李利宏, 张荣珍
, 周丽仙, 柳志永, 旋凯昂, 饶俊超, 徐岩 江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室, 江苏 无锡 214122
收稿日期：2018-12-05；修回日期：2019-03-15；网络出版日期：2019-04-04
基金项目：国家自然科学基金（31370100）；江苏省六大人才高峰高层次人才资助项目（2015-SWYY-010）；高等学校学科创新引智计划资助（111-2-06）
*通信作者：张荣珍, Tel:+86-510-85197760, Fax:+86-510-85918201, E-mail:rzzhang@jiangnan.edu.cn.
摘要：[目的] 从Pseudomonas putida KT2440基因组中，钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因（ltaE），构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质，和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。[方法] 以P.putida KT2440基因组DNA为模板，PCR扩增出ltaE基因，构建重组表达质粒pET28a-KT2440并转化Escherichia coli BL21（DE3），获得重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-KT2440，利用Ni2+柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶（LTA），对关键氨基酸位点Thr206和Lys207实施定点突变。[结果] SDS-PAGE结果表明LTA在大肠杆菌中获得高效表达，分子量为40 kDa左右，与理论值大小相符。Ni2+柱亲和层析纯化LTA，获得单一条带。利用双酶耦联法测得LTA酶活为5577.3 U/mg，最适反应温度为50℃，最适pH为8.0。在温度低于45℃，pH 5.0-9.0时，重组酶较稳定。LTA酶的Km和kcat值为23.95 mmol/L和19216.6 s-1。Mg2+、Ca2+金属离子对LTA有明显的促进作用，而Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等对酶有明显的抑制作用。该酶在叔丁基甲基醚溶剂中具有良好的耐受性，在叔丁基甲基醚中保存1 h后仍保留90%以上的酶活。Thr206Ser突变明显提高了酶对温度的稳定性。Lys207对酶催化功能是必需的，该位点突变对酶活都是致死的。[结论] 克隆并表达P.putida KT2440的LTA酶，研究了酶学性质，通过定点改造提高了酶的温度稳定性，筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂，为LTA酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础。
关键词：恶臭假单胞菌低特异性L-苏氨酸醛缩酶酶学性质致死突变温度稳定性
Expression, characterization and thermostability improvement of low-specificity L-threonine aldolase from Pseudomonas putida KT2440
Lihong Li, Rongzhen Zhang
, Lixian Zhou, Zhiyong Liu, Kaiang Xuan, Junchao Rao, Yan Xu Key Laboratory of Industrial Biological, Ministry of Education, School of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
Received: 5 December 2018; Revised: 15 March 2019; Published online: 4 April 2019
*Corresponding author: Rongzhen Zhang, Tel:+86-510-85197760, Fax:+86-510-85918201, E-mail:rzzhang@jiangnan.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31370100), by the Program for Advanced Talents Within Six Industries of Jiangsu Province (2015-SWYY-010) and by the Program of Introducing Talents of Discipline to Universities (111-2-06)
Abstract: [Objective] To construct a recombinant Escherichia coli BL21 (DE3)/pET-KT2440, a low-specificity L-threonine aldolase gene (ltaE) was cloned from the genome of Pseudomonas putida KT2440. The enzyme characterization and the effects of key amino acid mutations on the enzyme activity and thermo-stability were investigated. [Methods] The ltaE gene was amplified by PCR with the genome of P. putida KT2440 as template. The recombinant plasmid pET28a-KT2440 was constructed and transformed into E. coli BL21 (DE3). The low-specificity L-threonine aldolase (LTA) was purified by Ni2+ affinity chromatography and then was characterized. The key amino acids Thr206 and lys207 were mutated by site-directed mutagenesis. [Results] SDS-PAGE analysis showed that LTA were highly expressed in E. coli BL21 (DE3) with a molecular weight of about 40 kDa, consistent with the theoretical value. A single band was observed through Ni2+ affinity chromatography. LTA had a specific activity of 5577 U/mg by two coupled-enzyme assay method. The optimal temperature and pH were 50℃ and 8.0, respectively, and was stable below 40℃ and pH between 5.0 and 9.0. LTA exhibited Km and kcat values of 23.95 mmol/L and 19216.6 s-1 under the optimal conditions. Mg2+ and Ca2+ obviously stimulated enzyme activity, whereas Ni2+, Cu2+, Zn2+ and Fe2+ obviously inhibited it. LTA enzyme presented good resistance in tert-butyl methyl ether. The residual activity was retained over 90% after pre-incubation of the enzyme in TBME for 1 h. Site-directed mutation indicated that Thr206Ser significantly increased the thermal stability. Lys207 is essential for enzymatic function. Any mutation of K207 was lethal for enzyme activity. [Conclusion] The thermostability was improved by site-directed mutation. The work provides a solid foundation for the efficient and stable biosynthesis of β-hydroxy-α-amino acids by LTA.
Keywords: Pseudomonas putidalow-specificity L-threonine aldolasecharacterizationlethal mutationthermal stability
苏氨酸醛缩酶(TA)(EC 4.1.2.5)能够以磷酸吡哆醛(PLP)为辅因子，催化甘氨酸与各种芳香族和脂肪族醛发生醛醇缩合反应，产生含有两个手性立体中心的β-羟基-α-氨基酸[1-3]。β-羟基-α-氨基酸是许多药物的有效成分的重要前体，广泛应用于制药及精细化工行业，具有非常高的应用价值[4-6]，如4-羟基-L-苏氨酸是依赖PLP酶抑制剂Rizobitoxine的前体而且参与维生素B6的合成[7]，L-苏-3，4-二羟基苯基丝氨酸是治疗帕金森病的重要药物[8-9]。
苏氨酸醛缩酶广泛存在于植物、脊椎动物、几种细菌和真菌[10]。基于其对苏氨酸的α-碳原子的裂解反应的立体特异性，可以分为两类：LTA和DTA[11]。LTA作用于L-苏氨酸或L-别-苏氨酸。基于其对苏氨酸的β-碳原子的立体特异性进一步分为3组：(a) L-allo-TA特异于L-别-苏氨酸；(b) L-TA仅作用于L-苏氨酸；(c)低特异性LTA既可以作用于L-苏氨酸又可以作用于L-别-异苏氨酸[12-13]。这3种L-苏氨酸醛缩酶具有高度相似的一级结构，但在立体专一性上却存在明显的差异[7]。
LTA能够以甘氨酸和醛类为底物一步酶法合成β-羟基-α-氨基酸[14]，因而备受关注，研究者试图拓展该酶在合成中的应用，促进化学与酶工程的结合[15]。Liu等克隆了Escherichia coli GS245中的低特异性LTA基因，并对酶的生化特征和生理作用进行了研究[16]。鉴于低特异性LTA在合成β-羟基-α-氨基酸上的重要性，本研究从P. putida KT2440基因组中钓取了低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(ltaE)，于E. coli BL21 (DE3)菌株中高效表达，通过分子改造发现Thr206Ser突变明显提高了酶对温度的稳定性，Lys207是酶活性的重要氨基酸。并成功筛选到一种酶耐受性较好的有机溶剂，为低特异性苏氨酸醛缩酶酶的分子改造提供了典范，特别是为后续的有机相催化合成手性氨基酸衍生物奠定了较坚实的研究基础。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒: 表 1为本研究中使用的菌株和质粒。
表 1. 菌株和质粒 Table 1. Strains and plasmids
| Strains and plasmids | Application | Source |
| Strains | ||
| ??E. coli JM109 | Host for cloning target gene | This lab |
| ??E. coli BL21 (DE3) | Host for target gene expression | This lab |
| ??E. coli BL21 (DE3)/pET-KT2440 | E. coli BL21 (DE3) harboring pET-KT2440 | This study |
| ??E. coli BL21 (DE3)/pET-K207A | E. coli BL21 (DE3) harboring pET-K207A | This study |
| ??E. coli BL21 (DE3)/pET-K207R | E. coli BL21 (DE3) harboring pET-K207R | This study |
| ??E. coli BL21 (DE3)/pET-K207S | E. coli BL21 (DE3) harboring pET-K207S | This study |
| ??E. coli BL21 (DE3)/pET-K207T | E. coli BL21 (DE3) harboring pET-K207T | This study |
| ??E. coli BL21 (DE3)/pET-T206S | E. coli BL21 (DE3) harboring pET-T206S | This study |
| Plasmids | ||
| ??pMD19-T | The plasmid for target gene cloning | This lab |
| ??pET-28a | The plasmid for target gene expression | This lab |
| ??pET-KT2440 | pET-28a containing KT2440 | This study |
| ??pET-K207A | pET-28a containing K207A | This study |
| ??pET-K207R | pET-28a containing K207R | This study |
| ??pET-K207S | pET-28a containing K207S | This study |
| ??pET-K207T | pET-28a containing K207T | This study |
| ??pET-T206S | pET-28a containing T206S | This study |
表选项
1.1.2 主要试剂和仪器: Primerstar、T4 DNA Ligase、限制性核酸内切酶、IPTG均购于TaKaRa生物有限公司。质粒提取试剂盒和DNA回收试剂盒购于OMEGA BIO-TEK。DNA Marker购于天根生化科技有限公司。引物由无锡天霖生物科技有限公司合成。乙醇脱氢酶购于Sigma-Aldrich公司，辅酶NADH购于上海索来宝公司，其余试剂均为国产分析纯。酶标仪购于美国Thermo公司；超声破碎仪VCX750购于美国Sonic公司；AKTA蛋白纯化仪和镍离子亲和层析柱购于美国GE公司。
1.2 重组菌E. coli BL21 (DE3)/pET-His-KT2440的构建 采用PCR的方法，利用表 2中的引物KT2440_F和KT2440_R，以P. putida KT2440基因组为模板，扩增出ltaE基因。将其连接到表达载体pET-28a上，并转化到E. coli BL21 (DE3)的感受态中，经过酶切和DNA测序验证，获得重组菌E.coli BL21 (DE3)/pET-His-KT2440。
表 2. 构建表达体系所需的引物 Table 2. Primers used in construction of expression system
| Primers | Sequence (5′→3′) |
| KT2440_F | ATCGGATCCATGACAGACAAGAGCCAACAATTCGC (BamH I) |
| KT2440_R | ACTCTCGAGTCAGCCACCA ATGATCGTGCGG (Xho I) |
| The restriction endonuclease sites are underlined. | |
表选项
1.3 菌体的培养及蛋白表达 将重组菌E. coli BL21 (DE3)/pET-His-KT2440接种到含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 ℃、200 r/min振荡培养8 h后，转接到1 L相同培养基中，培养至OD600为0.6-0.8，向培养基中加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，于25 ℃诱导培养14 h后，收集菌体。菌体超声破碎离心后的上清液用于SDS-PAGE分析，检测目标蛋白LTA的表达。
1.4 蛋白纯化 称取10 g湿菌体E. coli BL21/pET-KT2440，重悬于0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)中，于冰浴中超声破碎细胞(工作2 s，间隔3 s，工作时间20 min)，4 ℃条件下，12000×g离心30 min，收集上清液作为粗酶液。利用镍离子亲和层析柱纯化，对低特异性LTA进行纯化[17]。纯酶液超滤脱盐后用于酶活力测定。
1.5 酶活力的测定 采用NADH偶联测定法：用酵母乙醇脱氢酶(ADH)测量苏氨酸醛缩酶活性[18]。苏氨酸醛缩酶裂解苏氨酸产生甘氨酸和乙醛，通过酵母乙醇脱氢酶的作用，释放的乙醛被还原成乙醇，同时将NADH氧化成NAD+，引起340 nm处吸光值的变化。LTA酶活测定：总反应体积250 μL，分别加入终浓度为0.1 mol/L的HEPES-NaOH (pH 8.0)、0.5 mmol/L的NADH、50 mmol/L的L-苏氨酸、50 μmol/L的PLP和ADH (0.1 mg)，30 ℃保温3 min，加入适量纯酶液后开始扫描340 nm处吸光值的变化。以牛血清白蛋白BSA为标准品。酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1 μmoL的NAD+的酶量定义为一个酶活单位。酶活力和比活分别按照公式(1)和公式(2)计算。
 | 公式(1) |
 | 公式(2) |
1.6 酶的最适反应温度及温度稳定性 将除酶之外测定酶活的其他物质置于20-60 ℃ (间隔5 ℃)下保温3 min，即刻加入纯酶，1.5条件下测定酶活，以确定酶的最适反应温度。取等量酶液分别置于20-60 ℃ (温度梯度5 ℃)条件下放置1 h，1.5条件下测定其残余酶活力，相同含量的酶液放置在4 ℃条件下1 h作为空白对照，以此测定酶热稳定性。
1.7 酶的最适反应pH及pH稳定性 配置不同pH值(pH 4.0-9.0，间隔1.0)的缓冲液、底物L-苏氨酸、辅酶NADH溶液、辅因子PLP溶液，按照1.5中方法测定LTA在各个pH条件下的酶活力，以确定酶的最适反应pH。所需的不同pH缓冲液如下：0.1 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0-5.0)；0.1 mol/L的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液(pH 5.0-7.0)；0.1 mol/L的HEPES-NaOH缓冲液(pH 7.0-9.0)。取等量酶分别置于以上各pH值缓冲液中，4 ℃冰箱静置24 h，按1.5条件测定残余酶活力，以得到酶对不同pH的耐受性。
1.8 LTA动力学参数的测定 用0.1 mol/L的HEPES-NaOH缓冲液(pH 8.0)配置不同浓度的L-苏氨酸(0.1-100 mol/L)，将底物和辅酶在50 ℃金属浴保温2 min。根据1.5中酶活测定的反应体系，测定在不同L-苏氨酸浓度下的最初反应速率，然后利用非线性模拟法计算出酶对L-苏氨酸的Km值、kcat值及kcat/Km值。
1.9 LTA对有机溶剂的耐受性 取电泳纯的LTA溶液按1:1的体积比分别加入一系列有机溶剂(无水乙醇、叔丁基甲基醚、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙腈)，在30 ℃、100 r/min摇床中振荡1 h，按照1.5条件测定残余酶活力，以考察酶对各种有机溶剂的耐受能力。在最适条件下检测酶活，以添加等量0.1 mol/L的HEPES-NaOH缓冲液(pH 8.0)的酶活为100%计算酶活的变化。
1.10 二价金属离子对LTA的影响 按照1.5酶活测定体系，以0.1 mol/L的HEPES-NaOH缓冲液配置不同金属离子母液，按需添加至稀释后的酶液中，考察了1 mmol/L金属离子(Ca2+、Co2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+)对LTA酶活的影响。在最适条件下检测酶活以未添加金属离子的酶活为100%计算酶活的变化。
1.11 LTA关键氨基酸位点的突变 采用全质粒PCR来引入突变的方法，利用表 3中的引物K207A_F和K207A_R、K207R_F和K207R_R、K207S_F和K207S_R、K207T_F和K207T_R、T206S_F和T206S_R，以重组质粒为模板通过高保真酶Primerstar扩增质粒全长，Dpn I酶消化PCR产物去除模板后转化E.coli BL21 (DE3)感受态，挑选重组子测序确定正确的突变菌株。突变菌株在1.3条件下诱导表达，在1.5条件下测定酶活性。
表 3. 构建突变酶基因的引物 Table 3. Primers used in construction of mutants
| Primers | Sequence (5′→3′) |
| K207A_F | ATGTGCTGTGCTTTGGCGGCACCGCGAAC |
| K207A_R | GCTTCGCCCACCGCCATGCCGTTCGCGGT |
| K207R_F | GTGCTTTGGCGGCACCAGGAAC |
| K207R_R | ACCGCCATGCCGTTCCTTGGTG |
| K207S_F | ATGTGCTGTGCTTTGGCGGCACCTCGAAC |
| K207S_R | GCTTCGCCCACCGCCATGCCGTTCGAGGT |
| K207T_F | ATGTGCTGTGCTTTGGCGGCACCACGAAC |
| K207T_R | CGCCCACCGCCATGCCGTTCGTGGT |
| T206S_F | ATGTGCTGTGCTTTGGCGGCTCCAAG |
| T206S_R | CGCCCACCGC CATGCCGTTC TTGGAGCC |
| The mutant sites are underlined. | |
表选项
1.12 圆二色谱测定突变酶的变性温度 使用10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)将纯化的蛋白稀释至0.1 mg/mL，加入1 mm比色皿中，以1 ℃/min的速度将样品从20 ℃加热至80 ℃，监测波长209 nm下蛋白结构随温度的升高解螺旋情况，确定蛋白质变性温度。变性温度(Tm)的定义为二级结构迅速展开时的最大斜率所对应的温度。
2 结果和分析 2.1 LTA的蛋白表达、纯化及酶活测定 重组质粒pET-KT2440转入E. coli BL21 (DE3)，经酶切和测序验证后，获得重组菌E. coli BL21/ pET-His-KT2440。超声破碎离心后的上清即粗酶液经SDS-PAGE检测，LTA在大肠杆菌中有明显的表达条带，大小为40 kDa左右(图 1中第2泳道)，与LTA理论大小符合，表明LTA蛋白在大肠杆菌中可溶性表达。用Ni2+柱亲和层析的方法对N端带有6×Histine标签的粗酶液进行纯化(图 1中第3泳道)，并进行脱盐处理后，分离纯化后的LTA比酶活为5577.3 U/mg，与同类酶相比较，在酶活性方面具有较强的优势[16]。
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| 图 1 LTA蛋白表达与纯化SDS-PAGE分析 Figure 1 SDS-PAGE analysis of LTA expression and purification. M: Protein molecular weight markers; lane 1: The cell-free extracts of E. coli BL21(DE3)/ pET-KT2440; lane 2: The cell-free extracts of E. coli BL21(DE3)/pET-KT2440 induced with 0.5 mmol/L IPTG; lane 3: The purified LTA. |
| 图选项 |
2.2 LTA的最适反应温度和温度稳定性 LTA酶的最适反应温度结果如图 2-A所示，在50 ℃条件下酶活性最高。LTA在低于45 ℃下温浴1 h后，残余酶活力仍能保持在80%以上；在50 ℃时，温浴1 h后残余酶活力剩余30% (图 2-B)。据报道，来源于Aeromonas Jandaei DK-39的LTA在50 ℃下温浴15 min后残余酶活力剩余15%，来源于Pseudomonas sp. NCIMB10558中LTA在50 ℃下温浴15 min后残余酶活力剩余10%[7]。与同类酶相比较，该LTA酶具有较好的温度稳定性。
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| 图 2 LTA最适温度(A)及温度稳定性(B) Figure 2 Effects of temperature on activity (A) and stability (B) of LTA. The data presented are the average values from triplicate measurements. |
| 图选项 |
2.3 LTA的最适反应pH和pH稳定性 pH的改变能影响酶活性中心上必需基团的解离程度，同时也影响底物和辅因子的解离程度，从而影响酶分子与底物的结合和催化[2]。LTA酶的最适反应pH结果如图 3-A所示，LTA在碱性条件下酶催化活性更高，这是由于碱性条件下，底物提供质子给酶催化中心的能力更强[12]。LTA酶的pH稳定性结果如图 3-B所示，LTA置于pH 4.0-9.0缓冲液中，4 ℃低温下存放24 h后，在pH 5.0和9.0之间较稳定，但在pH 6.0下酶活性明显降低。进行等电点分析后，发现其pI为5.88，在pH 6.0附近，猜测可能由于等电点的原因使得其pH稳定性降低。
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| 图 3 LTA最适pH (A)及pH稳定性(B) Figure 3 Effects of pH on the activity and stability of LTA. The data presented are the average values from triplicate measurements. |
| 图选项 |
2.4 LTA动力学参数的测定 按照1.8中的方法，通过酶标仪测定L-苏氨酸的逆醛醇反应的酶活性。数据用Origin 9.0作图非线性拟合方程(图 4)，结果表明LTA裂解L-苏氨酸的Km值是23.95 mmol/L，kcat值是19216.6 s-1，kcat/Km值是802.36 s-1·mmol/L。
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| 图 4 非线性拟合KT2440的米氏方程 Figure 4 Nonlinear curve fit Michaelis-Menten Equation of KT2440. |
| 图选项 |
2.5 LTA的有机溶剂耐受性 如图 5所示，在不同有机溶剂中保存1 h后，LTA在叔丁基甲基醚(TBME)中保留了90%的酶活性，在无水乙醇(EtOH)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(TF)、乙腈(CH3CN)中剩余不到20%的酶的活性，这表明LTA在叔丁基甲基醚中耐受性较好。LTA酶催化甘氨酸与各种芳香族和脂肪族醛发生醇醛缩合反应，但是底物醛在水溶液中溶解性低，严重影响了酶的催化效率；另外有机溶剂在一定程度上能改良或者提升酶的立体选择性[10]。LTA在TBME中良好的耐受性为后续建立水-有机溶剂两相体系生物催化手性氨基酸衍生物奠定了较好的前期基础。
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| 图 5 有机溶剂对LTA的影响 Figure 5 Effects of organic solvents on the LTA activity. The data presented are the average values from triplicate measurements. |
| 图选项 |
2.6 二价金属离子对LTA的影响 如图 6所示，Mg2+、Ca2+对LTA酶活有明显的促进作用，Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对LTA有明显的抑制作用，而Mn2+对酶活稍有促进作用，Co2+对酶活稍有抑制作用。研究表明来源于Arthrobacter sp. DK-38的D型苏氨酸醛缩酶需加入二价金属离子如Mn2+、Mg2+、Co2+等作为激活剂以体现其最适酶活性[19]，而本研究中的LTA不需要加入任何二价金属离子就能直接显示其酶活。二价金属离子的激活作用可能是其能促进与赖氨酸残基和底物β-羟基-α-氨基酸形成醛亚胺有关[7]，另外，二价金属离子在酶的热稳定性中也可能起重要作用[20]。
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| 图 6 金属离子对LTA的影响 Figure 6 Effects of metal ions on the LTA activity. The data presented are the average values from triplicate measurements. |
| 图选项 |
2.7 Thr206和Lys207定点突变 对不同来源的苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列和二级结构进行比对分析(图 7)，发现Thr206在嗜热性菌存在，很可能与酶的温度稳定性相关，而Lys207位于保守区域，并与催化中心相邻，因而选择这两个位点进行突变。通过全质粒PCR引入突变T206S、K207A、K207R、K207S和K207T，这些突变不影响蛋白在大肠杆菌中的表达。酶活测定结果表明Lys207突变酶对L-苏氨酸裂解活性丧失或者几近失活，酶活仅为野生型的0.3%-4.8% (表 4)，说明Lys207对酶活性有很大的影响。通过对与LTA相似性为43.14%的苯基丝氨酸醛缩酶的晶体结构(PDB ID:1V72)分析表明，Lys207能够与磷酸吡哆醛(PLP)结合形成希夫碱(图 8)，其催化机制为辅因子PLP与赖氨酸的ε-氨基形成内部醛亚胺，在苏氨酸的进攻下，PLP和苏氨酸的α-氨基形成外部醛亚胺，随后裂解产生乙醛和PLP-甘氨酸醌类复合物，甘氨酸的α-碳原子质子化后，释放出甘氨酸，并且PLP与活性位点赖氨酸残基再生内部醛亚胺。赖氨酸突变成其他的氨基酸后导致不能与PLP结合，使得酶的催化效率大大降低甚至没有活性[21]。而T206S对酶活大小几乎没有影响(表 4)。圆二色谱可以用于探究蛋白质的热变性曲线，随着温度的升高，蛋白质内部的α-螺旋会逐渐解螺旋，根据蛋白质的解螺旋速度可以作出变性曲线，从而确定蛋白的变性温度，即Tm值，蛋白变性温度是蛋白质的二级结构解螺旋速率达到最大时所对应的温度，即变性曲线最大斜率处所对应的温度。通过计算曲线的最大斜率，KT2440野生型的变性温度为49.2 ℃，而T206S突变酶的变性温度为53.7 ℃，相比于野生型LTA酶，变性温度提高了4.5 ℃，说明该位点与酶的温度稳定性密切相关(图 9)。
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| 图 7 不同来源的部分LTA氨基酸序列和结构比对 Figure 7 Sequence and structure alignment of LTA from different sources. |
| 图选项 |
表 4. 突变酶的酶活测定 Table 4. Effects of site mutagenesis on activity of LTA
| LTA | Specific activity/(U/mg) | Relative activity/% |
| Wild type | 5577.3 | 100 |
| K207A | 16.2 | 0.3 |
| K207R | 128.3 | 2.3 |
| K207S | 267.7 | 4.8 |
| K207T | 200.8 | 3.6 |
| T206S | 5532.7 | 99.2 |
表选项
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| 图 8 K207是P. putida LTA的催化活性位点 Figure 8 K207 is an active site of P. putida LTA. |
| 图选项 |
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| 图 9 圆二色谱分析KT2440和T206S的变性温度 Figure 9 Circular dichroism analysis of denaturation temperature for KT2440 and T206S. |
| 图选项 |
3 讨论 苏氨酸醛缩酶以甘氨酸作为供体以醛类作为受体催化可逆的醛醇缩合反应。在高价值化学产品的工业生产中具有巨大潜力，它具有接受多种芳香族和脂肪族醛作为受体的能力，因此该酶已经广泛用于合成β-羟基-α-氨基酸[22]。此外，苏氨酸醛缩酶以非磷酸化的化合物作为底物，不同于其他醛缩酶需要制备繁琐的磷酸化的底物，因此在缩短反应路线、避免保护步骤、减少化学废料和实现高效率转化方面有巨大优势，被认为是合成化学中有潜力的催化剂[23]。然而由于该酶对非天然底物的低活性、温度稳定性较差等因素，在手性合成化学中受到了限制。同时由于大多数醛类底物在水相中溶解度较差，因而有必要首先筛选到一种合适的有机溶剂，提高酶在溶剂中的稳定性，从而为实施有机相催化合成反应奠定前期基础。另外，酶还没有进化到对底物有足够高的活性，为了提高苏氨酸醛缩酶在合成化学中的应用，有必要筛选优质的酶，进一步改善酶的性质，特别是提高酶的温度稳定性。
本研究钓取了P. putida KT2440的ltaE基因，于E. coli BL21(DE3)菌株中进行高效表达与纯化。其他多种来源的醛缩酶需要加入二价金属离子如Mn2+、Mg2+、Co2+等作为激活剂以体现其最适酶活性[19]，而本研究中的LTA不需要加入任何二价金属离子就能具有较高的酶活。酶学性质研究表明该酶的最适反应温度为50 ℃，最适pH值为8.0。LTA酶在40-50 ℃、pH 7.0-9.0条件下，同时在叔丁基甲基醚溶剂中能保持相对90%以上的酶活性。K207位点是保持LTA催化活性的关键氨基酸，该位点在不同来源的LTA结构域中极其保守，其位点突变对酶活几乎都是致死的。T206在不同来源的微生物中，差异较大，在不同来源的菌中，该位点多为Ser。因而尝试将该位点突变为Ser，突变酶T206S使得酶的变性温度提高了4.5 ℃，表明T206与温度稳定性密切相关，由于T206是重要氨基酸位点，后续研究中需要进行饱和突变以研究其温度稳定性。本研究为重组LTA稳定催化合成手性氨基酸衍生物提供了理论依据。后续的研究将进一步理性设计定点突变，提高酶的温度稳定性和有机溶剂的耐受性，构建水-有机相两相手性高效催化体系。
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