样性和宿主特异性，为L. reuteri的开发利用提供理论依据。[方法] 利用MLST技术，以ddl、pkt、leuS、gyrB、dltA、rpoA、recA共7个看家基因为研究靶点，对L.reuteri分离株遗传多样性进行研究，推演分离株与宿主生境的进化关系。[结果] 132株L.reuteri共划分为63个序列型，6个克隆复合体。等位基因序列重组分析发现，在L. reuteri的进化中发生了个别的重组事件，eBURST、MSTree分析表明不同分离源的L. reuteri分离株经历了不同的进化过程，系统发育分析表明132株L. reuteri来自5个Clusters且与分离源表现出较强的相关性。[结论] 本研究利用MLST技术完成了132株L. reuteri肠道分离株的遗传多样性分析，利用MSTree、系统发育等群体结构分析，发现不同分离源菌株有着高度的宿主特异性，表明L. reuteri为适应不同生存环境经历了不同的进化过程。
关键词：罗伊氏乳杆菌多位点序列分型技术肠道宿主特异性
Genetic diversity of Lactobacillus reuteri isolated from intestines
Zhongjie Yu, Jie Zhao, Yuqin Song, Zhihong Sun
Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, Key Laboratory of Dairy Products Processing, Ministry of Agriculture, Inner Mongolia Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Received: 28 August 2018; Revised: 21 February 2019; Published online: 26 March 2019
*Corresponding author: Zhihong Sun, Tel/Fax:+86-471-4301591, E-mail: sunzhihong78@163.com.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31622043), by the Inner Mongolia Natural Science Foundation (2016JQ04) and by the Outstanding Youth Science Fund Project of Inner Mongolia Agricultural University (2017XJQ-2)
Abstract: [Objective] To study genetic diversity and host specificity of different isolates of L. reuteri, we analyzed 132 strains of L. reuteri including 116 strains isolated from human, poultry, rodents and pigs downloaded from NCBI database and 16 strains isolated from cow, sheep and horse in Inner Mongolia. [Methods] Seven housekeeping genes including ddl, pkt, leuS, gyrB, dltA, rpoA, and recA were used as targets in MLST (multilocus sequence typing) technology to study the genetic diversity of 132 L. reuteri and evolutionary relationship between strains and host habitats. [Results] All 132 strains of L. reuteri were assigned into 63 STs and 6 clonal complexes. Recombination analysis revealed that individual recombination events occurred during the evolution of L. reuteri. The eBURST and MSTree analysis showed that L. reuteri from different sources experienced distinct evolutionary processes. The 132 L. reuteri isolates were classified into 5 clusters by phylogenetic analysis, according to their correlation with the sources. [Conclusion] L. reuteri from different sources had high host specificity, indicating that L. reuteri may experience different evolutionary processes to adapt the distinct living environments.
Keywords: Lactobacillus reuterimultilocus sequence typing techniqueintestinal tracthost specificity
在动物的肠道中存在着大量且多样的细菌[1-2]，这些细菌在营养物质的利用、对病原菌的抵抗和免疫系统的成熟方面发挥着重要的作用[3-4]，因此肠道菌群对宿主的健康有着巨大的贡献，但不同宿主肠道中微生物间的遗传多样差异性鲜有报道。
多位点序列分型技术(multi-locus sequence typing，MLST)是根据细菌基因组中几个基因的多态性来区分不同菌株的分子生物学技术[5-7]，因其具有操作简单、分辨率高、重复性好且可以满足在不同实验室完成菌株遗传多样性分析的优点，而成为目前研究细菌群落结构分析最为成熟和稳定的方法之一。Maidden等[8]于1998年首次构建了用于研究脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的MLST方案；de Las Rivas等[9]于2004年首次利用MLST技术选取不同酒类的18株酒球菌(Oenococcus oeni)的5个看家基因进行了研究，结果表明Oenococcus oeni遗传多样性增加的主要因素是重组，随后MLST被广泛应用于乳酸菌的遗传多样性分析。
益生菌一词最早来源于古希腊，是指摄入适当剂量可以通过改善宿主肠道微生态或激发免疫系统活性进而对宿主产生有益作用的微生物[10]，例如普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)的代谢产物丁酸盐是肠道上皮组织的主要营养来源[11]。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)作为益生菌的一种，在中华人民共和国卫生部2003年颁布的第3号公告中被批准可用于保健食品的生产，其几乎天然存在于所有的动物肠道中[12-13]，可以调节肠道微生态，拮抗有害菌的定殖，并且可以产生一种广谱的非蛋白类抗菌物质——“罗伊氏菌素(reuterin)”，可以抑制真菌、酵母、病原虫、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长[14]，同时也是人类肠道中与生俱来的菌种[15]，故常被用于研究动物与其肠道菌群进化关系的模式菌种。本研究应用7个看家基因(ddl、pkt、leuS、gyrB、dltA、rpoA、recA)构建MLST方案分析了人类、家禽(鸡和火鸡)、啮齿类(大鼠和小鼠)、反刍类(牛和羊)、马和猪肠道中L. reuteri的种群结构，以揭示该菌种在宿主肠道中的进化过程。
1 材料和方法 1.1 菌株选取 自内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库(Lactic Acid Bacteria Collection Center，IMAU)中选取16株(试验菌株)分离自动物肠道的L. reuteri，结合下载自NCBI的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) Phaik等[16]构建的116株(下载菌株)L. reuteri的7个看家基因的全部序列，构建132株L. reuteri的MLST方案，详细菌株信息见表 1。
表 1. L. reuteri分离株MLST分析的看家基因及引物信息 Table 1. Housekeeping genes and primer information for MLST of L. reuteri
| Locus | DNA coordinates on DSM20016 genome sequence | Fragment size/bp | Positive/negative chain (+/–) | Primer sequence (5′→3′) | Primer length/bp | Annealing temperature/℃ |
| ddl | 530489–531119 | 633 | + | ATTTCTTCTTCCCTGTTATCC | 21 | 57 |
| TTCGTTCAAATTCTTGTAATCC | 22 | |||||
| pkt | 1747597–1747032 | 567 | – | CACGAAGAAATGGCTAAGAC | 20 | 55 |
| GTTGCGAAGAATCCGTGAC | 19 | |||||
| leuS | 1342592–1342042 | 554 | – | TACGACGCGGGCAGATAC | 18 | 50 |
| ATAGAGATCAACTGGTGACC | 20 | |||||
| gyrB | 5423–5946 | 526 | + | AGAATTCCATTATGAAGGTGG | 21 | 56 |
| TTTCAACATTCAAGATCTTTCC | 22 | |||||
| dltA | 289730–289199 | 534 | – | TTGTCGATCATCAACAGCTTG | 21 | 56 |
| CAGTTCGGTAAGCAGGCAC | 19 | |||||
| rpoA | 1517154–1516656 | 499 | – | CGGTTATGGAACCACTCTC | 19 | 51 |
| AGCHGTTTCTGTTAAATCAAC | 21 | |||||
| recA | 583686–584211 | 528 | + | TGAAAGTTCTGGTAAGACTAC | 21 | 53 |
| CTTTTTAGCATTTTCACGACC | 21 |
表选项
1.2 试验菌株所用材料和方法
1.2.1 菌株的活化与培养: 将保存于安瓿管中16株L. reuteri冻干菌粉取适量接种于5 mL MRS液体培养基，在37 ℃下恒温培养24 h，取适量菌液接种到新的MRS培养基中，如此重复2次，达到富集菌体的目的。
1.2.2 菌株DNA提取: 使用TIANamp? Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒提取16株L. reuteri的总DNA。
1.2.3 看家基因引物设计: 本研究参考Phaik等[16]构建的MLST方案选取ddl (D-alanine-D-alanine ligase，D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶)、pkt (phosphoketolase，磷酸酮酶)、leuS (leucyl-tRNA synthetase，亮氨酰-tRNA合成酶)、gyrB (DNA gyrase B subunit，DNA促旋酶B亚基)、dltA (D-alanineD-alanyl carrier protein ligase，D-丙氨酸D-丙氨酰载体蛋白连接酶)、rpoA (RNA polymerase alpha subunit，RNA聚合酶α亚基)和recA (recombinase，重组酶)共7个单拷贝看家基因作为MLST分型研究的候选基因，其在L. reuteri DSM20016 (NC_009513.1)基因组序列上的位置以及相应引物信息如表 1，引物由上海美吉生物医药科技有限公司合成。
1.2.4 看家基因PCR扩增和测序: 将16株L. reuteri提取的基因组DNA稀释至100 ng/μL作为PCR扩增模板。PCR扩增条件为：95 ℃预变性；95 ℃变性1 min，退火45 s (退火温度见表 1)，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃末端延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并将扩增成功的产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。
1.3 数据分析 16株试验菌株7个看家基因PCR扩增产物经纯化、测序获得其相对应的核苷酸序列。通过START v2.0软件计算132株L. reuteri看家基因的非同义与同义置换速率比值(dN/dS)、G+C%含量、等位基因数量(alleles numbers)和两两序列间位点的差异平均数(π，average pairwise nucleotide differences/site)。将序列导入BioNumerics v6.6软件识别相应菌株的看家基因的等位基因号，确定132株L. reuteri的ST型，并基于Prim’s算法构建最小生成树(minimum spanning tree，MSTree)，获得各ST型与分离源间的关系。应用eBURST v3.0软件基于BRUST算法对L. reuteri分离株依不同基因型进行分组和聚类，进而解析菌株之间的进化关系。利用Linkage Analysis v3.7 (http://guanine.evolbio.mpg.de/cgi-bin/lian/lian.cgi.pl/quer)计算等位基因标准相关系数IAS(standardized index of association)进行连锁平衡分析，并采用SplitsTree v4.0软件评价重组事件对系统发育的影响，构建重组分解分析图(split decomposition analysis)，并用该软件附带的phi-test检测等位基因内是否存在显著的重组现象。采用MEGA v6.0软件Clustal W算法进行看家基因序列进行了比对，使用最大似然(maximum likelihood)算法构建了系统发育树，自展重复抽样次数1000次，对132株L. reuteri种群结构进行系统研究。
2 结果和讨论 2.1 MLST分型研究 利用START v2.0共对132株L. reuteri的7个看家基因(ddl、pkt、leuS、gyrB、dltA、rpoA、recA)序列进行了分析，结果如表 2。7个看家基因的扩增片段长度为499 bp (rpoA)–633 bp (ddl)，串联序列总长度为3841 bp。7个看家基因等位基因个数为17–41，leuS的等位基因数量最多，为41个，其次为dltA和pkt，分别为34和29个，rpoA的等位基因数量最少，为17个。7个看家基因的G+C%含量为38.67%–44.04%，与模式菌株L. reuteri DSM20016有着相似G+C%含量，表明这7个基因在L. reuteri的长期进化过程中保持了较高的保守性，能真实地反映菌株间的进化关系。dN/dS为非同义替换与同义替换的比值，常用来判断进化过程中基因是否受到选择压力的作用[17]，若dN/dS > 1表明基因在进化过程中存在正向选择压力；若dN/dS < 1则表明受到净化选择压力，研究中7个看家基因的dN/dS的值为0.0099(ddl)–0.8923(leuS)，均小于1，表明在长期的进化过程中所选看家基因受到更多进化选择的作用。π值表示两两序列间位点差异的平均数，在0和1之间变化，值越大表示变异程度越高[18]，研究选取的7个看家基因的π值为0.00687(rpoA)–0.09806(leuS)，表明等位基因位点的低突变率。综上所示，本研究选取的7个看家基因符合看家基因在进化过程中较为保守的特点，可以用于构建MLST方案，能够准确反映出菌株之间的进化关系。
表 2. MLST等位基因序列信息及多样性 Table 2. Allele sequence information and diversity of MLST
| Locus | No. of alleles | (G+C) Content/%) | dN/dS | π | phi-test |
| ddl | 28 | 38.67 | 0.0099 | 0.02758 | 0.001447 |
| dltA | 34 | 39.99 | 0.0210 | 0.04783 | 2.17×10–15 |
| gyrB | 26 | 41.97 | 0.0064 | 0.03674 | 1.23×10–9 |
| leuS | 41 | 41.52 | 0.8923 | 0.09806 | 0.08296 |
| pkt | 29 | 44.04 | 0.1591 | 0.03258 | 0.38800 |
| recA | 23 | 39.06 | 0.0026 | 0.01854 | 0.10630 |
| rpoA | 17 | 39.42 | 0.0349 | 0.00687 | 0.98730 |
表选项
使用BioNumerics v6.6软件划分132株L. reuteri的序列型。132株L. reuteri共划分为63个STs型，表明L. reuteri具有较高的遗传多样性，其中菌株数最多的ST型为ST-1 (14株菌)，分别来自啮齿类、人类和家禽，占总菌株数10.6%，其次含有菌株数最多的ST型为ST-4 (13株菌)，其余ST型包含的菌株为2–9，另外尚有42个STs型只包含1株菌，占菌株总数的31.82%。我们发现分离自不同样品的L. reuteri的STs大部分是不同的，其中以啮齿类的多样性最高，共形成26个STs型，每个ST型分别包含1–3株菌；分离自人类的菌株共包含10个STs型，其中分离自人类分离株主要来自ST-1 (11株菌，39.29%)和ST-5 (8株菌，28.57%)；分离自家禽和猪的菌株各包含15和16个STs型，ST-7是家禽分离株的主要序列型，共包含4株菌(15.38%)，ST-4是猪分离株的主要序列型，共包含10株菌(25.00%)；分离自反刍动物和马的菌株共包含3个STs型，其中ST-45是反刍动物分离株的主要序列型(7株，77.78%)。上述结果显示，不同分离源的菌株有着不同的序列型，但同一分离源的菌株的基因亦存在多样性，表明这些L. reuteri分离株在不同的生存环境下经历了特定的进化历程，即菌株在不同的生存环境下为了适应环境而导致的基因组多样性增加。
2.2 等位基因序列重组分析 使用LIAN-linkage v3.7软件分析了7个看家基因的重组情况[19]，若等位基因间存在克隆结构，则IAS显著不同于0；若等位基因间存在自由重组，则IAS越接近于0，结果显示7个看家基因的IAS值为0.025 (P < 0.01)，表明等位基因间存在明显的克隆结构，即连锁不平衡，而不是表现为等位基因间的自由组合。
为了进一步探究重组对L. reuteri种群结构的影响，使用SplitTree v4.0软件进行了Split decomposition分析[20]，结果如图 1-A所示，ddl呈现出了清晰的树枝状结构，其余6个看家基因(pkt、leuS、gyrB、dltA、rpoA、recA)亦呈现出很少的平行四边形结构，表明这些基因在进化过程中没有或仅经历了很少的基因间重组。phi-test分析[21]7个看家基因的串联序列，未发现显著的重组现象(P=0.0596)，7个看家基因phi-test分析的P值为2.17×10–15–0.9873 (表 2)，其中ddl、dltA、gyrB基因存在显著的重组现象，其余4个看家基因均未发现基因间的重组。紧接着，使用SplitTree v4.0软件继续对7个看家基因的串联序列进行了分析，如图 1-B所示，63个STs型呈现出5个遗传谱系，并且表现出一定的网状结构。综上，表明L. reuteri分离株在进化过程中仅发生了个别的重组事件。
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| 图 1 L. reuteri等位基因重组分裂分解图(A) L. reuteri串联序列重组分裂分解图(B) Figure 1 split decomposition analysis of L. reuteri based on allele (A) split decomposition analysis of L. reuteri concatenate sequences (B). |
| 图选项 |
2.3 eBURST结果分析 eBURST分析是根据MLST分析得到的序列型将分离株划分为相应的克隆谱系来研究其进化关系的一种生物信息学方法[22]。本研究将至少包含2个STs型定义为一个克隆复合体(clonal complex，CC)。由图 2可知，132株L. reuteri的63个ST型共分为6个CCs和41个独特型(singleton)，其中6个CCs包含60株菌，占总菌株数的45.45%。CC1共包含6个ST型24株菌，占所有菌株的18.18%，为优势克隆复合体，ST-45包含有4个SLV (只存在1个等位基因型不同的ST型)，且位于CC1的中心位置，所以认为ST-45 (分离自反刍动物)为首要奠基者(primary founder)，CC1中的其他ST型是以ST-45为中心衍生出来，因此CC1中分离自人类(10株)、马(3株)和猪(1株)的菌株可能是由ST-45进化而来。CC2由6个ST型构成，共包含22株分离株，其中分离自猪的菌株占86.36% (19株)，ST-4位于其中心位置，是CC2的首要奠基者。CC3包含4个ST型，全部菌株均来自于猪，其中ST-19为其首要奠基者，推定其余菌株均由cp395菌株进化而来。CC4、CC5、CC6均包含2个ST型，其中CC5和CC6的菌株均分离自家禽，CC4的菌株则分离自啮齿类。
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| 图 2 63个STs型eBURST分析 Figure 2 eBURST analysis of 63STs type. |
| 图选项 |
2.4 不同序列最小生成树分析 为了进一步分析L. reuteri分离株的种群结构，使用BioNumerics v6.6软件Prim’s算法构建最小生成树(minimum spanning tree，MSTree)。以L. reuteri的不同分离源表示每个ST型节点的颜色，圆圈的大小表示该ST型包含菌株数量，圆圈之间连线的虚实度代表亲缘关系的远近。如图 3所示，63个ST型共形成3个分枝，分枝A包含来自CC2和20个STs型的46株菌，菌株主要分离自猪(23株)和啮齿类(17株)；分枝B的11株菌来自克隆复合体CC4和5个STs型，菌株全部分离自啮齿类。分枝C包含CC1、CC3和CC5三个克隆复合体和16个STs型的75株菌，菌株分离自人类(26株)、家禽(25株)、反刍类(10株)和猪(7株)。猪分离株集中在分枝A，啮齿类的分离株集中于分枝A和B，分离自人类、家禽和反刍类的菌株主要来自于分枝C。eBURST和MSTree两种进化分析方法表明不同分离源的L. reuteri分离株经历了不同的进化过程，生存环境的差异在L. reuteri进化过程中扮演着重要的角色，大多数相同分离源的ST型亲缘关系较近，有较强的宿主特异性，同时也出现个别菌株因为在宿主肠道内分化的时间不足而出现混入其他宿主亚群的情况。
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| 图 3 132株L. reuteri分离源最小生成树分析 Figure 3 Analysis of the minimum spanning tree of 132 L. reuteri separation sources. |
| 图选项 |
2.5 L. reuteri种群结构分析 为了更清晰阐明不同菌株间的进化关系，我们采用Mega v6.0软件的Clustal W算法对132株L. reuteri分离株的看家基因串联序列进行了比对，紧接着使用最大似然(maximum likelihood)算法构建了系统发育树，自展重复抽样次数1000次。结果如图 4所示，132株菌属于5个不同的类群。ClusterA共包含两个亚群35株菌，AI除菌株lr85573 (人类)、ks6 (家禽)和atcc55739 (啮齿类)外全部分离自猪，AII共包含10株菌，全部菌株分离自啮齿类；ClusterB共包含2个亚群35株菌，BI的分离株主要来自反刍类和啮齿类，BII则主要由马、人类和反刍类的分离株构成；ClusterC仅包含2株菌，分别来自啮齿类和人类；ClusterD包含2个亚群23株菌，DI的菌株全部来自啮齿类，猪和家禽的分离株则构成了DII；ClusterE包含2个亚群37株菌，EI主要分离自人类，EII则主要分离自家禽。综上，人类分离株主要由ClusterBII和ClusterEI构成，啮齿类分离株主要分布在ClusterAII和ClusterDI中，家禽分离株则几乎全部来自ClusterEII，猪分离株则主要来自ClusterAI，反刍动物类和马分离株主要分布于ClusterBII中。马和反刍动物、人类和家禽的分离株出现于相同的Cluster中，表明马和反刍动物、人类和家禽有相似的肠道压力，在MSTree分析中亦有相似的结果，分离自人类、啮齿类的菌株被包含在了2个Cluster中，但其形成了更小的亚类群，而不是分散在Cluster中。
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| 图 4 132株L. reuteri分离株系统发育分析 Figure 4 Phylogenetic analysis of 132 L. reuteri isolates. |
| 图选项 |
MLST技术是目前研究细菌群落结构分析最为成熟和稳定的方法，Hui等[23]采用分离自植物、人类肠道和血液以及不同产地干酪的40株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) 6个看家基因(ftsZ、metRS、mutL、nrdD、pgm、polA)序列构建MLST方案，结果表明，试验菌株依据不同的分离源，划分为干酪群、青贮饲料群和混合群。本研究利用132株罗伊氏乳杆菌的7个看家基因序列构建MLST方案，首次将反刍动物(牛、羊)和马肠道中的分离株纳入研究范围，提高了对于罗伊氏乳杆菌基因组多样性的认识。132株菌共划分为63个STs和5个遗传谱系，发现大多数相同分离源的菌株有较近的亲缘关系，表明不同的生存环境对L. reuteri的进化发挥着重要的作用。
微生物和肠道宿主的共生关系与宿主的分类学地位和生存环境有着紧密的联系[24]，也就是说肠道微生物具有宿主特异性，例如，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)是一种微需氧、呈螺旋结构的革兰氏阴性菌，研究发现由于幽门螺旋杆菌对胃部的感染在人类中普遍存在，因而其可以被用于追踪人类的迁徙[25]；此外，鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)引起的一种烈性传染病，研究发现鼠疫的前两次大流行与郑和下西洋及丝绸之路有着紧密的联系[26]。本研究中7个看家基因的dN/dS值均小于1，表明在进化选择作用在所选基因中发挥了主导的作用，该结果与其他利用MLST进行乳酸菌遗传多样性研究结果一致[27–28]，原因可能为看家基因在进化过程中本身较为保守的特点[29]。L. reuteri是动物肠道中天然存在的益生菌[12-13]，其代谢产生的罗伊氏菌素是一种广谱的非蛋白类抗菌物质，可以抑制真菌、酵母、病原虫、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长[14]，提高宿主对环境的适应能力，进而使得L. reuteri能够长期定植在动物肠道内，但不同动物的肠道环境不同，对L. reuteri的进化发挥重要的作用。Bin等[30]通过细菌突变筛选，发现大肠杆菌产生的肠杆菌素(Ent)能提升宿主线虫体内的铁离子含量并促进其生长，这种利用共生菌代谢产物增加自身铁摄入对维持宿主体内铁稳态和共生都有重要意义。种群结构分析方面，MSTree分离源关联分析则发现63个ST型共形成3个分枝，猪肠道分离株集中于分枝A，啮齿类分离株集中于分枝A和B，分离自人类、家禽和反刍类的菌株主要来自于分枝C，表明L. reuteri分离株形成的分枝与分离源存在较强的相关关系，Sun等[31]利用MSTree分析发现瑞士乳杆菌遗传多样性的形成与所分离不同乳制品相关。进一步利用系统发育分析发现132株罗伊氏乳杆菌共分为5个不同的类群，猪肠道分离株集中于ClusterAI，与CC2和CC3有相似的菌株构成，ClusterBII主要由人类、反刍动物类和马肠道分离株构成，与CC1有相似的菌株构成，家禽分离株则几乎全部来自ClusterEII，包含CC5和CC6中的菌株，啮齿类肠道分离株主要分布在ClusterAII和ClusterDI。大多数相同分离源的菌株在进化树存在较近的亲缘关系，Yu等[32]对37株L. reuteri进行基因组重测序，系统发育分析发现源于不同宿主的L. reuteri进化历程各异，表明L. reuteri的遗传多样性与生存环境存在紧密的关联，然而，由于本研究仅包含3株马肠道分离株，对其与宿主关系解析尚不够充分。另外，在系统发育树中亦出现了不同分离源菌株相互混杂的情况，ClusterA主要包含猪和啮齿类的肠道分离株，ClusterE主要包含人类和家禽肠道的分离株，这表明目前的进化时间不足以形成真正的宿主特异性类群[33]；在某些宿主形成的特异性亚群中也混杂了其他宿主的分离株，例如，人类肠道分离株mf14c和mf23混杂在了家禽肠道分离株形成的亚群ClusterEII中，表明菌株通过宿主的饮食发生了菌株间基因重组，导致近期的宿主选择事件[34]，Split decomposition分析发现L. reuteri分离株的进化过程中发生了重组事件，但phi-test未检测到显著的重组现象(P=0.0596)，推断低频重组并未成为L. reuteri进化的主要驱动力，同时Savage等[35]的研究认为通过这种重组形成的菌株只能短暂地存在于新宿主的肠道中，而不能在宿主肠道中长期进化。
3 结论 L. reuteri是动物肠道中天然存在的益生菌，本研究利用7个与核心代谢相关的看家基因构建的MLST方案，对来自不同动物肠道的132株L. reuteri肠道分离株的遗传多样性分析，发现不同分离源菌株有着高度的宿主特异性，表明L. reuteri为适应不同生存环境经历了不同的进化过程，揭示了不同宿主L. reuteri肠道分离株的遗传背景，为L. reuteri的开发利用提供理论依据。
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