江丽珍1#, 刘江2#, 向兴3, 刘仁菊2, 王锐诚3, 龚林锋1
1.国家海洋局第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室, 福建 厦门 361005;
2.宁波大学海洋学院, 浙江 宁波 315211;
3.中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室, 湖北 武汉 430074
收稿日期：2017-09-15；修回日期：2018-01-03；网络出版日期：2018-01-16
基金项目：国家海洋局第三海洋研究所基本科研项目（海三科2015018）
*通信作者：龚林锋, Tel:+86-592-2195291;E-mail:gonglinfeng@tio.org.cn
#共同第一作者
摘要：氮依赖型甲烷厌氧氧化菌（nitrite-dependent anaerobic methane oxidation bacteria，n-damo细菌，属于NC10门）是最近10年来微生物生态学领域的研究热点。然而，对该类群基于现有数据的生态分布、群落结构和系统进化的整合分析还未见报道。[目的]为了更好地将近年来针对该类群的研究做一次全面梳理，本文通过整合前人已有发表数据和结合自身实验数据两方面进行。[方法]一方面，利用NCBI数据库（数据搜集到2016年11月）中所有n-damo细菌序列对其进行生物信息学分析；另一方面，对大九湖泥炭地表层泥炭利用16S rRNA二代测序技术对该类群进行检测，并同前人数据进行对比。[结果]n-damo细菌主要在沉积物、湿地和水稻土检出；基于pmoA基因的n-damo细菌的平均检出率是基于16S rRNA基因检出率的7倍，但是这两类基因分子标记物所得到的多样性指数保持相对稳定（1.4-3.4）；贫氮的大九湖泥炭其NC10的丰度仅为0.067%。[结论]n-damo类群种群相对稳定，暗示其行使的生态功能相对单一；贫氮的大九湖泥炭其极低的NC10丰度暗示氮对NC10是限制因子；具有真正氮依赖型甲烷厌氧氧化细菌的Group A可能只占很少的一部分（小于20%），暗示出该类群真正的生态潜能需要进一步评估。本次整合分析为更好的理解n-damo细菌的生活环境、评估不同基因分子标记物下n-damo细菌的检出率、不同亚类群比如Group A和Group B等的丰度和真正的潜在生态功能提供参考。
关键词： 氮依赖型甲烷厌氧氧化菌 整合分析 群落结构 系统发育分析
Integrated analysis of nitrite-dependent anaerobic methane oxidation bacteria
Lizhen Jiang1#, Jiang Liu2#, Xing Xiang3, Renju Liu2, Ruicheng Wang3, Linfeng Gong1
1.Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources, Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, Fujian Province, China;
2.School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, Zhejiang Province, China;
3.State Key Laboratory of Biogeology and Environmental Geology, China University of Geosciences, Wuhan 430074, Hubei Province, China
Received 15 September 2017; Revised 3 January 2018; Published online 16 January 2018
*Corresponding author: Linfeng Gong, Tel: +86-592-2195291; E-mail: gonglinfeng@tio.org.cn
Supported by the the Scientific Research Foundation of Third Institute of Oceanography, SOA (2015018)
#Those authors contributed equally to this work
Abstract: Over the past 10 years, study on nitrite-dependent anaerobic methane oxidation bacteria (n-damo bacteria) is a hot topic in the field of microbial ecology. However, the integrated analysis of these groups based on available database has not been reported.[Objective]In order to give a full overview including ecological distribution, community structure and phylogenic diversity.[Methods]All n-damo bacteria related sequences from NCBI databases (data collected until November 2016) and together with our experimental data from Dajiuhu surface peat samples through 16S rRNA illuminia sequencing were set to do the bioinformatics analysis.[Results]n-damo bacteria were mainly detected in the sediment, wetlands and paddy soil. The average detection rate of n-damo bacteria based on pmoA gene was 7 times more than that based on 16S rRNA gene, whereas Shannon-Wiener index (1.4-3.4) remained relatively stable. The abundance of NC10 was only 0.067% from Dajiuhu peatland, which was the lowest abundance in all published data, indicating nitrogen was a limiting factor for NC10. Group A including Methylomirabilis oxyfera which had been test to have the anaerobic methane oxidation accounts for only a little bit (less than 20%), suggesting that the real ecological potential of methane consumption by n-damo bacteria need more deep study.[Conclusion]The integrated analysis on n-damo bacteria deepen our knowledge of this functional group and may give some guideline for further study.
Key words: nitrite-dependent anaerobic methane oxidation bacteria (n-damo bacteria) integrated analysis community structure phylogenic analysis
甲烷作为一种重要的能源，与人类的生产生活息息相关。然而，甲烷又是地球大气温室效应的“罪魁祸首”之一，其温室效应率是等摩尔CO2的25倍[1]。自然界中存在着多种不同生态类型，例如海洋、湖泊以及泥炭等，对大气甲烷浓度具有重要的影响。其中，微生物介导的甲烷代谢在全球甲烷循环中具有十分重要的地位。而嗜甲烷微生物在甲烷释放到大气的过程中可以对其淋滤，从而缓解不同生态系统中甲烷的释放。
自然界中存在两种典型的甲烷氧化作用，即好氧甲烷氧化和厌氧甲烷氧化。海洋环境中以厌氧甲烷氧化为主，在海洋温室气体甲烷减排中发挥了重要作用，该反应可氧化高达90%的甲烷气体，使得甲烷在进入大气圈之前即被消耗[2]。好氧甲烷氧化被认为是陆地环境如湿地生态系统中甲烷氧化的主要途径，该过程可氧化湿地土壤所产生的50%以上的甲烷量[3]。根据最终电子受体的不同，好氧甲烷氧化又可细化为氧依赖型好氧甲烷氧化(methanotrophs)和亚硝酸盐依赖型甲烷好氧氧化(nitrite-depend aerobic methane oxidation，n-damo)。其中，n-damo在陆地甲烷氧化过程中扮演着重要的角色，对陆地甲烷释放通量具有显著影响，Hu等发现n-damo过程对湿地甲烷的消耗量可达到2%-6%[4]。
n-damo隶属于细菌域NC10门，暂且归属于Candidatus Methylomirabilis oxyfera (M. oxyfera)属[5]。细胞形态呈现多角形，长度为0.8-1.1 μm，属于革兰氏阴性菌。M. oxyfera细菌生长缓慢，细胞代时约为1-2周。M. oxyfera细菌可以将甲烷氧化与亚硝酸盐还原相耦合，从而进行能量代谢。首先将亚硝酸盐还原为NO，通过歧化反应产生O2和N2，一部分O2参与了甲烷单加氧酶(pMMO)和一系列脱氢酶催化的甲烷氧化过程，另一部分O2加入呼吸链参与细胞正常的呼吸。虽然氧气是n-damo甲烷氧化的直接电子受体，但其甲烷的氧化需要亚硝酸盐作为底物。此外，温度和O2浓度都会影响n-damo的甲烷氧化功能。
除了利用传统方法对微生物菌群进行富集[6-9]，当前对n-damo的研究还包括对该类微生物功能群的生态分布[10-18]、微生物与环境的互作[14, 19]以及工艺化应用[7, 20]，所使用的手段包括克隆文库[15]和二代测序分析[16]、荧光原位杂交(FISH)检测分析[6]、脂类化合物分析[21]、同位素分析等[22-23]。例如，通过克隆文库方法Deutzmann等(2014)在深水湖泊Constance湖中发现了n-damo的存在，并推测其偏好于大型的深水湖泊[24]。有意思的是，朱群等发现浅水湖泊中n-damo微生物类群也具有较高的生物多样性[25]。
利用基因分子标记物来研究n-damo类群是当前研究其生态分布的最为重要的手段之一，其中基于16S rRNA和pmoA (编码甲烷单加氧酶α亚基)基因的研究最为常见。近十多年来，国内****也开始关注甲烷厌氧氧化微生物功能群及其参与的生物地球化学过程，一些研究组已经从多个方面对其进行了综述[26-29]。pmoA基因是编码好氧氧化甲烷的第一步关键酶基因，前人在n-damo类群中发现其具有同好氧甲烷菌类似的pmo基因，为此，通过改良针对好氧甲烷氧化菌的pmoA引物和引入巢式PCR等方法从环境样品中获得该类群的pmoA序列信息，为更好地研究n-damo类群提供了重要指导[30]。针对甲烷氧化菌的分子标记物检测方法，周京勇等(2015)[31]已经做了很多的综述，这里不再赘述。前人研究通过16S rRNA[11-12]和pmoA基因的系统发育分析同M. Oxyfera的相似性将现有发现的n-damo微生物划分为4个类群：Group A (相似性≥94%，包含M. Oxyfera)、Group B (相似性在90%-93%之间)、Group C和Group D (相似性差异变化较大)[32]。同时，针对n-damo细菌的研究综述将前人的文献数据进行整合和对比[14-15]，为我们深入了解n-damo细菌提供很好的材料。
前人的研究成果清晰刻画了n-damo细菌的多样性以及生态分布。然而，关于n-damo细菌分离环境、群落结构以及系统进化发育的整合分析仍然相对薄弱。本次研究将通过整合NCBI数据和实验数据，进而对n-damo细菌群落结构以及进化发育关系进行探究，以期更好地研究环境中n-damo细菌群落的分布模式、结构特征以及与环境的互作方式。
1 材料和方法 1.1 数据获取 本次研究数据主要包括三部分：一部分是基于NCBI数据库获得，一部分是从已经发表的文献中获得，第三部分n-damo细菌的分析数据从湖北神农架大九湖表层泥炭样品的16S rRNA扩增子测序中获得。
1.1.1 基于NCBI数据库获得: 直接从NCBI调出所有n-damo细菌的序列，包括16S rRNA和pmoA基因序列。具体方法如下：在NCBI提交的n-damo细菌序列通过检索关键字“16S of NC10”或者“pmoA of NC10”下载获得，一共获得n-damo细菌16S rRNA序列2513条，通过RDP pipeline (http://rdp.cme.msu.edu/pipeline)去除嵌合体一共获得过滤序列2319条，平均长度440 bp；获得n-damo细菌pmoA基因序列2780条，通过RDP FunGenepipeline (http://fungene.cme.msu.edu/FunGenePipeline/)进行嵌合体检测一共获得过滤之后的序列2581条，平均长度389 bp (比对之后掐头去尾所得氨基酸长度为87 aa)。
1.1.2 文献中获取: 将基于二代测序的数据16S rRNA (两组数据，原始数据未能找到)和pmoA基因(两组原始数据)从NCBI SRA进行下载。依据已发表文献统计其群落结构组成和相对丰度信息，通过RDP FunGenepipeline将分属于NC10 phylum的序列(pmoA基因)提取进行后续系统发育树分析。
1.1.3 16S rRNA扩增子测序: 为了验证NC10在泥炭地的检出率和代表性OTU (operational taxonomic units，操作分类单元)数目、多样性指数、覆盖度同已有发表数据之间的对比，将取自湖北神农架大九湖泥炭地的9个泥炭表层样品(2014年8月采集)提取DNA之后利用细菌16S rRNA V4区通用引物520F (5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和802R (5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)进行Miseq二代测序分析，利用QIIME 1.9.0将同属于NC10的序列提取出来，最终一共获得148条reads，平均长度240 bp。
1.2 NC10 phylum的OTU划分及其发育树分析 利用RDP分析中的pipeline提取NC10中代表性的OTU (16S rRNA和pmoA分别用0.03和0.05进行OTU/cluster划分)和丰度信息，之后以Candidatus M. oxyfera (FP565575.1)与疣微菌门等类群的16S rRNA和pmoA基因序列分别加入作为参考序列，利用MEGA 6.0软件进行系统发育树分析。
1.2.1 NC10 phylum序列的环境信息获取: 以KP743861.1为例，在Linux系统终端，将通过嵌合体过滤的所有序列(16S rRNA和pmoA)依据ID号通过wget和sed命令调取该序列的分离环境信息(isolation_resource)。用cat命令将所有序列环境信息合并，用excel将分离环境信息和所包含的序列数目进行统计。
1.2.2 二代测序来源的pmoA基因序列分析(依据前人参考文献，截止到2016年11月): 把NCBI SRA数据库检索到的两组n-damo的数据(454测序平台，pmoA基因，具体请参见表 1)，使用RDP FunGenepipeline过滤掉长度小于80个氨基酸、百分比cutoff值0.4、聚类距离cutoff值0.05的序列，随后将剩下的序列进行OTU划分。依据Bioedit (version 7.0.0)软件，将代表性OTU序列同Candidatus M. oxyfera pmoA基因通过做本地化比对，提取同Candidatus M. oxyfera pmoA基因序列相似性大于94%的序列用MEGA 6.0[33]进行系统发育树构建，相似性小于94%的序列定义为methane oxidation bacteria (MOB)，为非n-damo细菌类群，在本文中不做探讨。
表 1. n-damo细菌已有二代测序数据结果统计表及其同克隆文库数据对比 Table 1. Statistics of the second generation sequencing result for n-damo bacteria and its comparison with clone library data
| Studying sites and environment | Sequencing platform/target gene | Total sequence number/ n-damosequence number | Total/n-damo coverage/% | n-damo relative abundance/% | Total OTU number/n-damo OUT number | Total/n-damo shannon index | Accession number | Reference |
| Zoige wetland | 454/pmoA | 19048/3404 | 85/98.9 | 8.5 | 2900/39 | 7.87/1.66 | SRX760439 | Not available |
| Zoige wetland | 454/pmoA | 19801/1693 | 85/91.4 | 17.8 | 2973/54 | 7.04/3.49 | SRX760438 | Not available |
| China Freshwater habitats | Illumina/ 16SrRNA | -/28-4811 | -/92.9-99.8 | 0.4-2.5 | 11-97 | 1.81-3.09 | - | Shen et al., (2016)[18] |
| Agriculture soils | Illumina/ 16S rRNA | -/- | -/- | 0.1-4.5 | 26-71 | 2.18-3.19 | - | Shen et al., (2016)[16] |
| Clone library dataset (referred to Shen et al., (2015)[14] | ABI3730/ 16S rRNA pmoA | Not available | Not available | - | 3-30 1-16 | - | - | Shen et al., (2015)[14] |
| Qinghai-Tibetan Plateau soil | 454/16S rRNA | 64381/70 | 90.0/95.7 | 0.109 | 3 | 7.03/0.29 | SRP033622 | Deng et al., (2014)[34] |
| southwestern Finland soil | 454/16S rRNA | 105393/209 | 96.8/96.2 | 0.198 | 8 | 4.82/1.34 | ERS515436-ERS515450 | Tsitko et al., 2014[35] |
| Zoige peatland | Miseq/16S rRNA | 286723/3219 | 99.6/99.7 | 1.122 | 10 | 5.81/1.35 | PRJEB17863 | Zhong et a., 2017[36] |
| Dajiuhu Peatland | Illumina/ 16S rRNA | 221480/148 | 98.5/94.6 | 0.067 | 8 | 6.69/1.47 | / | This study |
表选项
1.2.3 二代测序来源的16S rRNA基因分析: 对于大九湖泥炭获得的16S rRNA序列，先用QIIME 1.9.0提取所有属于NC10门类的reads序列信息，利用mothur软件的dist.seqs、cluster、bin.seqs和get.oturep等命令获得代表性OTU，利用collect.single命令获得多样性指数；同时连同NCBI数据库获得NC10门的16S rRNA代表性OTU进行系统发育分析。
2 结果和分析 2.1 n-damo细菌基因序列记录的环境信息统计 16S rRNA和pmoA基因都显示n-damo细菌主要来自沉积物环境(图 1)，分别占总序列数目的64.4% (1438条)和65.0% (1667条)。此外，消落带土壤、水稻田土以及湿地生态系统也具有相对较高的丰度。然而，培养物与泥炭来源的序列则相对较少。
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| 图 1 n-damo细菌NCBI记录的16S rRNA和pmoA序列分离来源统计 Figure 1 Statistic of isolation resource of n-damo bacteria from NCBI based on 16S rRNA and pmoA gene. |
| 图选项 |
2.2 n-damo类群代表性OTU的划分阈值 将n-damo类群的pmoA和16S rRNA基因序列通过RDP pipeline聚类分析之后依据序列相似性阈值和cluster (等同于OTU)数目进行二维投点(图 2)。当16S rRNA基因的阀值为0.03时，pmoA基因用于区分cluster (≤16S rRNA划分的cluster数目)的最小阀值为0.04或者0.05。为了匹配前人一般将0.05作为经典的功能基因OTU的划分阈值，后续的pmoA基因cluster的划分均依据0.05作为OTU的划分阈值。
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| 图 2 n-damo细菌pmoA和16S rRNA的RDP聚类结果依据划分距离和总聚类数目进行投点 Figure 2 RDP cluster results of n-damo bacteria based on pmoA and 16S rRNA gene along with different cutoff value. |
| 图选项 |
依据RDP pipeline一共获得n-damo细菌的代表性OTU (cluster)分别为176个(16S rRNA基因，0.03的阈值)和79个(pmoA基因，0.05阈值)。将M. oxyfera与疣微菌门等类群的16S rRNA和pmoA基因序列分别作为参考序列进行了系统发育树分析(图 3和图 4)。
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| 图 3 n-damo细菌16S rRNA系统发育树(NJ-k2法，MEGA 6，bootstrap=1000) Figure 3 16S rRNA phylogenetic tree analysis of n-damo bacteria (NJ - k2 method, MEGA 6, the bootstrap= 1000). The number in bracket represents the accession number, the cluster and sequence number in the parentheses followed the taxonomic subgroups represents the total cluster and sequence number, and the number 0.2 represents the mutation rate. |
| 图选项 |
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| 图 4 n-damo细菌pmoA系统发育树(NJ-p distance法，MEGA 6.0，bootstrap=1000) Figure 4 pmoA phylogenetic tree analysis of n-damo bacteria (NJ-p distance method, MEGA 6, the bootstrap= 1000). The number in bracket represents the accession number, the sequence number represent the total sequence number belonged to this cluster, the number on the branch represents the bootstrap credibility, and the number 0.05 represents the mutation rate. |
| 图选项 |
依据16S rRNA系统发育树(图 3)，可将n-damo细菌分为4个类群，其中包含M. oxyfera的group A一共含有3个OTU(5条序列)，而group B包含128个OTU (2232条序列)。在大九湖泥炭地中发现了148条序列(8个OTU)，均隶属于group B，包含8个OTU。
基于pmoA基因构建的系统发育树显示(图 4)，属于M. oxyfera一共包含7个OTU (233条序列)，而可能属于M. oxyfera-like分为两支(group B和group C/D)，共计63个OTU(2341条序列)。
2.3 二代测序中n-damo菌群的OTU、多样性指数、系统发育分析及其同克隆文库对比分析 根据文献统计，二代测序来源的n-damo细菌一共有4组，其中2组用16S rRNA(数据未在SRA数据库找到，本文只用文献报道的分析结果)，另两组用pmoA (表 1)，具体数据如表 1所示。克隆文库数据参考自Shen等综述论文[14]。本研究中大九湖泥炭一共获得8个OTU，香浓指数为1.47，覆盖度为95.2%，占总的序列数目的0.067% (表 1)。
进一步，在两组454 pmoA基因测序数据中与Candidatus M. oxyfera相似性大于94%的OTU代表性序列及其参考序列进行系统发育树构建，如图 5所示。所有OTU都聚在Candidatus M. oxyfera这个类群，其中group B类群占比最大，group C/D次之，此外，这些n-damo类群同依赖氧气型甲烷氧化菌类群明显分开。
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| 图 5 n-damo细菌pmoA基于454平台测序数据代表性OTU的系统发育树(NJ-p distance法，MEGA 6.0，bootstrap=1000) Figure 5 representive OTUs' phylogenetic tree of n-damo bacteria based on pmoA from the 454 sequencing platform (NJ-p distance method, MEGA 6, the bootstrap=1000). The number in bracket represents the accession number, the cluster and sequence number followed the taxonomic subgroups represents the total cluster and sequence number, the number on the branch represents the bootstrap credibility, and the number 0.05 represents the mutation rate. |
| 图选项 |
3 讨论 3.1 n-damo细菌的分布 n-damo群落主要分布在沉积物、湿地和水稻土等环境中，其独特的水文条件能够为n-damo的生存提供相对厌氧的环境，进而促进n-damo细菌群落的代谢[29]。此外，沉积物与水稻土环境相对富含NO2-/NO3-，可以为n-damo的氮依赖型甲烷厌氧氧化提供充足的底物。同时，前人研究表明，沉积物与水稻土均为富含产甲烷菌的生态系统类型，其丰富的产甲烷菌群落为n-damo细菌提供甲烷源[37]。因此，高含量的NO3-与CH4浓度促使n-damo群落主要分布于沉积物与湿地环境。对比沉积物与湿地环境，泥炭中则具有较少的n-damo细菌(图 1)。虽然泥炭地也是重要的大气甲烷源[38]，并且具有相对厌氧环境，然而泥炭地氮含量相对较低，因而低浓度的NO3-无法支撑n-damo细菌的生长。此外，前人基于富集培养物的室内模拟实验发现温度也是可能影响n-damo类群的重要环境因子[32]。因为无法统计分离位置的年平均温度或者原位温度等信息，因此无法展开温度与n-damo细菌的相关分析。
3.2 基于16S rRNA和pmoA基因检出率的差异 依据16S rRNA基因，同Candidatus M. oxyfera大于94%相似性的是具有氮依赖型甲烷厌氧氧化功能的类群group A，而相似性在90%-93%的归为group B，是潜在具有氮依赖型甲烷厌氧氧化功能的类群，其是否具有甲烷氧化功能还有待探明[29]。而我们从数据库中获得的Candidatus M. oxyfera-like的16S rRNA序列，可能只有少量类群真正具有甲烷厌氧氧化功能(仅5条序列，占整个检出16S rRNA序列约0.2%，图 3)。前人基于Illumina测序平台的16S rRNA二代测序数据发现，NC10占整个数据量的0.4%-2.5%[18]和0.8-4.5%，平均检出率在2%左右[16]。本次研究中，大九湖泥炭表层中NC10序列只占到0.067%，比前人获得的丰度低10倍左右，究其原因泥炭地氮含量相对较低，因而低浓度的NO3-无法支撑n-damo进行氮依赖型甲烷厌氧氧化，不利于n-damo的生存。前人研究发现，n-damo的对甲烷通量的贡献只有2%-6%[4]，也暗示出其在环境中的丰度并不高。
从pmoA基因的系统发育树(图 4)可以看出，真正具有n-damo功能的序列(属于Candidatus M. oxyfera)只占10%左右。而基于454平台的n-damo细菌pmoA基因显示，真正属于n-damo细菌类群的只占总pmoA基因序列(见表 1)的8.5%和17.8%。同时，基于表 1结果显示出n-damo细菌基于pmoA基因的平均检出率在13%左右。此外还可以看出，相比较于16S rRNA基因，pmoA基因更倾向于检出Candidatus M. oxyfera，平均检出率是16S rRNA基因的7倍左右。
前人通过二代测序结果也显示出，属于Candidatus M. oxyfera这个类群的16S rRNA序列数目也仅为所有16S rRNA序列的0.8%-4.5%[16]或0.4%-2.5%[18]。然而，从对Zoige (若尔盖)泥炭地pmoA基因分析发现，属于Candidatus M. oxyfera类群的序列数目为整个pmoA序列的8.5%和17.8% (表 1)。因此，可以看出二代测序检测n-damo细菌中，用pmoA基因检出率是16S rRNA检出率的3.4-44.5倍。
针对n-damo类群，无论是克隆文库还是二代测序，无论是16S rRNA还是pmoA基因，依据表 1可以看出，OTU数目都在1-2个数量级，香浓-维纳多样性在1.4-3.4之间，显示出n-damo细菌这个类群种群数目比较稳定，也进一步暗示该类群微生物行使的生态功能比较专一。
3.3 具有氮依赖型甲烷厌氧氧化功能的亚类群相对稀少 图 3、图 4和图 5系统发育分析可以看出，属于group A (Candidatus M. oxyfera)的OTU和序列数目，无论是用克隆文库还是二代测序，均属于稀有类群，而其他类群(Group B、C和D)含量相对较高。
这同前人基于16S rRNA的二代数据系统发育分析相符合，属于group A的只包含1-7号OTU，属于Group B、C和D分别包含8-81号OUT、82-96号和97-115号OTU，其中Group B的含量占整个类群的80%以上[16]。同样，基于16S rRNA二代测序的另一个研究的系统发育树分析也显示出，Group A只占10%不到，而Group B占70%以上[18]。而本次基于前人数据n-damo细菌的二代测序(pmoA基因)进行系统发育分析中，属于Group A的未检出，主要是Group B和C/D类群。这说明，无论是pmoA基因还是16S rRNA基因，真正具有氮依赖型甲烷厌氧氧化的类群(Group A)只占很少的一部分。暗示我们在评估n-damo细菌的真正生态功能效果时需要谨慎，最好借助N同位素标记的方法来进行准确评估。
4 结论 为了更好地研究n-damo类群的生活环境、评估其基于16S rRNA和pmoA基因分子标记的检出率、不同n-damo类群的相对丰度和厌氧氧化甲烷的生态潜能，基于整合分析的思想，本文从NCBI核酸数据库中(数据搜集到2016年11月)将所有同n-damo细菌相关的序列(16S rRNA和pmoA的克隆文库和二代测序数据)进行提取，通过RDP pipeline和linux系统简单命令操作再综合系统发育树分析，同时，对大九湖泥炭地表层泥炭进行16S rRNA二代测序分析特征提取NC10序列并进行深入分析，最终得出如下结论：一、n-damo细菌主要分布于沉积物中，其次为湿地与水稻田土，暗示水文条件引起的微厌氧环境有利于该类群的生存代谢，贫氮的泥炭地中NC10含量很少，只占到0.067%；二、16S rRNA划分OTU的阈值0.03对应pmoA基因划分OTU的阈值0.05，符合前人划分功能基因OTU采用的经典阈值。三、基于pmoA基因的n-damo细菌的检出率(8.5%-17.8%)是16S rRNA基因的检出率(0.2%-4.5%)的3.4-44.5倍，但是OTU数目(处于1-2个数量级)和香浓-维纳指数(1.6-3.4)保持相对稳定，同时，n-damo细菌的数量分别占所有16S rRNA和pmoA基因的2%和13%左右，暗示该类群种群相对稳定，其行使的生态功能相对单一；四、具有真正氮依赖型甲烷厌氧氧化功能群的Group A可能只占很少的一部分(小于20%)，而其他类群丰度占到70%以上，进一步暗示该类群真正的生态潜能可能与之前报道的占甲烷消耗通量的2%-6%相符合。本次整合分析为更好地了解n-damo细菌群落的生态分布、不同分子标记物基因用于研究该类群的检出率、生活环境、不同亚类群比如Group A和Group B等的丰度和其可能的潜在生态功能提供参考。
本文对n-damo的整合分析主要聚焦陆地环境，而对海洋环境的分析较少，前人已经发现Group C/D存在于海洋环境中，富集培养实验对于探究Group C/D在海洋中的生态功能具有重要意义。同时，陆地环境中出现的高丰度类群Group B，对于其是否具有真正生态潜能还有很多工作需要开展，通过富集培养、转录组分析必将有助于揭示这个类群的生态功能。
致谢: 本研究感谢国家海洋局第三海洋研究所环境微生物课题组黄兆斌等在数据分析上的帮助。
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