, 李大鹏
, 王慧利, 朱企, 黄勇苏州科技大学环境科学与工程学院, 苏州 215009
收稿日期: 2020-11-23; 修回日期: 2020-12-26; 录用日期: 2020-12-26
基金项目: 国家自然科学基金（No.51778393）
作者简介: 赵哲豪(1996—), 男, E-mail: zhaozh1996@foxmail.com
通讯作者（责任作者）: 李大鹏, E-mail: ustsldp@163.com
摘要：为了评估生物炭对镉的固定能力, 以负载镉生物炭为研究对象, 构建大型水蚤(Daphnia magna)-斑马鱼(Zebrafish)的简单食物链, 试验周期包括14 d的积累期和7 d的净化期.通过描述鱼群实验(Shoaling)、社会偏好实验(Social Preference)行为变化及斑马鱼中镉的富集量来评估负载镉生物炭的生物毒性.结果表明, 在积累期摄入负载镉生物炭会显著抑制斑马鱼的运动能力, 而摄入未负载镉生物炭对斑马鱼的活动无明显影响.摄入负载镉生物炭也导致群体偏好显著降低, 表现为斑马鱼在社会区域内停留的时间变短, 鱼群之间的距离增大.净化期中, 斑马鱼的运动能力得到显著提升, 同时表现出群聚性的特征.此外, 斑马鱼肠道内的镉含量与其行为表现呈显著相关性.生物炭的固定作用和排泄导致不同剂量组斑马鱼肠道内的镉含量相近并缓解了镉在斑马鱼身体内的迁移.本研究揭示负载镉生物炭会破坏斑马鱼的社会行为, 但生物炭的固定能力能缓解这种异常变化.
关键词：镉生物炭斑马鱼行为变化负载镉生物炭
Cadmium loaded biochar ingestion cause abnormal locomotor behaviors of zebrafish
ZHAO Zhehao
, LI Dapeng, WANG Huili, ZHU Qi, HUANG YongSchool of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009
Received 23 November 2020; received in revised from 26 December 2020; accepted 26 December 2020
Abstract: In order to investigate the immobilization of cadmium (Cd) by biochar, this study selected cadmium loaded biocha r(BCCd) as the object for constructing a simple food chain of Daphina magna-zebrafish, incluing a 14-day accumulation period and a 7-day purification period. The biological toxicity of BCCd were evaluated by measuring shoaling, social preferences, and Cd content in zebrafish. During the accumulation period, BCCd ingestion evidently dampened zebrafish locomotor activity, while biochar ingestion had no marked impact.BCCd ingestion also induced a significant decrease in social preference, exhibiting fewer time spent in the social area, longer fish distance. During the purification period, zebrafish locomotor activity was improved and shoal cohesion was increased. Furthermore, alterations in the social behaviors were associated with the content of Cd changes in the intestine. The Cd content of BC-10 was reduced to nearly as much as that of BC-1 and alleviated the migration of Cd in zebrafish due to the biochar immobilization and excretion. Taken together, the results of this study suggest that BCCd ingestion can impair zebrafish social behaviors; however, biochar immobilization can alleviate this abnormal change.
Keywords: cadmiumbiocharzebrafishbehavioral changecadmium loaded biochar
1 引言(Introduction)近年来, 因生物炭优秀的孔隙结构和对重金属离子的吸附及固定能力, 被广泛用于重金属污染土壤修复(Mahdi et al., 2019; Wang et al., 2019).也有研究人员通过改变生物炭表面结构和特征来改善其吸附效力, 以此来提高修复效率和环境效益.例如, Fan等(2013)利用氢氧化钠(NaOH)对生物炭进行碱活化, 以增加氧含量和表面碱度；强酸处理生物炭可以在其表面引入胺、羧基等酸性官能团(Wang et al., 2019)；负载MnOx到生物炭上, 可形成配合物而加强阳离子交换.如果吸附了重金属的生物炭依然停留在土壤中, 其并不会对环境产生很大的负面影响.然而, 经过长时间的风化老化, 富集大量重金属的生物炭会分解成胶体或溶解性生物炭(Wang et al., 2012), 或通过水土流失(Ou et al., 2017)进入水体, 进而被水生动物如鱼类吞食, 则可能会对鱼类产生负面影响.
研究发现, 污染水体中镉的浓度一般为1~5 μg·L-1(Li et al., 2010), 长江、岷江水体沉积物中镉含量为0.05~0.60 mg·kg-1(He et al., 2019; Fan et al., 2020)；土壤中生物炭吸附镉之后生物炭上镉的含量可达到50~500 mg·kg-1(杨兰等, 2016; Li et al., 2016), 而贻贝仅在镉含量5 mg·kg-1的悬浮物中, 就会造成镉的积蓄.现有研究表明, 纳米材料负载镉后会对斑马鱼产生毒性反应(Gao et al., 2018).对于水生动物而言, 吸附镉的生物炭存在巨大的潜在风险, 然而, 这种风险主要取决于生物炭对重金属镉的固定能力.换言之, 如果生物炭对镉的固定能力很强, 即使被鱼类吞食, 被吸附的镉也不会发生解析和形态转化(Sangvanich et al., 2014), 从而对鱼类并不产生负面影响, 而迄今相关研究还鲜见报道.因此, 研究吸附镉的生物炭对鱼类行为的影响就显得格外重要, 这对于评价生物炭是否能有效地用于土壤修复及其应用前景具有重要的指导意义.
基于此, 本研究以吸附镉的生物炭为研究对象, 通过构建简单食物链(大型水蚤-斑马鱼), 将斑马鱼暴露于负载不同剂量镉(1、10 mg·g-1)的生物炭环境中, 研究其对斑马鱼的行为影响变化, 并分析其身体各部分对生物炭中镉的富集能力, 以期为阐明负载镉生物炭在食物链中对斑马鱼的影响提供参考.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 动物饲养将自来水放入循环系统作为培养水, 加入食盐和水质稳定剂, 稳定循环1 d, 保证鱼和水蚤稳定存活.大型水蚤每周喂养小球藻2次, 培养箱温度为(25.0±3.0) ℃, 水蚤样品驯化1周后投入使用.
选用同一批鱼龄为3个月且体重、体长相近的斑马鱼作为测试鱼.在实验室条件下驯化1周, 在此期间使用大型水蚤喂养, 一日1次.实验室温度保持在(27.0±3.0) ℃.
2.2 负载生物炭的制备和测定生物炭由采自太湖边的芦苇秸秆制备.芦苇秸秆经自然风干后, 粉碎机破碎, 筛分得到芦苇粉末；然后将粉末放入马弗炉中进行热解反应(500 ℃, 2 h), 研磨筛分, 洗涤样品, 冷冻干燥至恒重, 储存于密封塑料样品袋中, 得到生物炭.利用场发射环境扫描电子显微镜(QUANTA FEG 250, 美国)对生物炭表观结构进行观察和元素测定.
根据目前生物炭吸附镉效果和土壤镉水平(高瑞丽等, 2016; Bashir et al., 2018), 确定生物炭负载镉的剂量为0、1、10 mg·g-1.将1 g生物炭暴露于50 mL浓度分别为0、20、200 mg·L-1的Cd2+溶液, 振荡搅拌至溶液中Cd2+浓度接近于0 mg·L-1；然后烘干、冷冻、干燥至恒重, 储存于密封塑料样品袋中, 制备得到的负载镉生物炭依次标记为BC、BC-1、BC-10.各生物炭的具体成分见表 1.
表 1(Table 1)
| 表 1 各生物炭的具体成分 Table 1 Total concentrations in the biochar | ||||||||||||||||||||
表 1 各生物炭的具体成分 Table 1 Total concentrations in the biochar
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2.3 实验设计为了研究负载镉生物炭在斑马鱼体内的变化, 进行为期21 d的实验, 包括14 d的积累期和7 d的净化期.暴露实验于500 mL的玻璃烧杯中进行, 分别标记为E0、E1、E2、E3, 每个烧杯含有100个大型水蚤.其中, E0为对照试验, 无生物炭；E1、E2、E3均含有生物炭, 分别为BC、BC-1和BC-10, 生物炭浓度均为10 mg·L-1.暴露之前用转子搅拌机(ZNCL-S-5D)搅拌1 h使得生物炭与水充分混合, 暴露浓度由之前的研究(Liu et al., 2015; Wang et al., 2016)确定, 设定10 mg·L-1生物炭为对水蚤的非致死量.暴露8 h后将大型水蚤活体取出, 即可投入使用.在积累期, 每组5条斑马鱼每天喂养50只大型水蚤, 在净化期间, 用相同数量未污染的大型水蚤喂养斑马鱼, 每2 d更换一次水.喂食12 h后, 分别在第3、7、14、17、21 d对斑马鱼实施安乐死和解剖, 每组解剖3条, 头、体、肠道分离并保存于冰箱中.每天用移液管收集鱼粪便, 2 d测定一次.
2.4 行为学分析2.4.1 社会偏好实验社会偏好测试(Social Preference)在一个长方体容器(长40 cm、宽20 cm、高40 cm)中进行, 容器分成两个部分：社交区和非社交区(图 1a).社交区旁放置一塑料鱼缸, 里面放入6条大小相似的斑马鱼, 用来刺激实验斑马鱼.社会偏好实验前先将实验斑马鱼放入长方体容器内适应8 min, 记录6 min, 全程用摄像机(罗技G920)进行拍摄, 使用Ethovision XT 11.5计算不同区域花费的时间(s)、游动距离(cm)、游动速度(cm·s-1).第0 d从实验鱼中抽取8条斑马鱼进行测试, 之后分别于第7、14、21 d测试不同生物炭组斑马鱼, 每组测试8条.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 斑马鱼社会偏好实验(a)和鱼群实验(b)示意图 Fig. 1Schematics of the experimental tank of zebrafish group preference(a) and shoaling(b) |
2.4.2 鱼群实验鱼群实验(Shoaling)主要测定鱼群之间的平均个体间距离(即鱼群凝聚力).实验装置为白色塑料圆柱体(直径22 cm、高度24 cm), 装满5 L水, 水深12 cm(图 1b).然后将斑马鱼(每组8只, 4雌4雄)放置在实验装置中心, 实验斑马鱼引入实验装置后适应10 min, 记录6 min, 使用Ethovision XT 11.5计算记录游动速度(cm·s-1)、游动距离(cm)和鱼群最大平均距离(cm)和最小平均距离(cm).第0 d从实验鱼中抽取8条斑马鱼进行测试, 之后分别于第7、14、21 d测试不同生物炭组斑马鱼, 每组测试8条.
2.5 斑马鱼中重金属镉的测定为测定斑马鱼中镉的含量, 根据王文清等(2014)描述的湿法消解方法, 将冻干鱼组织(肠、体、头)和鱼粪在60 ℃的烘箱中烘干至恒重, 用HNO3和H2O2消解, 并用电感耦合等离子体质谱仪(Thermo Fisher Scientific, 美国)测定镉的含量.
2.6 结果统计和分析将运动参数按剂量组整理汇总, 采用平均数±标准误差(Mean ± SD)表示.应用SPSS 22软件进行单因素方差分析(one-one ANOVA test)和Tukey HSD测试(Tukey HSD test), 比较正常对照组和各剂量组间运动参数差异, 当p < 0.05时, 认为差异具有统计学意义.
3 结果(Results)3.1 斑马鱼行为学变化研究3.1.1 社会偏好实验研究社会偏好实验结果表明(图 2), 摄入负载镉生物炭会破坏斑马鱼的运动能力, 各负载镉生物炭组斑马鱼的运动能力(观察区和社交区运动距离和速度)都随积累期增加而显著下降(p＜0.05).在14 d的积累期中, 斑马鱼的社会偏好行为在不同实验间(Control、BC、BC-1、BC-10)均有显著变化(图 2), 总游行距离(p=0.001)、速度(p=0.005)、社交区游行距离(p＜0.001)及社交区速度(p=0.003)都显著降低.负载镉生物炭组的斑马鱼均出现了不同程度的静止现象(图 3), 反应也较为迟钝.同样的, 镉对斑马鱼的社会偏好存在破坏趋势, 例如, 社交区停留时间(p=0.032)显著减少(图 2).而在净化阶段, 斑马鱼的运动能力、社会偏好相较第14 d都有所增强.BC-1与BC-10组间相比, 总游动距离(p=0.980)和速度(p=0.750), 以及社交区游动距离(p=0.684)、速度(p=0.959)和停留时间(p=0.323)都未出现显著变化.生物炭组斑马鱼随喂养时间的变化, 斑马鱼行为未产生显著波动.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 斑马鱼社会偏好行为实验 Fig. 2Behavioral effects of biochar on zebrafish tested in the social preference test |
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 斑马鱼社会偏好各组分在第0、7、14、21 d的游泳跟踪结果 Fig. 3Swim traces results for zebrafish at 0, 7, 14 and 21 d in different groups |
3.1.2 鱼群实验研究鱼群实验表明, 摄入负载镉生物炭并不显著影响群体运动能力(图 4).在鱼群实验积累期的第14 d, 负载镉生物炭组斑马鱼的运动距离和速度有所降低, 但均未有显著变化(p=0.541, p=0.871).相反, 摄入负载镉生物炭会增大斑马鱼鱼群之间的距离.在积累期第14 d, 与对照实验相比, BC-1和BC-10组的斑马鱼最小/最大鱼群距离均显著增长(p < 0.05), BC-1组最小鱼群平均距离由5.3 cm增至6.6 cm, 最大鱼群平均距离由5.7 cm增至7.3 cm；BC-10组最小鱼群平均距离由5.3 cm增至7.1 cm, 最大鱼群平均距离由5.7 cm增至8.8 cm.而在净化阶段, 摄入负载镉生物炭的斑马鱼鱼群距离(p=0.951)又呈现群聚性的趋势, 整体表现为接近于对照实验.在实验过程中, 未摄入负载镉生物炭组的鱼群距离及其运动能力均未显著波动.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 斑马鱼鱼群实验结果 Fig. 4Behavioral effects of biochar on zebrafish tested in the shoaling test |
3.2 斑马鱼中重金属的变化负载镉生物炭的摄入会增加镉在斑马鱼肠道的富集, 但净化期又会削弱镉的富集程度.如图 5所示, 随着暴露时间的延长, BC-1和BC10组斑马鱼肠道内的镉含量逐渐升高, 并在第14 d左右接近高峰, 分别为1.97和3.22 mg·kg-1(以干重计).但在净化期内, 随着时间延长, 斑马鱼肠道的镉含量逐渐降低, 最终下降至0.44 mg·kg-1.这说明排泄作用导致斑马鱼肠道内富集的镉被排出体外.图 6结果显示, BC-10组斑马鱼粪便中的镉含量远高于BC-1组.
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 斑马鱼对镉的吸收和净化 Fig. 5Uptake and depuration profile of Cd in zebrafish |
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 负载Cd生物炭组斑马鱼粪便中Cd的含量 Fig. 6Cd excretion in feces of zebrafish fed with Cd group |
但负载镉生物炭的摄入并没有使斑马鱼身体重金属的积蓄量表现出较大范围的变化, 而是停留在0.03 mg·kg-1(以干重计)附近, 头部的重金属含量表现出积累期增长、净化期减弱的特征, 最高为0.3 mg·kg-1(以干重计), 但相较于肠道变化几乎不明显.
4 讨论(Discussion)本研究中, 使用负载镉含量1 mg·g-1和10 mg·g-1的生物炭, 这种实验设计符合当前土地中生物炭的吸附量和在日后生物炭在环境中转移对镉的吸附量.生物炭未被充分理解的风险就是对于环境中生物的影响, 特别是转移到水环境中后.目前评估生物炭对重金属污染土壤的影响大致分为两个方面：一是对于土壤肥力、重金属变化和生长在这片生物炭土壤的植物变化的影响；二是生物炭对于微生物丰度和土壤动物变化的影响.之前有研究指出, 生物炭会对蚯蚓一类的生物产生影响(Grossman et al., 2010), 而少有研究考虑到负载镉生物炭转移到水体后对生物体的影响.
本研究发现不论从社会偏好实验还是鱼群实验, 负载镉生物炭都会损害成年斑马鱼的关键社会行为.斑马鱼存在天生的群居偏好, 形成鱼群, 鱼群拥有对天敌的回避和迅速发现资源的特点.就社会偏好实验结果来说, 在摄入期的14 d内, BC组的斑马鱼游行距离和停留时间几乎与对照组相同, 说明生物炭的摄入并未对斑马鱼产生影响.而负载镉生物炭组斑马鱼社交区停留时间显著减少, 说明负载镉组释放出重金属镉.镉具有扰乱其内分泌的能力, 从而削弱了斑马鱼的社会性(Baggio et al., 2020).Fenske等(2020)指出在内分泌干扰化学物质(EDC)作用下, 斑马鱼会远离鱼群, 降低其社会偏好, 损害应激反应.而负载镉组对斑马鱼运动能力产生了负面影响, 也表现出对其运动能力有显著的抑制作用, 破坏了其身体机能.例如, Jijie等(2020)也发现, 镉在急性暴露下会对斑马鱼行为变量产生影响.鲁疆等(2013)也提出过镉元素会恶化幼鱼行为.
在鱼群试验结果中也有类似发现, 积累期的14 d内负载镉生物炭显著增加了鱼群之间的距离.负载镉生物炭降低了鱼群的凝聚力, 使得鱼群更加分散, 限制了个体形成密集鱼群的能力.研究发现, BSP会造成焦虑作用使得鱼群凝聚力降低, 对于鱼群产生不良影响(Salahinjad et al., 2020).鱼群实验表明, 负载镉生物炭是释放重金属镉从而产生了焦虑致幻效应, 使得鱼远离鱼群(Qiu et al., 2020).与社会偏好相反的是, 负载镉生物炭并不影响斑马鱼的运动能力水平, 说明在鱼群中受损的社会行为可能与鱼类个体移动活动的改变没有关系.就净化期斑马鱼行为表现来说, 其行为均出现良性特征, 表明负载镉生物炭上的镉对斑马鱼身体性能造成影响, 但并未出现永久性损伤.这说明镉被生物炭吸附固定后, 降低了镉对斑马鱼的损失程度.
有研究表明, 二氧化钛(TiO2)会加剧大型蚤中镉的积累和生物毒性(Li et al., 2017; Fan et al., 2018).这些研究都与本实验斑马鱼肠道内的镉含量结果相符, 在积累期中直接摄入负载镉生物炭的斑马鱼肠道内的镉含量不断上升, 同时各组的斑马鱼运动性均出现不同程度的抑制, 这说明镉的刺激抑制了斑马鱼的正常行为变化.在净化期中斑马鱼肠道内镉含量并未出现持续增长而是出现减弱, 斑马鱼社会行为均出现了缓和, 运动能力也得到了提升, 这说明短期内摄入负载镉生物炭的斑马鱼并不会造成镉的生物放大, 停止摄入后会表现出良性趋势.同时, 生物炭缓解了镉在斑马鱼体内的迁移, 身体和头部的镉含量相较于肠道内并没有显著增加, 这也说明生物炭对镉的固定起到了一定的积极作用.Zhu等(2010)也发现TiO2在斑马鱼的食物链中不会造成镉的生物放大, 吸附在材料上的重金属通常表现出较低的同化效率.但重金属长时间的积累也会导致生物体发生不可逆的转变, 最终影响生长和繁殖(Zhu et al., 2010), 这就需要进一步研究其生物炭长期的固定能力.
尽管Guo等(2018)证实在酸性条件下会降低生物炭对镉的固定化作用, 酸性增强也会增加镉在生物炭上的迁移率(Xiao et al., 2020), 但本研究在积累期的第14 d, 首先BC-1组和BC-10组间的斑马鱼社会行为表现并没有显著性差异, 同时肠道内的镉含量和社会行为都表现出接近的趋势, 生物炭的固定能力使得BC-10组斑马鱼行为变化趋于BC-1组.此外, 斑马鱼身体中镉含量在实验周期内相对稳定.这说明生物炭在胃酸的酸性环境下也可缓解镉在斑马鱼体内的转移, 使镉转移出体外, 对镉的固定起到了积极作用.本研究认为可能是肠道对于镉的吸收量没有随时间增加而增加并且净化速率较快, 从而将镉排泄出体外.因之前的研究就表明, 纳米颗粒物质携带重金属镉会加速肠道运动, 将携带大量镉的颗粒物直接排出体外(Chen et al., 2019).Abril等(2018)也认为机体更容易排泄无机颗粒混合金属相较于生物体内的金属.
5 结论(Conclusions)1) 在积累期, 摄入负载镉生物炭会显著抑制斑马鱼的运动能力, 而摄入生物炭对斑马鱼的活动无明显影响.
2) 在积累期, 负载镉生物炭摄食导致群体偏好显著降低, 表现为斑马鱼在社会区域内停留的时间变短, 鱼群之间的距离增大.净化期中, 斑马鱼的运动能力得到显著提升, 同时表现出群聚性的特征.
3) 斑马鱼肠道内的镉含量呈现先增后减的趋势, 与其社会行为表现出显著相关性.
4) 生物炭存在固定镉的能力.一方面不同镉剂量组的生物炭在斑马鱼肠道内镉含量持续保持相近状态, 镉会随生物炭直接排泄出体外.另一方面是生物炭缓解了镉在斑马鱼体内的迁移, 身体中镉并没有显著增加, 对镉的固定起到了一定的积极作用.
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