张月超1,2, 肖雷雷1, 王欧美3
, 刘芳华1 1.中国科学院烟台海岸带研究所, 海岸带生物学与生物资源利用所重点实验室, 山东 烟台 264003;
2.中国科学院大学, 北京 100049;
3.滨州医学院, 山东 烟台 264003
收稿日期：2017-10-17；修回日期：2017-11-22；网络出版日期：2018-02-08
基金项目：国家自然科学基金（41573071，41371257，91751112，41703075）；中国科学院前沿科学重点研究项目（QYZDJ-SSWDQC015）；山东省自然科学****基金（ZR2016DQ12）；“泰山****”青年专家计划（tsqn20161054）
作者简介：刘芳华, 博士, 中国科学院烟台海岸带研究所研究员。2009年获得中国科学院上海生命科学研究院微生物学博士学位。现任山东微生物学会理事, 中国微生物学会地质微生物学专业委员会委员。2014年获中科院"****"、2016年获"山东省****"及"泰山****青年专家"计划资助, 从事"电微生物学"研究, 解析微生物及其与动、植物之间的共生机制。发现并证实了"电子驱动甲烷产生"新机制, 2017年7月正式被写入新版美国教科书 Microbiology 。先后主持了水圈微生物重大研究计划培育项目和两项面上项目; 近年的科研成果以第一/通讯作者身份在 Energy & Environmental Science (IF=29.5), Geochimica et Cosmochimica Acta , ISME Journal , Environmental Science:Nano 和 Environmental Microbiology 等国际高端学术刊物上发表SCI论文33篇, 单篇最高SCI引用124次
*通信作者：王欧美, Tel:+86-535-6913374, E-mail:omwang@aliyun.com
刘芳华, Tel/Fax:+86-535-2109268, E-mail:fhliu@yic.ac.cn
摘要：[目的]从黄河三角洲滨海湿地土壤中获得同时具备产氢、产电以及异化铁还原能力的多功能菌株。[方法]通过厌氧分离技术从黄河三角洲土壤中分离得到纯菌株，16S rRNA基因测序后与数据库已有序列进行比对。利用革兰氏染色及扫描电镜观察菌株形态，并用气相色谱（gas chromatography，GC）和液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测其生理代谢底物和产物。通过添加不同形态铁氧化物检测该菌株Fe（Ⅲ）的还原能力。构建微生物燃料电池（Microbial fuel cells，MFCs）检测该菌株的电化学活性。[结果]16S rRNA基因序列比对发现其与双酶梭菌 Clostridium bifermentans 的相似性达97.99%。革兰氏染色结果显示为阳性菌。能够利用葡萄糖为底物发酵产生氢气、二氧化碳、乙酸和丁酸。Fe（Ⅲ）还原能力检测发现，其不仅可以还原柠檬酸铁（FeC6H5O7）中可溶性的Fe（Ⅲ），还可以还原无定形铁水铁矿（FeOOH）和晶型纳米磁铁矿（Fe3O4）中的Fe（Ⅲ）。此外，经MFCs检测发现，该菌具有电化学活性，最大电流输出密度可达6.5 mA/m2，且在0.15 V位置存在氧化峰。[结论]本研究从土壤中成功分离得到了一株同时具有产氢、产电以及异化铁还原能力的多功能梭菌菌株，保藏并命名为 Clostridium bifermentans EZ-1。
关键词： 滨海湿地 双酶梭菌 产电 产氢 异化铁还原
Hydrogen-producing and electrochemical properties of a dissimilatory Fe(Ⅲ) reducer Clostridium bifermentans EZ-1
Yuechao Zhang1,2, Leilei Xiao1, Oumei Wang3
, Fanghua Liu1 1.Key Laboratory of Coastal Biology and Bioresource Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, Shandong Province, China;
2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3.Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China
Received 17 October 2017; Revised 22 November 2017; Published online 8 February 2018
*Corresponding author: Oumei Wang, Tel: +86-535-6913374, E-mail:omwang@aliyun.com
Fanghua Liu, Tel/Fax: +86-535-2109268, E-mail:fhliu@yic.ac.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (41573071, 41371257, 91751112, 41703075), by the KeyResearch Project of Frontier Science of Chinese Academy of Sciences (QYZDJ-SSW-DQC015); by the Natural ScienceFoundation of Shandong Province (ZR2016DQ12) and by the Young Taishan Scholars Programme (tsqn 20161054)
Abstract: [Objective]To obtain and characterize a versatile strain isolated from the soil of Yellow River Delta.[Methods]The strain was isolated by anaerobic technologies and identified by sequencing the 16S rRNA gene. The morphology was depicted with Gram staining and scanning electron microscope. High performance liquid chromatography and gas chromatography were used to analyze the metabolic substrates and productions. Ferric citrate (FeC6H5O7), ferrihydrite (FeOOH) and magnetite (Fe3O4) were supplied to detect the capability of Fe(Ⅲ) reduction of this strain. Microbial fuel cells were constructed with graphite as electrodes to test the electrochemical activity of this strain.[Results]Compared to Clostridium bifermentans , the similarity of 16S rRNA gene is 97.99%. It is a rod, Gram-positive bacterium, which can use glucose to produce hydrogen, carbon dioxide, acetate and butyrate. The Fe(Ⅲ) reduction results showed that it could reduce soluble ferric citrate, amorphous ferrihydrite and crystal magnetite. Furthermore, the electrochemical activity was detected and the maximum current density peaked at 6.5 mA/m2.[Conclusion]In this work, a versatile strain which is capable of producing hydrogen, electricity and reducing iron oxide, was successfully isolated from the soil of Yellow River Delta named as Clostridium bifermentans EZ-1.
Key words: coastal wetland Clostridium bifermentans producing electricity hydrogen evolution dissimilatory Fe(Ⅲ)-reduction
化石原料的燃烧不仅导致全球气候变暖，同时还对大气造成污染。氢气作为一种清洁能源，具有较高的热值(ΔH=–285.8kJ/mol)，是一种潜在的化石能源替代品。目前，氢气的制备主要通过电解和烃类裂解转化等高耗能的生产工艺，生物制氢因其能耗低及污染小等特点受到广泛关注[1]。生物制氢途径可分为光解和发酵两大途径，发酵途径根据是否需要光可划分为光发酵和暗发酵两类[2]。暗发酵相比光发酵不需要光源，节约空间降低成本，具有较高的应用前景。已报道的暗发酵产氢微生物主要有梭菌属 Clostridium[3]、肠杆菌属 Enterobacter[4]和芽孢杆菌属 Bacillus[5]等，其中 Clostridium 因其分布广泛、底物多样、产氢量高等特点受到广泛关注和研究。
Clostridium 可以利用多种糖作为底物发酵产氢，同时产生乙酸、丁酸和乙醇等发酵副产物，根据副产物的类型，可以将利用葡萄糖产氢途径分为乙酸发酵型和丁酸发酵型[6]，见公式(1)和公式(2)。
 | 公式(1) |
 | 公式(2) |
随着对 Clostridium 的深入研究发现其不仅具有发酵产氢能力，同时还具有异化铁还原能力。早在20世纪50年代，Bromfield等[7]就发现在土壤中存在的 Clostridium spp.具有异化铁还原能力。目前已分离得到了多株具有异化铁还原能力的梭菌，如 Clostridiumbeijerinckii[8] 、Clostridium butyricum[9]和 Clostridiumsporogenes[10]等。研究已证实 Clostridium butyricum 是典型的产氢模式菌株，2001年Park等[9]从微生物燃料电池中分离得到的 Clostridiumbutyricum EG3同时具有电化学活性和还原无定形水铁矿中Fe(Ⅲ)的能力。然而，自然环境中是否存在多功能(产氢、产电和异化铁还原)梭菌仍不清楚。
异化铁还原菌(dissimilatoryFe(Ⅲ)-reducing microorganisms)是指在代谢过程中以胞外Fe(Ⅲ)为电子受体，将Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)的一类微生物，在此过程中，胞外含Fe(Ⅲ)矿物作为电子受体接收来自胞内代谢产生的电子从而完成呼吸过程。根据胞外电子传递过程中是否产生用于微生物生命活动需要的能量，异化铁还原菌可分为呼吸型异化铁还原菌(respirativedissimilatory Fe(Ⅲ)-reducing microorganisms)和发酵型异化铁还原菌(fermentativedissimilatory Fe(Ⅲ)-reducing microorganisms)，前者是直接利用Fe(Ⅲ)作为电子受体产生能量；而后者是微生物发酵有机质，期间产生的部分电子传递给Fe(Ⅲ)，因此由此发生铁还原，并不是能量的来源[11]。
铁是地球表面含量最丰富的元素之一，多以铁氧化物的形式广泛存在于土壤、河流与海洋沉积物中。根据结晶程度的不同，铁氧化物矿物可以分为无定形铁矿(水铁矿)和晶型铁矿(赤铁矿、针铁矿和磁铁矿)[12]，且在自然界中，晶型铁矿的丰度往往高于无定形铁矿，约是无定形铁矿的2–10倍[13]。异化铁还原菌不仅在铁的生物地球化学循环过程中扮演着重要的角色，还在生物原位修复和基于微生物燃料电池技术进行电能回收等领域发挥着重要功能。目前的研究主要集中在呼吸型的异化铁还原菌，尤其是 Geobactersulfurreducens[14]和 Shewanellaoneidensis[15]。相比呼吸型的异化铁还原菌，发酵型异化铁还原菌的研究才刚刚起步。
早在本世纪初，Park等[9]从微生物燃料电池中分离得到一株革兰氏阳性梭菌 Clostridiumbutyricum EG3，其具有电化学活性且能够还原无定形水铁矿中的Fe(Ⅲ)。无论如何，迄今为止鲜有新的同时兼具电化学活性和还原Fe(Ⅲ)的梭菌被分离到，这也导致革兰氏阳性菌胞外电子传递机制的研究相比革兰氏阴性菌要滞后很多。湿地的厌氧环境和干湿交替条件有利于铁氧化物的累积富集，黄河三角洲滨海湿地作为典型的湿地生态系统，铁含量约是世界土壤平均值的2倍[16]。本研究中，我们分离得到了一株革兰氏阳性菌 Clostridiumbifermentans EZ-1。与以往的菌株相比，该菌株同时具有产氢、产电和异化铁能力，这为研究生物产氢和革兰氏阳性菌胞外电子传递机制提供了新的选择。
1 材料和方法 1.1 采样 土壤样品取自黄河三角洲滨海湿地(37°45′46″N，118°58′40″E)[17]表层土(0–10cm)，放入无菌密封袋中运回实验室，分别存储在4与–80备用。
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| 图 1 黄河三角洲采样位点示意图[17] Figure 1 The sampling location in YellowRiver Delta[17]. |
| 图选项 |
1.2 富集培养 孵育：取10g表层土添加到盛有100mL灭菌除氧无菌水的厌氧瓶中，将厌氧瓶放在30培养箱中黑暗条件下孵育1周。转接：用无菌脱氧注射器取5 mL悬浊液转接到装有80 mL灭菌除氧的PYG培养基中，继续放在30培养箱中孵育1周。培养基PYG：Peptone5.0 g/L，Tryptone 5.0 g/L，Yeastextract 10.0 g/L，Glucose 4.0 g/L，CaCl20.008 g/L，MgSO4·7H2O 0.016g/L，K2HPO40.04 g/L，KH2SO40.04 g/L，NaHCO30.04 g/L，NaCl5 g/L，L-cysteine0.25 g/L；pH6.3±0.2。
1.3 分离鉴定 用无菌脱氧注射器取1 mL二次孵育的悬浊液注射到装有9 mL灭菌除氧无菌水厌氧管中，依次按照101–106倍进行梯度稀释。在厌氧操作箱中(涉及无菌操作均在厌氧操作箱内进行)用灭菌过的接种环蘸取稀释106倍的悬浊液在事先倒好的PYG固体培养基上划线。培养：将划好的平板放入厌氧带中密封后于30培养箱中暗培养48 h。挑选不同形态单一菌落接入20 μL无菌水中，2 μL用于PCR，剩余的转接到装有5 mL灭菌除氧PYG液体培养基的厌氧管中30黑暗培养。PCR反应体系：2 μL buffer缓冲液；2 μL dNTP (2.5 mol/L)；0.5μL Taq酶(5U/μL)；0.5μL Ba907R (20 μmol/L，5′-AGA GTTTGATCCTGG CTCAG-3′)反向引物；0.5μL Ba27F (20 μmol/L，5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′)正向引物；2 μL单菌落悬浊液模板；2.5 μL无菌水。PCR程序：95，30 s；55，30 s；72，1.5 min，循环30次。将得到的PCR产物进行16S rRNA基因测序。将序列结果在Greengens上进行序列比对。16S rRNA基因测序结果提交到NCBI数据库中，序列号为MF510818。系统进化分析通过MEGA 6.0软件按邻接法(Neighbor-Joining)计算完成，距离系数模型为MaximumComposite Likelihood, Bootstrap次数为1000。菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC 13913。
1.4 形态观察
1.4.1 革兰氏染色: 取0.05 mL菌悬液滴加到载玻片上，涂匀，烤干；滴加1滴草酸铵结晶紫液，染1min后水洗；滴加1滴碘液，染1min后水洗；95%乙醇脱色20s；滴加1滴蕃红复染3min后水洗；光学显微镜镜下观察。
1.4.2 扫描电镜: 取5 mL菌悬液于离心管中，3000r/min离心5min，弃上清；添加5mL PBS吹打悬浮，3000r/min离心5min，弃上清，重复1次；添加5mL 2.5%戊二醛，吹打悬浮，固定，4过夜；30%、50%、70%、90%和100%×2乙醇依次梯度脱水；第二次100%乙醇脱水离心后保留1mL，吹打悬浮菌团；取0.05mL菌悬液滴加到盖玻片上于干燥皿中晾干；喷镀金属膜；高分辨冷场发射扫描电镜(HITACHIS-4800)观察。
1.5 生长及代谢物检测
1.5.1 生长曲线: 以葡萄糖为底物，接种量1%，30暗培养，每2h取1次样，用紫外分光光度计(600nm)测吸光值。
1.5.2 代谢底物及产物检测: 配置PY培养基(无底物葡萄糖)，血清瓶(25 mL)分装，每瓶10 mL；分别添加葡萄糖、蔗糖、木糖、纤维二糖和纤维素作为底物，终浓度均为4 g/L；30，黑暗条件下培养，每2 h取1次样，共9次(代谢底物检测只18 h取1次)，进行气相色谱和液相色谱检测。
气相色谱检测：用气相色谱进样针取0.2mL血清瓶顶部气体进行气相色谱(安捷伦7820)检测。检测条件：检测器TCD，温度250；进样口温度80；柱箱温度80；载气为氮气，流速10 mL/min。液相色谱检测：取0.1 mL菌悬液于0.9mL去离子水中稀释10倍，0.22μm滤膜过滤，液相色谱(安捷伦1260)检测。检测条件：检测柱HPLC-Hi-Plex H，300×7.7 mm，柱温60；检测器为示差检测器(RID)，温度55；流动相为5 mmol/L硫酸，流速为0.6mL/min。
1.6 异化铁还原能力检测
1.6.1 无定形水铁矿: 实验室合成，参照Lovley实验室方法[18]。合成方法如下：称取162.2g FeCl3·6H2O溶于400mL去离子水，加转子搅拌至溶解；用10mol/L的NaOH调节pH至7.0；将溶液分装至250mL的离心瓶中；离心洗涤，用低速离心机3500r/min离心10min，弃上清，用去离子水将沉淀重新悬浮，再离心10min，重复此操作进行清洗，直至离心后上清液变黄色，此清洗次数约为4–5次；洗至上清液变黄后，弃掉上清，收集无定形铁，加入400mL去离子水溶解后得到浓度约为1mol/L的无定形铁；置于黑暗条件下保存，测定浓度后使用。
1.6.2 晶型磁铁矿: 实验室合成，参照Young等[19]的合成方法：将0.85mL 12.1 mol/L的HCl添加到除氧的去离子水中；称取5.2g FeCl3和2.0 g FeCl2依次溶于配好的HCl溶液中；然后逐滴加入到250 mL 1.5 mol/L的NaOH溶液中，边加边充分搅拌；在产生的黑色沉淀物附近添加一块磁铁将沉淀物吸附与溶液分开，将上清倒掉；加入除氧去离子水清洗后4000 r/min离心去上清，重复3次；加入500mL 0.01 mol/L HCl溶液中和纳米颗粒上的阴离子；4000 r/min离心去上清，加入除氧去离子水将阳离子纳米颗粒悬浮，最终形成明显的阳离子胶体。
将柠檬酸铁、水铁矿和磁铁矿分别添加到无菌除氧10mL PYG培养基，使其终浓度分别达到40mmol/L柠檬酸铁，2.5、5.0和10.0mmol/L水铁矿和5.0、10.0mmol/L和20mmol/L磁铁矿，于30培养箱中黑暗培养24h。菲啰嗪显色法检测培养液中Fe(Ⅱ)含量，具体方法如下：将0.1mL样品加入到0.9mL的0.5mol/L的盐酸中，室温下静置24 h，8000 r/min离心5 min；取上清0.1 mL，加入到1.9mL 200 mmol/L HEPES缓冲液配制的0.1%菲啰嗪溶液中，反应5min后，紫外分光光度计562nm波长下测定吸光度。最后根据标准曲线计算Fe(Ⅱ)浓度。
1.7 电化学活性检测 构建“H”型双室MFCs。将灭菌后的MFCs在无菌操作台内进行组装，阴阳两室之间用质子交换膜隔开，以钛丝连接的石墨片(30 mm×25 mm×3 mm)作为电极，外电路连接一个1000Ω的外电阻。阳极室注入100mL无菌PYG培养基，阴极室添加100 mL铁氰化钾溶液。阳极室除氧，抽真空10 min，冲氮气30s；抽真空5min，冲氮气30s；抽真空1min，冲氮气30s。接种1%EZ-1菌液。将MFCs连接到数据采集系统采集电压信号，ExcellLINX软件每60s记录1次电压信号，连续采集24h。采用循环伏安法(cyclicvoltammetry，CV)测试MFCs体系的氧化还原特性，在运行结束后的MFCs开路状态下加入参比电极(Ag/AgCl)，以阳极为工作电极，铂电极为对电极，构建三电极体系。用660E电化学工作站以10mV/s的扫描速度在–0.3–0.4V的范围内进行CV扫描。
2 结果和分析 2.1 菌株分离鉴定 为了确认所分离菌株的分类地位，对其16SrRNA基因序列进行了测定和比对。测定的基因片段长度为1227bp。将测得序列通过Blast比对，选取相似性较高的序列，以及典型的产氢、产电和异化铁还原菌的16S rRNA基因序列，构建系统发育树(图 2)。结果显示该菌株与 C. bifermentans HT2 (DQ928211)的同源性最高，为97.99%，初步确认该菌株为 C.bifermentans 。
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| 图 2 基于16SrRNA基因构建的菌株EZ-1系统发育树 Figure 2 Neighbor-Joining phylogenetic treebased on 16S rRNA gene fragments (1227 bp) of strain EZ-1 and referencespecies. The isolated strain, Clostridium bifermentans EZ-1, was inboldface. Bootstrap values at nodes were calculated using 1000 replicates byMaximum Composite Likelihood model. Scale bar meant 0.02 substitutions pernucleotide sequence position. |
| 图选项 |
2.2 形态鉴定 经过24 h黑暗培养(30)，EZ-1在PYG固体培养基(添加2%琼脂糖)上形成白色光滑圆形菌落(图 3-A)。革兰氏染色显示，菌体呈紫色(图 3-B)。扫描电子显微镜检测，菌株呈棒状，长2.5–3.5 μm (图 3-C、D)。
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| 图 3 EZ-1单菌落形态及扫描电镜图像 Figure 3 The images of signal colony (A), Gramstaining (B) and scanning electronic microscopy (C, D) of Clostridiumbifermentans EZ-1. |
| 图选项 |
2.3 生长及代谢物分析 30进行黑暗培养，接种量1%的EZ-1在PYG液体培养基中快速进入指数生长期，延滞期小于2 h，随后到达平稳期，最大 OD 值可达4.5( OD600)，平稳期较短，且迅速进入衰亡期(图 4-A)。葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、木糖(xylose)、纤维二糖(cellbiose)和纤维素(cellulose)被作为底物进行发酵产氢测试，结果只有葡萄糖可被利用产氢，其他糖类均不能被EZ-1用来产氢，产氢量同无任何底物添加的PY培养基对照类似(图 4-B)。
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| 图 4 Clostridium bifermentans EZ-1生长曲线(A)及底物利用情况(B) Figure 4 The growth curve of Clostridiumbifermentans EZ-1 (A) and the utilized substrates of the strain (B). Barsrepresented standard deviations of the means. |
| 图选项 |
以葡萄糖作为发酵底物，气相、液相色谱检测EZ-1的代谢产物。随着代谢底物葡萄糖的消耗，代谢产物氢气、乙酸和丁酸的量逐渐积累，18h时葡萄糖消耗约75%(图 5)。1mol葡萄糖可生成1.114 mol氢气。乙酸的生成量约是丁酸生成量的5倍(图 5-C，D)，乙酸途径相比丁酸途径占优势，说明EZ-1为乙酸型的发酵产氢菌。
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| 图 5 EZ-1代谢底物葡萄糖(A)消耗及产物氢气(B)、乙酸(C)和丁酸(D)生成情况 Figure 5 The accumulation of hydrogen (B), acetate (C) and butyrate (D) with the consumption of glucose (A). Barsrepresented standard deviations of the means. |
| 图选项 |
2.4 异化铁还原能力 含有可溶性柠檬酸铁(40mmol/L)的培养基呈现Fe(Ⅲ)的颜色(棕黄色)(图 6-A左)，接种1%EZ-1，暗培养24h后，培养基呈现Fe(Ⅱ)颜色(浅绿色)(图 6-A右)，此现象暗示柠檬酸铁中Fe(Ⅲ)被还原。培养24h后培养基中Fe(Ⅱ)含量增加了约20mmol，表明EZ-1可以还原可溶性柠檬酸铁中Fe(Ⅲ)，具备还原可溶性Fe(Ⅲ)的能力。
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| 图 6 柠檬酸铁被还原(A)及含水铁矿和磁铁矿培养基中Fe(Ⅱ)含量培养前后变化情况(B) Figure 6 The Fe(Ⅲ) of ferric citrate wasreduced by Clostridium bifermentans EZ-1 (A); The accumulated Fe(Ⅱ) ofthe medium supplied with ferrihydrite and magnetite (B). Bars representedstandard deviations of the means. Mr: magnetite; Ft: ferrihydrite. |
| 图选项 |
除了可溶性的柠檬酸铁，我们还对EZ-1还原不溶性无定形水铁矿和晶型磁铁矿中Fe(Ⅲ)的还原能力进行了测试。将不同浓度无定形水铁矿和晶型磁铁矿添加到PYG培养基中，用菲啰嗪显色法测定培养前后(24h)培养基中Fe(Ⅱ)含量，随着水铁矿(2.5–10 mmol/L)和磁铁矿(5.0–10.0 mmol/L)浓度的增加，培养基中Fe(Ⅱ)的累积量逐渐增加(图 6-B)，由此说明，EZ-1可以还原无定形水铁矿中和晶型磁铁矿中的Fe(Ⅲ)。当磁铁矿浓度增加到(23.4±0.2)mmol/L时，Fe(Ⅱ)的积累量相比添加10mmol/L磁铁矿并没有增加，反而减少，说明高浓度的磁铁矿抑制了EZ-1的Fe(Ⅲ)还原能力。综上结果表明，EZ-1不仅具有还原可溶性Fe(Ⅲ)的能力，同时还具有异化铁还原能力，能够还原无定形水铁矿和晶型磁铁矿，属于发酵型的异化铁还原菌。
2.5 电化学活性 我们对EZ-1的电化学活性进行了测试，结果如图 7-A所示，EZ-1能够产生电流，15h时电流密度达到最大值6.3mA/m2。此外，电流产生趋势与EZ-1生长曲线相符(图 3-A)。24h后MFC产电结束，添加Ag/AgCl作为参比电极，铂电极作为对电极，构建三电极体系对MFC体系进行循环伏安扫描分析，检测体系中氧化还原特征。设置10 mV/s的扫速在–0.3–0.4 V的电势窗口下扫描，CV结果显示，在0.15V处存在明显的氧化峰(图 7-B)。由此进一步说明，EZ-1具有电化学活性。
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| 图 7 Clostridium bifermentans EZ-1的电化学活性(A)及其氧化还原特征(B) Figure 7 Theelectrochemical activity (A) and redox characters (B) of Clostridium bifermentans EZ-1. |
| 图选项 |
3 讨论 Clostridium 广泛分布在森林、湿地、河口等自然环境中。黄河三角洲作为典型的滨海湿地，是世界上陆-河-海交互作用最活跃的区域之一，蕴含丰富的微生物资源[20]。Xiao等[17]通过高通量数据分析发现，Clostridium 在黄河三角洲滨海湿地分布广泛，同时Zhang等[20]在对黄河三角洲滨海湿地铁还原菌多样性分析过程中发现，Clostridium 为黄河三角洲高盐度植物带(碱蓬、柽柳)原位土壤中的优势铁还原菌。在此基础上，我们通过厌氧分离技术得到了一株多功能梭菌EZ-1，经生理及16SrRNA基因鉴定为 C.bifermentans 。
我们通过代谢物检测分析发现，在检测的几种代谢底物(葡萄糖、蔗糖、木糖、纤维二糖和纤维素)中EZ-1仅可以利用葡萄糖作为底物进行发酵代谢。EZ-1能够以葡萄糖为底物产生氢气及短链挥发性脂肪酸乙酸、丁酸和二氧化碳，1 mol葡萄糖可以产生1.114mol氢气，同时产生1.09mol的乙酸和0.22mol的丁酸。近年来，Clostridium 已广泛用于生物制氢领域的研究，例如 C.butyricum[21]、C .beijerinckii[22]、C.tyrobutyricum[23]和 C. pasteurianum[24]等，且越来越多的 Clostridium 被证实具有产氢能力。目前，已知产氢梭菌利用每摩尔葡萄糖可生成氢气范围约为0.81–3.35mol[6]。相比很多其他产氢菌株，EZ-1利用葡萄糖产氢能力相对较弱，但其具有速率优势，氢气产生延滞期(< 4h)较短。
本研究中分离得到EZ-1经异化铁还原能力检测及电活性检测发现，其不仅具有异化铁还原能力，而且还具有电化学活性，由此说明EZ-1可以进行胞外电子传递，可以将在胞内氧化有机物产生的电子传递到胞外铁氧化物(水铁矿和磁铁矿)和石墨电极表面。目前，以 Geobacter sulfurreducens 和 Shewanellaoneidensis 为代表的革兰氏阴性菌的胞外电子传递机制的研究已经取得了重大进展，然而，革兰氏阳性菌相关研究才刚刚起步。纤毛和细胞色素[25]被认为是革兰氏阴性菌进行胞外电子传递的两大关键细胞组分，且研究发现在部分具有胞外电子传递能力的革兰氏阳性菌中同样存在纤毛和细胞色素[26]。本研究分离得到的EZ-1为革兰氏阳性菌且具有胞外电子传递能力，但扫描电镜图像并未发现纤毛结构。李莹等[27]的研究发现，分离自界河沉积物经富集培养后得到的产甲烷团聚体中，革兰氏阳性菌 Clostridium spp.和 Methanosacina barkeri 为优势菌株，在以乙醇为底物共培养体系下能够互营产甲烷，暗示 Clostridium spp.和 M.barkeri 之间可能存在种间直接电子传递。EZ-1同时具备产氢及胞外电子传递能力，EZ-1的分离纯化为进一步阐明革兰氏阳性菌 Clostridium 与 M.barkeri 互营产甲烷机制提供了可能，同时也可以作为研究革兰氏阳性菌胞外电子传递的候选模式菌株。
将具有胞外电子传递能力的EZ-1接种到MFCs中，有电流产生，最大电流密度可达6.3mA/m2。产电微生物主要通过两种方式将胞内产生的电子传递到胞外电极表面，一种是直接接触，通过具有导电性的纤毛和细胞色素蛋白与电极表面直接接触并形成生物膜，然后将电子直接传递到电极表面；另一种是间接接触，产电微生物可以通过分泌电子穿梭体核黄素(flavin)等[15]将产生的电子转运到电极表面形成电流。相比模式革兰氏阴性产电菌 G. sulfurreducens 的电流输出密度60 mA/m2[28]，EZ-1相对较弱。相比革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁，且其主要成分脂质和肽聚糖都不具有导电性；此外，革兰氏阳性菌细胞壁表面往往会形成荚膜，荚膜的主要成分多糖也不具有导电性，因此，革兰氏阳性菌进行胞外电子传递要比革兰氏阴性菌困难的多，这也是研究革兰氏阳性菌胞外电子传递相对困难的主要原因之一。选用的电极材料，电极的比表面积，电极室的大小，以及有机底物的浓度和不同材料隔膜的使用等因素都会对MFC的内阻产生影响，进而体现在产电性能上[29-30]。优化EZ-1产电条件，提高产电活性还有待进一步的研究。
目前越来越多的具有电活性的革兰氏阳性 Clostridium 被报道，Park等[9]在处理淀粉废水的MFC电池中分离得到一株革兰氏阳性 Clostridium ，C.butyricum EG3，循环伏安扫描发现该菌具有电活性。姜等[10]自森林土壤中分离得到了一株革兰氏阳性 Clostridium，C.sporogenes SE6，接种到MFCs中检测到该菌株可以产生电，最大电压约180mV，且循环伏安扫描显示存在氧化还原物质，且氧化峰的位置(–0.34 V)与含有细胞色素的革兰氏阴性菌 Shewanellaoneidensis 氧化峰位置(–0.36 V)相近，暗示其氧化还原物质为细胞色素[31]。Rodgers等[32]研究发现 C.perfringens 具有Ⅳ型菌毛，而Ⅳ型菌毛被证实具有导电性能，在与Geobacter之间的电子传递过程中发挥了重要功能。然而还没有相关文章报道 C.perfringens 具有电化学活性，且EZ-1、EG3和SE6的扫描电镜图像中均未发现纤毛等细胞表面附着物。除了纤毛外，细胞色素在胞外电子传递同样发挥着重要功能，Clostridium 含有铁氧还蛋白，能在低氧化还原电位下作为电子载体还原细胞色素，这也可能是梭菌能够进行胞外电子传递的原因之一。本研究对接种EZ-1且周期结束的MFCs反应器体系进行循环伏安扫描，结果显示体系中明显存在电化学活性物质。CV扫描结果显示，在0.15V处存在明显的氧化峰，这与已报道的 C.sporogenes (–0.34 V)[32]和 C.butyricum (–0.31 V)[9]的氧化峰的位置相差较远，暗示电活性 Clostridium 具有不同的氧化还原活性物质。
本研究通过厌氧分离技术，分离得到了一株革兰氏阳性菌 Clostridiumbifermentans EZ-1。与以往的菌株相比，该菌株同时具有产氢、产电和异化铁能力，这为研究生物产氢和革兰氏阳性菌胞外电子传递机制提供了新的选择。
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