江民华1,3, 林厚民1, 尹金阳1, 王子龙1, 庞浩2, 黄日波1, 杜丽琴1
1.广西大学生命科学与技术学院, 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西 南宁 530005;
2.国家非粮生物质能源工程技术研究中心, 广西生物科学与技术研究中心, 广西科学院, 广西 南宁 530007;
3.广东溢多利生物科技股份有限公司, 广东 珠海 519060
收稿日期：2016-06-21；修回日期：2016-11-02；网络出版日期：2016-11-15
基金项目：国家自然科学基金（31360369，21366007）；广西自然科学基金（2014GXNSFAA118097，2014GXNSFAA118078）；广西主席基金[桂财教函（2015）284号]
*通信作者：杜丽琴, Tel:+86-771-3235706;E-mail:duliqin@gxu.edu.cn
摘要： [目的]筛选鉴定1株产β-葡萄糖苷酶的菌株，克隆、表达该菌株中的β-葡萄糖苷酶基因，研究重组酶的酶学性质并进行分子改造。[方法]在自然界中采集土样，筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株，对野生菌进行16S rDNA鉴定，比对分析GenBank数据库中与野生菌同属的β-葡萄糖苷酶基因序列，设计简并引物PCR扩增基因保守区；设计引物扩增目的基因，以pQE30为表达载体构建重组质粒，转化至大肠杆菌中进行诱导表达；采用镍亲和层析对重组酶进行纯化，研究其酶学性质；采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对野生型β-葡萄糖苷酶进行分子改造。[结果]一个来自于差异柠檬酸杆菌GXW-1的β-葡萄糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶CBGL的最适温度为45℃，最适pH为6.0，Vmax值是（0.1704±0.0073）μmol/（mg·min），Kcat值为（0.2380±0.0102）/s。CBGL能水解α-pNPG、甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。对野生酶进行分子改造，获得Vmax是野生酶2.54倍的突变体W147F。[结论]CBGL不仅具有β-1，4-糖苷键水解能力，还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。此外，CBGL还能够水解天然底物甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。
关键词： 差异柠檬酸杆菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶 酶学性质 酶分子改造
Characterization and molecular modification of β-glucosidase from Citrobacter koser GXW-1
Minhua Jiang1,3, Houmin Lin1, Jinyang Yin1, Zilong Wang1, Hao Pang2, Ribo Huang1, Liqin Du1
1.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China;
2.National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery, Guangxi Bio-science and Technology Research Center, Guangxi Academy of Science, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China;
3.Guangdong VTR BIO-TECH Co., Ltd., Zhuhai 519060, Guangdong Province, China
Received 21 June 2016; Revised 02 November 2016; Published online 15 November 2016
*Corresponding author: Liqin Du, Tel:+86-771-3235706;E-mail:duliqin@gxu.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31360369, 21366007), by the Natural Science Foundation of Guangxi province (2014GXNSFAA118097, 2014GXNSFAA118078) and by the Chairman Fund Project of Guangxi province [(2015)284]
Abstract: [Objective]The aim of this study was to characterize β-glucosidase from Citrobacter koser GXW-1 isolated from soil and to improve the enzyme by molecular modification.[Methods]A bacterial strain with β-glucosidase activity was screened from the soil around Wuming sugar mill in Guangxi by esculin-ferric ammonium citrate selecting plate. The 16S rDNA of the strain was obtained and analyzed. By searching GenBank database, the genes encoding β-glucosidase from the same genus Citrobacter were found. These sequences were aligned. Then, a gene encoding β-glucosidase was amplified by PCR. The recombinant plasmid pQE-cbgl was constructed. The recombinant protein was purified with Ni-NTA. The enzyme properties of the recombinant protein CBGL were studied in detail. At last, the wild enzyme CBGL was reformed by error-prone PCR and site-directed random mutagenesis.[Results]C. koser GXW-1 with β-glucosidase activity was isolated from the soil. A gene encoding β-glucosidase was cloned from the wild strain GXW-1. The properties of CBGL were identified. Its optimal pH and temperature were 6.0 and 45℃. Its Km and Vmax value were (11.280±1.073) mmol/L and (0.1704±0.0073) μmol/(mg·min), respectively. Its Ki values was (66.84±3.40) mmol/L. CBGL can hydrolyze α-pNPG, stevioside, daidzin and genistin. CBGL was modified by error-prone PCR and site directed random mutagenesis. A positive mutant W147F was obtained successfully. Its Vmax was 2.54 times that of the wild enzyme CBGL.[Conclusion]CBGL not only can hydrolyze β-glycosidic bond, but also can hydrolyze the α-glycosidic bond in α-pNPG. Furthermore, CBGL can hydrolyze stevioside, daidzin and genistin. These characteristics indicate that the β-glucosidase CBGL has important applications in theoretical research and in industry.
Key words: Citrobacter koser GXW-1 β-glucosidase enzyme properties molecular modification
β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶，可将β-葡萄糖苷键的非还原端水解，释放出糖基配体和β-D-葡萄糖。β-葡萄糖苷酶对纤维素的彻底降解起着至关重要的作用，β-葡萄糖苷酶来源广泛，包括微生物、植物和动物等。植物的β-葡萄糖苷酶活性较高，最适催化温度相对较高，在工业生产中得到更多的应用；原核生物的β-葡萄糖苷酶多被运用于科学研究，该类β-葡萄糖苷酶易于获得，但是酶活性普遍偏低[1]。
β-葡萄糖苷酶具有广泛的应用价值。在能源方面，可参与生物质的降解，用于制备纤维素乙醇燃料[2]，纤维素是由多个葡萄糖分子以β-1, 4-糖苷键联结成的多糖类物质，它的彻底降解需要多种酶相互作用，β-葡萄糖苷酶是纤维素最终彻底降解为葡萄糖所必需的一个关键酶，人为添加高活性的β-葡萄糖苷酶可有效提高纤维素的降解效率[3]，使纤维素乙醇燃料的得率提高；食品方面，β-葡萄糖苷酶可用于果酒增香、脱苦，提高茶叶香味等[4]；医药方面，β-葡萄糖苷酶可用于生产大豆异黄酮苷元[5]和甜茶苷[6]等；另外，β-葡萄糖苷酶底物特异性[7]、转糖苷功能[8]和葡萄糖耐受性[9]等也备受关注。深入了解β-葡萄糖苷酶的性质，挖掘其潜在的应用价值对现实有重要的指导意义。
本研究利用选择平板从广西武鸣糖厂周围的土壤中筛选到1株产β-葡萄糖苷酶的菌株，然后通过16S rDNA序列分析对筛选到的菌株进行鉴定。对GenBank数据库中来自同属的β-葡萄糖苷酶基因进行比对分析，设计简并引物扩增得到菌株中的目标β-葡萄糖苷酶基因。然后，在大肠杆菌中进行克隆和表达，研究重组酶的酶学性质。最后，结合易错PCR和定点随机突变对目的β-葡萄糖苷酶进行分子改造。
1 材料和方法 1.1 菌株 差异柠檬酸杆菌 (Citrobacter koser) GXW-1由本研究筛选所得，大肠杆菌 (Escherichia coli) XL1-blue购自TaKaRa公司，大肠杆菌 (Escherichia coli) M15、质粒pQE30购自Qiagen公司。
1.2 材料 本研究所用PCR扩增聚合酶、限制性内切酶以及DNA连接酶等均购自大连TaKaRa公司；Ni-NTA购自Qiagen公司；BioSpin PCR Purification Kit、BioSpin Gel Extraction Kit、BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit等购自BioFlux公司；pNPG及各对硝基苯基底物等均购自Sigma公司；二糖和多糖及其它试剂均为国产分析纯。
1.3 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及系统发育分析 在广西武鸣糖厂周围采集土样，利用七叶苷-柠檬酸铁铵选择平板筛选产β-葡萄糖苷酶的菌株。根据文献已经报道的16S rDNA基因的保守序列合成引物[10]，PCR扩增菌株GXW-1的16S rDNA。PCR的反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物连接至载体pMD19-T，转化到大肠杆菌中，送去北京华大基因研究中心进行测序。使用生物软件MAGA 5.0 (Molecular evolutionary genetics analysis) 对16S rDNA序列进行分析并建立进化树。
1.4 GXW-1 β-葡萄糖苷酶基因保守区序列的扩增 于GenBank数据库中查找与差异柠檬酸杆菌同属的β-葡萄糖苷酶基因，分析它们所编码的蛋白质的结构组件，根据蛋白质结构组件的不同进行分类，用生物软件VECTOR NTI Advance 11.5对基因序列进行比对分析，查找同源区并最终设计简并引物：上游引物C-1：5′-CCGAAAGAAGCC ATCCGNGAGATGAT-3′，下游引物C-2：5′-ATCGG GAAGCTNACGGTCTG-3′。PCR的反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增出的DNA片段连接至载体pMD19-T，转化到大肠杆菌中，进行测序。使用生物软件Vector NTI Advance 11.5对DNA序列进行分析，于NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中对序列进行Blast比对分析。
1.5 GXW-1 β-葡萄糖苷酶基因的扩增 根据保守区的比对分析结果，设计引物PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因cbgl：上游引物cbgl-1：5′-ATAGGATCCGAAGCGTTGTCTGGCAACCATCCGC-3′ (引入BamHⅠ酶切位点)，下游引物cbgl-2：5′-GCGAAGCTTCTACTACAGCAGTTCAAACTCGCCCTGC-3′ (引入Hind Ⅲ酶切位点)。PCR反应程序同1.4。扩增的目的片段经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，与经BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切的表达载体pQE30连接，转化到大肠杆菌菌株XL1-blue中，进行测序。将成功构建的重组质粒命名为pQE-cbgl。
1.6 重组酶CBGL的诱导表达和纯化 将重组质粒pQE-cbgl转化到大肠杆菌M15中，37 ℃培养至OD600约为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.3 mmol/L，同时添加山梨醇 (终浓度为100 mmol/L)、甜菜碱 (终浓度为2.5 mmol/L)，摸索诱导表达条件。在最佳诱导表达条件下培养菌体，超声波破胞后镍亲和层析Ni-NTA纯化重组酶CBGL。对纯化的重组酶CBGL进行变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 (SDS-PAGE) 和酶谱分析 (native-PAGE：一部分用七叶苷-柠檬酸铁铵进行活性染色，另一部分用考马斯亮蓝R-250染液进行染色)。
1.7 重组酶CBGL酶学性质的研究 β-葡萄糖苷酶酶活力单位 (U) 的定义：在酶的最适反应条件下，每1 min水解pNPG释放1 μmol pNP所需的酶量。
CBGL酶活测定方法：取14 μL 25 mmol/L pNPG (终浓度为2.5 mmol/L) 与最适的116 μL 0.2 mol/L磷酸氢二钠-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液混合，最适反应温度下预热5 min，加入10 μL已稀释适当倍数的酶，反应20 min，用70 μL 0.4 mol/L Na2CO3溶液对反应进行终止。取200 μL反应液至酶标板，于酶标仪读取其OD410。
以牛血清白蛋白为标准品，参照Bradford法[11]来测定纯化的蛋白质浓度。
所有实验均做3个平行实验。
1.8 CBGL的分子改造 采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对CBGL进行分子改造。
易错PCR：所用引物为cbgl-1和cbgl-2，Mg2+和Mn2+的终浓度分别为0.70 mmol/L和0.05 mmol/L，反应程序如1.4，Tm值为52.5 ℃。
定点随机突变引物如下。W147-f：5′-AACATG ACCNNNGCGCCGATGGTG-3′；W147-r：5′-GGTC ATGTTCAGGCCATCGTCAGC-3′；D557-f：5′-GAT CAGCAGGCTNNNGCCATTCTG-3′；D557-r：5′-G GTTTCCAGAATGGCNNNAGCCT-3′。
参照1.6中的方法对突变体进行诱导表达和纯化，参照1.7中的方法测定突变体的酶学性质。
1.9 基因的核苷酸序列号 将来自差异柠檬酸杆菌 (C. koser) GXW-1基因cbgl的核苷酸序列上传到GenBank数据库中，得到基因的序列号为KX 394622。
2 结果和讨论 2.1 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及系统发育分析 根据1.3中的方法利用七叶苷-柠檬酸铁铵选择平板筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株GXW-1(图 1-A)，以菌株GXW-1的基因组DNA为模板，PCR扩增出16S rDNA序列，其大小约1.5 kb。将测序结果于NCBI中进行Blastn比对，菌株GXW-1与Citrobacter koser的16S rDNA基因序列相似性达99%，并将GXW-1与亲缘关系最近的19个菌株建立进化树 (图 1-B)，结果显示GXW-1与Citrobacter koser ATCC BAA-895亲缘关系最近，鉴定菌株GXW-1属于Citrobacter koser，将其命名为差异柠檬酸杆菌GXW-1。
 |
| 图 1. 菌株GXW-1的筛选及其16S rDNA进化树分析 Figure 1. Strain GXW-1 and the phylogenetic analysis of 16S rDNA of GXW-1. A: strain GXW-1; B: the phylogenetic analysis of 16S rDNA of GXW-1. Phylogenetic tree was inferred using the Neighbor-Joining method in MEGA 5.2. The GenBank accession numbers are given in parentheses; numbers at branching points are bootstrap values. Bar, 0.002 substitutions per nucleotide position. |
| 图选项 |
2.2 GXW-1 β-葡萄糖苷酶cbgl保守区和cbgl的扩增 利用引物C-1和C-2扩增基因的保守区，保守区大小约为2.0 kb。将测序结果于NCBI中进行Blastx比对分析，发现它与Citrobacter koser ATCC BAA-895的一个假定蛋白同源性最高，约99%。
利用引物cbgl-1和cbgl-2 PCR扩增出目的基因，获得大小约为2.3 kb的DNA条带。对测序结果分析发现成功克隆到1个β-葡萄糖苷酶基因，命名为cbgl。cbgl基因大小为2298 bp，预计蛋白分子量约为83 kDa，将cbgl所编码的蛋白质命名为CBGL。对cbgl编码的氨基酸序列进行SMART分析，发现CBGL含典型的GH3家族功能域。
2.3 重组蛋白CBGL的诱导表达和纯化 将重组质粒pQE-cbgl转入大肠杆菌M15中进行诱导表达，镍亲和层析纯化目的蛋白CBGL。对纯化产物进行SDS-PAGE分析，发现在约83 kDa处有明显的蛋白质特征性条带 (图 2-A)，其分子量与理论分子量一致。对CBGL进行酶谱分析，经七叶苷-柠檬酸铁铵活性染色后，在相应的位置出现了明显的黑色条带 (图 2-B)，说明纯化到的CBGL具有β-葡萄糖苷酶活性。
 |
| 图 2. 重组蛋白CBGL的SDS-PAGE和Native-PAGE分析 Figure 2. SDS-PAGE and native-PAGE analysis of recombinant protein CBGL. A: SDS-PAGE of recombinant protein CBGL. M: protein marker; lane 1: E. coli M15 with pQE30; lane 2: recombinant E. coli M15 with pQE-cbgl; lane 3: purified protein CBGL. B: Native-PAGE of purified CBGL. lane 1-3: CBGL stained with coomassie brilliant blue; lane 4-6: CBGL stained with 0.2% esculin-0.5% ferric ammonium citrate. |
| 图选项 |
2.4 重组蛋白CBGL的酶学性质研究
2.4.1 温度和pH对CBGL的影响: 在pH 7.0条件下，测定CBGL在不同温度 (30、35、40、45、50、55 ℃) 下的酶活力，其最适温度为45 ℃，在40-50 ℃之间保留50%以上的活力，当温度上升到55 ℃时活性急剧下降 (图 3-A)。纯酶分别于20、25、30、35、40、45 ℃中保温1 h后，最适反应条件下测定CBGL的残余活力，并以在4 ℃保存的重组酶的酶活为对照，在20-40 ℃之间，CBGL保持有60%以上的活力 (图 3-B)，当温度在40 ℃以上，其酶活急剧下降。β-葡萄糖苷酶的最适温度大多分布在40-110 ℃之间[12]。CBGL的热稳定性较差，酶的热稳定性与酶蛋白本身的特性相关，不同酶之间具有明显的差异。如来源于Neosartorya fischeri P1的β-葡萄糖苷酶NfBGL与CBGL的热稳定性相似，NfBGL的最适温度为80 ℃，但在80 ℃保温1 h后，残余活性小于原始酶活的20%[13]。:
 |
| 图 3. 温度和pH对重组蛋白CBGL活性的影响 Figure 3. Effect of temperature and pH on recombinant enzyme activity. A: effect of temperature on CBGL enzyme activity; B: thermal stability of CBGL; C: effect of pH on CBGL enzyme activity; D: pH stability of CBGL. |
| 图选项 |
在最适温度下，测定CBGL在不同pH (4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5) 条件下的酶活力，其最适pH为6.0，在ph 5.0-7.0之间保留50%以上的活力，当pH在5.0以下和7.0以上酶活性急剧下降 (图 3-C)。纯酶分别保存于不同的pH (3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0) 缓冲液中12 h后，最适反应条件下测定CBGL的残余酶活，CBGL基本都能保持80%以上的活力 (图 3-D)，CBGL的pH稳定性较好。虽然大部分β-葡萄糖苷酶的最适pH大多在3.5到6.5之间，可是它们都具有良好的酸碱耐受性[12]。:
2.4.2 CBGL的Km和Vmax测定: 将CBGL与一系列不同浓度的pNPG (浓度为2.5 mmol/L至22.5 mmol/L) 进行反应，利用GraphPad Prism软件计算出CBGL的Km和Vmax值。反应结果具有典型的米氏动力学特性 (图 4)。CBGL的Km值为 (11.280±1.073) mmol/L、Vmax值是 (0.1704±0.0073) μmol/(mg·min)，Kcat值为 (0.2380±0.0102)/s。:
 |
| 图 4. 重组酶CBGL的Km和Vmax值 Figure 4. Km and Vmax values of recombinant CBGL. |
| 图选项 |
2.4.3 CBGL的葡萄糖耐受性和葡萄糖抑制常数Ki值的测定: 测定不同浓度 (0-30 mmol/L) 的葡萄糖对CBGL活力的影响。葡萄糖浓度在5-25 mmol/L之间，CBGL基本都能保持60%以上的活力，随着葡萄糖浓度增加，其活力逐渐下降 (图 5-A)。参考KM, APP[14]法，在反应体系中分别添加不同浓度 (0、20、35 mmol/L) 的葡萄糖，测定在不同浓度的pNPG下CBGL的酶活力 (图 5-B)，利用GraphPad Prism软件计算出CBGL的Ki值为 (66.84±3.40) mmol/L。:
 |
| 图 5. CBGL的葡萄糖耐受性和葡萄糖抑制常数Ki的测定 Figure 5. Glucose tolerance and glucose inhibition constant Ki of CBGL. Each data point represents the mean±SD of three independent experiments. |
| 图选项 |
近年来发现对葡萄糖耐受性较好的β-葡萄糖苷酶大多来源于真菌，但目前为止，对于β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性的结构理论尚不明确，然而通过结构比对分析发现，一般情况下GH3家族的β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性较差[15]，Ki值一般在0.1-100.0 mmol/L[16]，本研究表达的CBGL的Ki值大小与GH3家族β-葡萄糖苷酶的普遍现象相符。:
2.4.4 CBGL底物特异性的测定: 分别以终浓度为2.5 mmol/L的人工底物 (α-pNPG、pNP-galac、pNPX、oNPG、pNPA) 和1% (w/v) 的二糖和多糖 (纤维二糖、乳糖、水杨苷、苦杏仁苷、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖、木聚糖、羧甲基纤维素 (CMC)) 为底物，检测CBGL对它们的水解能力。CBGL除了能水解pNPG外，还能水解人工底物α-pNPG，其相对活力是pNPG的22%，说明CBGL不仅对β-1, 4-糖苷键有水解能力，还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。而CBGL对pNP-galac、pNPX、oNPG、pNPA及二糖和多糖没有表现出水解活性 (表 1)。: 表 1. CBGL的底物特异性分析 Table 1. Analysis of the CBGL on substrates specificity
| substrates | V/[μmol/(mg·min)] | relative activity |
| Artificial substrates | ||
| pNPG | 0.027150 | 100% |
| α-pNPG | 0.005973 | 22% |
| pNP-galac/pNPX/ oNPG/pNPA | - | - |
| Disaccharide | ||
| Cellobiose | - | - |
| Lactose | - | - |
| Salicin | - | - |
| Amygdalin | - | - |
| Sucrose | - | - |
| Maltose | - | - |
| Isomaltose | - | - |
| Trehalose | - | - |
| polysaccharide | ||
| Xylan | - | - |
| CMC | - | - |
| soluble starch | - | - |
| -: the substrate can’t be hydrolyzed. | ||
表选项
CBGL是目前研究中较为少见的能同时水解β-糖苷键、α-糖苷键的β-葡萄糖苷酶。2015年，Justo等[17]从Caulobacter crescentus中克隆到1个比较少见的兼具β-葡萄糖苷酶[Vmax为 (0.041±0.002)μmol/(mg·min)]、β-木糖苷酶[Vmax为 (0.055±0.002)μmol/(mg·min)) 和α-阿拉伯糖苷酶[Vmax为 (0.0910±0.0004)μmol/(mg·min)] 3种酶活的多功能酶，是较为少见的能同时水解β-糖苷键、α-糖苷键的β-葡萄糖苷酶，但该酶和CBGL一样都是酶活普遍偏低。: 分别以终浓度为1%的瑞鲍迪苷A、甜菊苷、甜茶苷、甜菊双糖苷为底物，加入纯酶于最适条件下反应12 h，对水解产物进行HPLC分析，研究了CBGL对甜菊糖苷类底物的水解活性。: CBGL能够将甜菊苷部分水解，生成甜茶苷 (图 6-C)。目前已报道能水解甜菊糖苷的β-葡萄糖苷酶有5个，分别为来自Clavibacter michiganense的CMGase[18]、来自Flavobacterium johnsoniae的FJGase[19]、来自Aspergillus aculeatus的SSGase[20]、来自Penicillium decumbens的SPGase[21]及来自Streptomyces sp. GXT6的BGL1[6]，它们对甜菊苷都具有水解活性，主要区别就是能否水解C-19的糖酯键和C-13位的糖苷键及水解C-19糖酯键和C-13位糖苷键的先后顺序的不同，其中，CMGase能够水解甜菊苷、甜茶苷和甜菊单糖酯C-19位的葡萄糖酯键；FJGase的底物特异性与CMGase相似，能够水解甜菊苷、甜茶苷和甜菊单糖酯C-19位的葡萄糖酯键；SPGase可以催化水解包括甜菊苷、甜茶苷、甜菊单糖苷和甜菊单糖酯在内的所有与甜菊醇相连的葡萄糖苷键和葡萄糖酯键，是唯一一个能够独立完成甜菊苷水解来生产甜菊醇的酶；SSGase能够水解甜菊苷和甜茶苷C-13位的糖苷键；BGL1能水解甜菊苷和甜菊双糖苷C-13位的糖苷键。本研究表达的β-葡萄糖苷酶CBGL只能水解甜菊苷C-13位上的糖苷键，生成甜茶苷。CBGL虽然能将甜菊苷部分水解，但活性较低，目前已报道对甜菊苷催化效率较高的β-葡萄糖苷酶分别来自S. sp. GXT6和A. aculeatus，Kcat/Km分别为9.0 L/(mmol·s) 和8.5 L/(mmol·s)。:
 |
| 图 6. 甜菊苷水解产物的HPLC分析 Figure 6. HPLC analysis of the products from stevioside hydrolysis. A: standard stevioside; B: standard rubusoside; C: hydrolysis reaction of stevioside (12 h). |
| 图选项 |
分别以终浓度为500 μg/μL底物的黄豆苷、染料木苷为底物，加入纯酶于最适反应条件下反应1 h或12 h，然后对水解产物进行HPLC分析，研究了CBGL对大豆异黄酮中主要成份黄豆苷和染料木苷的水解活性。: CBGL作用黄豆苷1 h，有部分黄豆苷水解生成黄豆苷元 (图 7-B)，随着反应时间的延长至12 h，黄豆苷完全被水解为黄豆苷元 (图 7-C)；CBGL在对染料木苷作用了12 h后只能部分水解染料木苷，生成染料木素 (图 7-D)。大豆异黄酮在大豆等中主要以糖苷形式存在，但其苷元形式更易于人体吸收。β-葡萄糖苷酶可水解大豆异黄酮，释放出游离的大豆异黄酮苷元，这些游离的苷元可被小肠壁吸收，提高机体对大豆异黄酮的吸收率，大豆异黄酮的结构和雌激素的结构非常相似，摄入适量的大豆异黄酮可以减少心血管疾病、骨质疏松和高胆固醇等[22]的发病率。Novosphingobium sp. GX9[5]、Bifidobacterium animalis ssp. lactis Bb12[23]、Lactobacillus casei 2607[23]、Lactobacillus acidophilus ATCC4461[23]的β-葡萄糖苷酶都可将糖苷形式的大豆异黄酮水解，生成具有生物活性的大豆异黄酮苷元，目前已报道的来自Novosphingobium sp. GX9的β-葡萄糖苷酶对黄豆苷具有最高的催化效率；而对染料木苷具有高催化效率的β-葡萄糖苷酶有来自Dalbergia nigrescens、Pyrococcus furiosus、Novosphingobium sp. GX9菌株，它们的Kcat/Km都在10000 L/(mmol·s) 以上[5]。:
 |
| 图 7. 黄豆苷和染料木苷水解产物的HPLC分析 Figure 7. HPLC analysis of the products from hydrolysis of daidzin and genistin. A: 1: standard daidzin, 2: standard genistin, 3: standard daidzein, 4: standard genistein; B: hydrolysis product of daidzin (1 h); C: hydrolysis product of daidzin (12 h); D: hydrolysis product of genistin (12 h). |
| 图选项 |
甜茶苷、黄豆苷元和染料木素在食品、医药行业具有广泛的应用，CBGL能够水解甜菊苷、黄豆苷和染料木苷，这些特性使其在工业上具有广泛的应用前景。: 2.5 CBGL的分子改造 本研究首先采用易错PCR对CBGL进行分子改造，构建了包含约10000个转化子的突变体库，但在突变体库中没有筛选到酶活提高的突变体。于是利用SWISS-MODEL网站以3U48 (PDB-ID，sequence identity 49.1%) 为模板对CBGL的蛋白结构进行建模分析 (图 8)，结合McAndrew等[24]和Zhao等[25]报导的GH3家族的β-葡萄糖苷酶蛋白结构，对突变体库中酶活降低 (W147L、D557E) 和完全失去酶活 (E209R、D218E) 的单位点突变体进行相应氨基酸位点的分析。建模结果发现：147位点的氨基酸位于CBGL活性中心位点附近；209、218位点的氨基酸位于蛋白结构内部且位于酶与底物对接处附近，推测209、218位点的氨基酸相对保守；557位点的氨基酸位于蛋白表面，推测该位点氨基酸的电荷性对CBGL的酶活有一定的影响。故结合随机突变获得的突变体，选取了147和557这2个位点的氨基酸来进行第2次定点随机突变改造。
 |
| 图 8. CBGL的蛋白质建模分析图 Figure 8. The 3D model analysis of CBGL. |
| 图选项 |
对这2个位点的氨基酸进行定点随机突变，筛选到了4个有活性的突变体W147A、W147F、D557H和D557W，对它们分别进行诱导表达和纯化，测定它们的酶学性质，它们的最适温度和最适pH与重组酶CBGL一致，分别为45 ℃和pH 6.0。其中W147F的相对活力提高至185%，故进一步测定其Km和Vmax值 (图 9)。
 |
| 图 9. 突变子W147F的Km和Vmax值的测定 Figure 9. Km values and Vmax of W147F. |
| 图选项 |
W147F的Km值为 (18.810±1.247) mmol/L，Vmax值为 (0.43220±0.01844)μmol/(mg·min)，Kcat值为 (0.6036±0.0258)/s，其Vmax是重组酶CBGL的2.54倍。该突变体147位的Trp突变为Phe，Trp和Phe结构相似，但Trp有吲哚环，空间位阻比苯环大，且147位点位于活性中心附近，当由空间位阻较大的Trp突变为空间位阻较小的Phe时，底物与酶更易于结合，从而使酶的活性提高。
3 结论 本研究利用七叶苷-柠檬酸铁铵选择平板从广西武鸣糖厂周围的土壤中筛选到1株产β-葡萄糖苷酶的菌株，经16S rDNA序列分析，鉴定为Citrobacter koser，命名为差异柠檬酸杆菌 (Citrobacter koser) GXW-1。通过设计简并引物PCR扩增获得β-葡萄糖苷酶基因cbgl，其核苷酸序列长度为2298 bp，编码765个氨基酸。以pQE30为表达载体在E. coli M15中表达基因，表达蛋白CBGL的分子量为83 kDa，用镍亲和层析纯化重组酶，测定纯化酶的酶学性质。CBGL的最适pH和温度分别为6.0和45 ℃，Km值为 (11.280±1.073) mmol/L，Kcat值为 (0.2380±0.0102)/s，Ki值为 (66.84±3.40) mmol/L；对CBGL的底物特异性进行了研究，发现CBGL除了是目前较为少见的可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性的β-葡萄糖苷酶外，还能够水解甜菊苷、黄豆苷和染料木苷烯萜类化合物。另外，通过易错PCR结合定点随机突变对它进行分子改造，筛选到一个正向突变体W147F，其Vmax是野生酶的2.54倍。CBGL的这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及工业中有重要的应用价值。
参考文献
| [1] | Liu Z, Zhu QX, Shi XA, Peng YH, Chen YN. Development in molecular modification of β-glucosidase in vitro.Journal of Fuzhou University (Natural Science Edition), 2015, 43(4): 565–571(in Chinese).刘震, 朱秋享, 石贤爱, 彭永辉, 陈荫楠. β-葡萄糖苷酶体外分子改造研究进展.福州大学学报 (自然科学版), 2015, 43(4): 565–571. |
| [2] | Gírio FM, Fonseca C, Carvalheiro F, Duarte LC, Marques S, Bogel-?ukasik R. Hemicelluloses for fuel ethanol:a review.Bioresource Technology, 2010, 101(13): 4775–4800DOI:10.1016/j.biortech.2010.01.088. |
| [3] | Lynd LR, Laser MS, Bransby D, Dale BE, Davison B, Hamilton R, Himmel M, Keller M, Mcmillan JD, Sheehan J, Wyman CE. How biotech can transform biofuels.Nature Biotechnology, 2008, 26(2): 169–172DOI:10.1038/nbt0208-169. |
| [4] | Su EZ, Xia T, Gao LP, Dai QY, Zhang ZZ. Immobilization of β-glucosidase and its aroma-increasing effect on tea beverage.Food and Bioproducts Processing, 2010, 88(2/3): 83–89. |
| [5] | Du LQ, Wang ZL, Zhao YL, Huang JQ, Pang H, Wei YT, Lin LH, Huang RB. A β-glucosidase from Novosphingobium sp. GX9 with high catalytic efficiency toward isoflavonoid glycoside hydrolysis and (+)-catechin transglycosylation.Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(16): 7069–7079DOI:10.1007/s00253-014-5661-3. |
| [6] | Wang ZL, Wang JP, Jiang MH, Wei YT, Pang H, Wei H, Huang RB, Du LQ. Selective production of rubusoside from stevioside by using the sophorose activity of β-glucosidase from Streptomyces sp. GXT6.Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(22): 9663–9674DOI:10.1007/s00253-015-6802-z. |
| [7] | Yang SQ, Hua CW, Yan QJ, Li YN, Jiang ZQ. Biochemical properties of a novel glycoside hydrolase family 1β-glucosidase (PtBglu1) from Paecilomyces thermophila expressed in Pichia pastoris.Carbohydrate Polymers, 2013, 92(1): 784–791DOI:10.1016/j.carbpol.2012.09.086. |
| [8] | Mallek-Fakhfakh H, Belghith H. Physicochemical properties of thermotolerant extracellular β-glucosidase from Talaromyces thermophilus and enzymatic synthesis of cello-oligosaccharides.Carbohydrate Research, 2016, 419: 41–50DOI:10.1016/j.carres.2015.10.014. |
| [9] | Uchiyama T, Yaoi K, Miyazaki K. Glucose-tolerant β-glucosidase retrieved from a Kusaya gravy metagenome.Frontiers Microbiology, 2015, 6: 548. |
| [10] | Medlin L, Elwood HJ, Stickel S, Sogin ML. The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions.Gene, 1988, 71(2): 491–499DOI:10.1016/0378-1119(88)90066-2. |
| [11] | Bradford BM. A rapid and sensitive method for the quantifi-cation of microgram quantities of proteins utilizing the principles of protein dye binding.Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248–254DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3. |
| [12] | Pan LH, Luo JP. Advance in research and application of β-D-glucosidase.Food Science, 2006, 27(12): 803–807(in Chinese).潘利华, 罗建平. β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展.食品科学, 2006, 27(12): 803–807. |
| [13] | Yang XZ, Ma R, Shi PJ, Huang HQ, Bai YG, Wang YR, Yang PL, Fan YL, Yao B. Molecular characterization of a highly-active thermophilic β-glucosidase from Neosartorya fischeri P1 and its application in the hydrolysis of soybean isoflavone glycosides.PLoS One, 2014, 9(9). |
| [14] | Kakkar T, Boxenbaum H, Mayersohn M. Estimation of Ki in a competitive enzyme-inhibition model:comparisons among three methods of data analysis.Drug Metabolism and Disposition, 1999, 27(6): 756–762. |
| [15] | de Giuseppe PO, de Arruda Campos Brasil Souza T, Souza FHM, Zanphorlin LM, Machado CB, Ward RJ, Jorge JA, dos Prazeres Melo Furriel R, Murakami MT. Structural basis for glucose tolerance in GH1β-glucosidases.Acta Crystallographica Section D, 2014, 70(6): 1631–1639DOI:10.1107/S1399004714006920. |
| [16] | Huo YL. Cloning, expression, characterization and molecular modification of β-glucosidase from Paenibacillus cookii GX-4. Guangxi University Master Degree Thesis, 2013. (in Chinese) 霍云龙. Paenibacillus cookii GX-4的β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达、酶学性质研究与分子改造. 广西大学硕士学位论文, 2013. |
| [17] | Justo PI, Corrêa JM, Maller A, Kadowaki MK, da Concei??o-Silva JL, Gandra RF, de Cássia Garcia Sim?o R. Analysis of the xynB5 gene encoding a multifunctional GH3-BglX β-glucosidase-β-xylosidase-α-arabinosidase member in Caulobacter crescentus.Antonie Van Leeuwenhoek, 2015, 108(4): 993–1007DOI:10.1007/s10482-015-0552-x. |
| [18] | Nakazawa H, Okada K, Onodera T, Ogasawara W, Okada H, Morikawa Y. Directed evolution of endoglucanase Ⅲ (Cel12A) from Trichoderma reesei.Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 83(4): 649–657DOI:10.1007/s00253-009-1901-3. |
| [19] | Okamoto K, Nakano H, Yatake T, Kiso T, Kitahata S. Purification and some properties of a β-glucosidase from Flavobacterium johnsonae.Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2000, 64(2): 333–340. |
| [20] | Ko JA, Kim YM, Ryu YB, Jeong HJ, Park TS, Park SJ, Wee YJ, Kim JS, Kim D, Lee WS. Mass production of rubusoside using a novel stevioside-specific β-glucosidase from Aspergillus aculeatus.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(24): 6210–6216DOI:10.1021/jf300531e. |
| [21] | Ko JA, Ryu YB, Kwon HJ, Jeong HJ, Park SJ, Kim CY, Wee YJ, Kim D, Lee WS, Kim YM. Characterization of a novel steviol-producing β-glucosidase from Penicillium decumbens and optimal production of the steviol.Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(18): 8151–8161DOI:10.1007/s00253-013-4883-0. |
| [22] | Lamartiniere CA. Protection against breast cancer with genistein:a component of soy.The American Journal of Clinical Nutrition, 2000, 71(S6): 1705S–1707S. |
| [23] | Otieno DO, Shah NP. A comparison of changes in the transformation of isoflavones in soymilk using varying concentrations of exogenous and probiotic-derived endogenous β-glucosidases.Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(3): 601–612DOI:10.1111/jam.2007.103.issue-3. |
| [24] | McAndrew RP, Park JI, Heins RA, Reindl W, Friedland GD, D'haeseleer P, Northen T, Sale KL, Simmons BA, Adams PD. From soil to structure, a novel dimeric β-glucosidase belonging to glycoside hydrolase family 3 isolated from compost using metagenomic analysis.The Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(21): 14985–14992DOI:10.1074/jbc.M113.458356. |
| [25] | Zhao JQ, Guo C, Tian CG, Ma YH. Heterologous expression and characterization of a GH3 beta-glucosidase from Thermophilic Fungi myceliophthora thermophila in Pichia pastoris.Applied Biochemistry and Biotechnology, 2015, 177(2): 511–527DOI:10.1007/s12010-015-1759-z. |
