, 张圣虎2, 郭敏2, 吴晟旻2
, 巩杨2, 同帜11. 西安工程大学, 环境与化学工程学院, 西安 710048;
2. 环境保护部南京环境科学研究所, 南京 210042
收稿日期: 2017-05-24; 修回日期: 2017-07-05; 录用日期: 2017-07-05
基金项目: 国家自然科学基金（No.21407055）；江苏省自然科学基金（No.BK20140115）
作者简介: 高丹(1992-), 女, E-mail:18260068154@163.com
通讯作者（责任作者）: 吴晟旻(1980—)，男，博士，主要从事环境毒理学研究，发表论文近30篇. E-mail:wsm@nies.org
摘要: 羟基化多溴联苯醚（OH-PBDEs）是近年来发现的一种新型有机污染物，它的存在与人类生产的PBDEs有着密切的关系，因而备受关注.本文以斑马鱼胚胎为受试生物，研究了2'-羟基-2，3'，4，5'-四溴联苯醚（2'-OH-BDE-68）、3-羟基-2，2'，4，4'-四溴联苯醚（3-OH-BDE-47）、5-羟基-2，2'，4，4'-四溴联苯醚（5-OH-BDE-47）、6-羟基-2，2'，4，4'-四溴联苯醚（6-OH-BDE-47）4种典型OH-PBDEs对斑马鱼胚胎毒性效应和富集规律，测定了孵化率、存活率、正常率、心率、体长等指标和斑马鱼早期生活阶段体内的生物富集系数.结果表明，4种OH-PBDEs暴露引起斑马鱼胚胎孵化率、心率、存活率下降，畸形率升高并抑制生长发育.组织病理学研究显示，受试组斑马鱼与空白相比，出现鳃结构紊乱、腮丝上皮增厚、组织残损、脱落甚至坏死及脊椎变形等症状.2'-OH-BDE-68、3-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、6-OH-BDE-47的生物富集系数（45 d-BCF值）分别为424、244、588和144.
关键词:OH-PBDEs斑马鱼胚胎毒性生物富集
Embryonic toxicity and bioconcentration of four typical hydroxylated polybrominated diphenyl ethers to zebrafish
GAO Dan1,2
, ZHANG Shenghu2, GUO Min2, WU Shengmin2 , GONG Yang2, TONG Zhi1 1. College of Environmental and Chemical Engineering, Xi'an Polytechnic University, Xi'an 710048;
2. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042
Received 24 May 2017; received in revised from 5 July 2017; accepted 5 July 2017
Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21407055) and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province(No.BK20140115)
Biography: GAO Dan (1992—), female, E-mail:18260068154@163.com
*Corresponding author: GONG Yang, E-mail:wsm@nies.org
Abstract: Hydroxylated polybrominated diphenyl ether(OH-PBDEs), the major metabolites of PBDEs, have received great concern over their toxicity. In this study, the toxicity and bioconcentration of 4 typical OH-PBDEs, 2'-Hydroxy-2, 3', 4, 5'-tetrabromodiphenyl ether(2'-OH-BDE-68), 3-Hydroxy-2, 2', 4, 4'-tetrabromodiphenyl ether(3-OH-BDE-47), 5-Hydroxy-2, 2', 4, 4'-tetrabromodiphenyl ether(5-OH-BDE-47) and 6-hydroxy-2, 2', 4, 4'-tetrabromodiphenyl ether(6-OH-BDE-47) to zebrafish(Danio rerio) embryos were investigated. The results showed that ①The hatching rate, heart rate, survival rate decreased, the abnormal rate increased, and embryos development inhibited, when exposure to four OH-PBDEs.②Histopathological studies showed that gills structure disorders, cheek epithelial thicken, tissue damaged, and even necrosis, as well as spinal curvature, compared with the control.③BCF values of 2'-OH-BDE-68, 3-OH-BDE-47, 5-OH-BDE-47, 6-OH-BDE-47 were 424, 244, 588 and 144, respectively.
Key words: OH-PBDEszebrafishembryo toxicitybioconcentration
1 引言(Introduction)羟基化多溴联苯醚(Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers, OH-PBDEs)是PBDEs的主要代谢产物，近年来备受关注.根据Br和—OH取代位置的不同，OH-PBDEs共有837种同类物.研究表明，OH-PBDEs具有比母体更大的毒性，可以在环境中长期存在，难以被微生物降解，对人类健康和生态环境造成严重的威胁(Li et al., 2012; Canton et al., 2008; Shen et al., 2009; Bradley et al., 2011).OH-PBDEs具有和甲状腺激素(TH)类似的化学结构，能与甲状腺运载蛋白(TTR)和甲状腺受体(TRs)结合.Menin等(2015)研究发现，6-OH-BDE-47可以通过扰乱斑马鱼体内的甲状腺激素平衡，从而引起斑马鱼发育延缓.Zhao等(2011)通过4′-OH-BDE-17、2′-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-48、2′-OH-BDE-123和4-OH-BDE-9对鲤鱼的暴露实验，发现4种物质的96 h半数致死浓度LC50在854~5544 μg·L-1.Ji等(2011)指出，OH-PBDEs可诱导产生活性氧，破坏碱基使染色体断裂，从而增加染色体畸变的数目.
近年来，OH-PBDEs在环境中有不同程度的检出，特别是在沉积物(Bradley et al., 2011; Zhang et al., 2012)、生物样品(Lofstrand et al., 2011; Valters et al., 2005; Qiu et al., 2009; Qiu et al., 2009; Yu et al., 2010; Zota et al., 2011)中的检出报道较多.有文献报道，即使在十分偏远的北极地区和波罗的海和斯瓦尔巴特群岛上的生物体中也能检测到OH-PBDEs(Verreault et al., 2005; Steen et al., 2009).目前，OH-PBDEs在水环境中的浓度约在pg·L-1级别(Lofstrand et al., 2011; Ueno et al., 2008; Kim et al., 2014)，而在土壤沉积物中的含量为ng·g-1(干重)(Wang et al., 2014)，在生物体及人体内的含量同样达到ng·g-1(脂重)级别(Bradley et al., 2009; Qiu et al., 2009; Yu et al., 2010)，且含量呈逐年上升的趋势，应引起人们的高度重视.如Uneo等(2008)对加拿大2002—2004年期间的地表水进行研究，发现∑OH-PBDEs浓度为2.2~70 pg·L-1；Kim等(2014)对韩国釜山岛地表水样OH-PBDEs进行了研究，其中4个Br的ΣOH-PBDEs平均浓度为36 pg·L-1，高于PBDEs检出的平均浓度15 pg·L-1；在中国广东的电子垃圾区的土壤中检出了多种OH-PBDEs(12种OH-PBDEs)，含量为0.04~45.8 ng·g-1(干重)(Wang et al., 2014)；De等(2013)对从多伦多安大略湖采集的鱼的血浆样品检测结果显示，OH-PBDEs平均含量是1.46 ng·g-1(脂重).还有****检测发现，北极狐和北极熊体内均含有OH-PBDEs(Routti et al., 2016; Krieger et al., 2016).同样在远离工业区的波罗的海和斯瓦尔巴特群岛上的两种不同族群的环斑海豹血清中也检出了OH-PBDEs，含量分别为0.02~0.11 ng·g-1(脂重)和0.041~1.06 ng·g-1(脂重)(Marsh et al., 2004).
关于OH-PBDEs的研究现在总体还处在初步阶段，虽有一些报道，但缺乏系统的生态毒性和环境行为数据，因此，有必要对这方面的研究资料进行补充完善.研究OH-PBDEs的生物毒性效应和生物富集作用，对于评价和预测OH-PBDEs对生态系统的危害，阐明其在生态系统中的迁移转化规律，以及利用生物对环境进行监测和净化均具有重要意义.因此，本文以斑马鱼胚胎为受试生物，选择在环境中检出率较高的4种典型OH-PBDEs，分别为2′-OH-BDE-68、3-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47和6-OH-BDE-47，研究4种OH-PBDEs对鱼类胚胎的毒性作用和生物富集规律，以期为OH-PBDEs的环境管理提供数据基础和理论依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 受试生物斑马鱼(Danio rerio)为野生型TU品系，购于国家斑马鱼资源中心，饲养于实验室内循环养殖系统中.饲养方法参照Wester Field，具体饲养条件如下：试验用水为充分曝气脱氯并经活性炭过滤的自来水，每天16 h光照，温度为(25±1) ℃，溶解氧大于空气饱和浓度的80%，pH=7.0~8.0，每日定时投喂丰年虫2次，外加颗粒饵料1次，投饵15 min后，去除残饵.本研究从养殖群体中选择3个月以上、健康、体表无损伤、繁殖状况良好的成鱼为亲鱼.雌、雄斑马鱼亲鱼以1:1比例配对，每日清晨观察雌、雄鱼的行为，当观察到雄鱼追逐雌鱼时，将雌、雄鱼捞出，人工受精获取受精卵.试验开始前在显微镜下随机抽样，确认本批受精卵处于单细胞期.
2.2 试剂2′-OH-BDE-68、3-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、6-OH-BDE-47纯度为99.0%，由百灵威科技有限公司(上海)提供，用DMSO(色谱纯，德国Merck公司)做溶剂配制浓度为1000 mg·L-1的储备液(置于4 ℃冰箱避光保存).4种典型OH-PBDEs基本信息如表 1所示.
表 1(Table 1)
| 表 1 4种典型OH-PBDEs的基本信息 Table 1 Basic Information on four typical OH-PBDEs | ||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 4种典型OH-PBDEs的基本信息 Table 1 Basic Information on four typical OH-PBDEs
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试验用储备液参照ISO6341的方法统一配制，温度保持在(27.0±0.5) ℃，用分析纯试剂和蒸馏水配制而成，具体方法如下.①氯化钙溶液：称取111.0065 g CaCl2·2H2O溶于5000 mL去离子水中；② 硫酸镁溶液：称取61.6262 g MgSO4·7H2O溶于5000 mL去离子水中；③碳酸氢钠溶液：称取32.3790 g NaHCO3溶于5000 mL去离子水中；④氯化钾溶液：称取2.8738 g KCl溶于5000 mL去离子水中.取上述4种储备液各1 L混合，并用去离子水稀释至100 L.配制好的稀释水pH值为(7.8±0.2)，稀释水在使用之前曝气24 h以上.
实验用仪器主要包括：繁殖盒(北京爱生科技发展有限公司)、电子分析天平(0.1 mg/0.01 mg, MU105DU，梅特勒托利多，瑞士)、溶氧仪、温度计、pH计(HQ40d，美国哈希公司)、玻璃结晶皿配盖(海门市三和镇弘澄实验器材厂)、8 L玻璃鱼缸(配盖，三合祖平玻璃仪器厂，江苏)、人工气候箱(MLR-315H，SANYO，日本)、体视显微镜(莱卡，M205FA)、数显游标卡尺(16EX，德国马尔)、高效液相色谱-串联质谱仪(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美国)、旋转蒸发仪(Buchi，瑞士).
2.3 胚胎毒性试验2.3.1 试验条件参照OECD TG212的标准方法(OECD, 1992)，采用半静态法(换水频率72 h)测定4种OH-PBDEs对斑马鱼胚胎和卵黄囊吸收阶段的毒性影响.试验期间各项试验条件控制如下：周期8 d，容器为直径20 cm的玻璃结晶皿，溶液体积100 mL，试验生物数为每一浓度组和对照组中各30粒卵，分为3个平行，光照:光暗为16 h:8 h，温度为(25±1)℃，溶解氧含量不低于80%空气饱和值.2′-OH-BDE-68和3-OH-BDE-47试验设置5个浓度组(0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg·L-1)，5-OH-BDE-47和6-OH-BDE-47试验设置5个浓度组(0.01、0.02、0.04、0.08、0.10 mg·L-1)，对照组(0 mg·L-1)DMSO浓度为10.0 μL·L-1.
2.3.2 毒性终点测定孵化率、存活率和正常率：试验期间准确记录胚胎发育所处的时期，每天观察胚胎孵出及存活情况，以卵凝结和心跳停止作为死亡终点，统计胚胎死亡数、孵化数.体视显微镜观察和记录胚胎或仔鱼的畸形和异常行为.
斑马鱼心率：选取OH-PBDEs处理组和对照组96 h受试鱼测量心率，将仔鱼小心放置于凹槽玻片上，用发圈拨动仔鱼使其呈侧卧状态，尽量使尾部与身体处在同一水平面上.位置摆正后，在体式显微镜下观察，心跳清晰可见.打开摄像软件(BB FlashBack Pro 5.0)，对斑马鱼心跳录像1 min，然后用Image J软件对摄像资料进行处理，统计心率.
体长：暴露毒性试验结束时(8 d)，采用数显游标卡尺逐一测定存活鱼体长度(全长).
2.3.3 斑马鱼组织病理检查收集OH-PBDEs处理组和对照组120 h受试鱼，用4%多聚甲醛在4 ℃条件下固定24 h，然后用系列浓度乙醇脱水，二甲苯透明，浸于56 ℃石蜡中包埋，将蜡块切成5 μm厚度的薄片，并经过脱蜡、苏木素-伊红染色、封固等步骤制成组织切片，在显微镜下观察组织变化并拍照.
2.4 生物富集性试验2.4.1 试验条件参照OECD TG305B的标准方法(OECD, 1981)，采用半静态法(换水频率72 h)测定4种OH-PBDEs对斑马鱼(0~45 d)的富集性影响.试验期间，各项试验条件控制如下：周期45 d，容器为500 mL玻璃结晶皿(受精卵至卵黄囊完全吸收前0~8 d)、8 L玻璃缸(卵黄囊完全吸收后9~45 d)，溶液体积500 mL(受精卵至卵黄囊完全吸收前0~8 d)、8 L(卵黄囊完全吸收后9~45 d).试验生物数：每一浓度组和对照组各120粒卵，不设平行，光暗比为16 h:8 h，温度为(25±1) ℃，溶解氧含量不低于80%空气饱和值.2′-OH-BDE-68和3-OH-BDE-7试验设置1个浓度组(0.03 mg·L-1)，5-OH-BDE-47和6-OH-BDE-47试验设置1个浓度组(0.01 mg·L-1)，对照组(0 mg·L-1)DMSO浓度为10.0 μL·L-1.
2.4.2 水样和鱼样的采集和处理分别在第5、7、14、21、28、35、42和45 d采集水样和鱼样.水样采集与处理：按虹吸原理，使用惰性玻璃管从试验容器的中部区域采集，采集的水样过0.22 μm滤膜后，用HPLC-MS/MS测定.鱼样采集与处理：第5、7和14 d各取20尾鱼样，之后每次取7尾鱼样.取鱼样时，从试验容器中取出鱼，快速用水冲洗，吸干体表水分，称重.采集的鱼样加少量无水硫酸钠碾成粉末放入三角瓶中，加适量乙腈，振摇1 h(200 r·min-1，20 ℃)，旋转蒸发仪蒸干，用流动相(85%乙睛)溶液复溶，过0.22 μm微孔滤膜，采用HPLC-MS/MS测定.
2.4.3 水样和鱼样的分析测定采用HPLC-MS/MS方法测定4种OH-PBDEs的鱼样和水样.操作条件如下：LC-Agilent Technologies 1290 Infinity液相色谱串联质谱仪；色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18 Column(150 mm×2.1 mm，3.5 μm，Agilent，USA)；柱温40 ℃；流动相为乙腈/水(0.2%氨水)=85:15；流速0.3 mL·min-1；进样体积5 μL.
负离子模式：采用电喷雾离子源(ESI)、多反应离子监测扫描定量分析目标物，气帘气压241327.1 Pa，喷雾气压344753 Pa，辅助加热气压344753 Pa，源温度400 ℃，离子化电压5500 V.其它质谱参数见表 2.
表 2(Table 2)
| 表 2 4种OH-PBDEs的质谱参数 Table 2 Mass Spectrometric Parameters of Four OH-PBDEs | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 4种OH-PBDEs的质谱参数 Table 2 Mass Spectrometric Parameters of Four OH-PBDEs
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2.4.4 样品的质量控制用上述HPLC-MS/MS方法测定水样和鱼样中4种OH-PBDEs.水样和鱼样中，目标化合物通过与标准样品的保留时间(2%以内)和选择离子的峰面积比例(20%以内)比较进行定性确认，并采用最高丰度或背景干扰最小的选择离子进行定量分析.水样中，6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、3-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68的回收率分别为95.800%±0.396%、107.00%±2.86%、95.10%±6.48%、102.00%±2.88%.鱼样中，6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、3-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68的回收率分别为92.70%±2.14%、87.20%±0.49%、101.00%±1.51%、91.40%±8.15%.每次取鱼样和水样测定时，同时做方法空白、空白加标和基质加标，以控制整个分析过程的准确度和精密度.空白试验4种OH-PBDEs均未检出.
2.4.5 数据分析分别于试验第5、7、14、21、28、35、42和45 d采集各处理水样与鱼样，共采样8次，分别测得8个水样浓度、8个鱼样浓度，即可分别得到8个生物富集系数(BCF)值.以各时间点鱼体内浓度或BCF值为纵坐标，以采样时间为横坐标做曲线.其中，BCF值计算公式如下：
 | (1) |
2.5 数据处理应用统计软件SPSS17.0进行统计分析，试验数据用平均值±标准误表示.鱼卵的孵化率、存活率、正常率、心率及仔鱼的体长采用单因素方差分析.将每个处理组与对照组进行比较，检验差异显著性.*表示处理组与空白对照组差异显著(p < 0.05)，**表示处理组与空白对照组差异极显著(p < 0.01).
3 结果(Results)3.1 胚胎毒性试验3.1.1 4种OH-PBDEs暴露对斑马鱼胚胎96 h心率的影响4种OH-PBDEs对斑马鱼胚胎暴露96 h后，对斑马鱼胚胎心率的影响如图 1所示.正常对照组96 h斑马鱼心率跳动规则，平均心率约为170次·min-1.当6-OH-BDE-47浓度为0.08、0.10 mg·L-1，2′-OH-BDE-68浓度为0.32、0.64 mg·L-1，5-OH-BDE-47浓度为0.10 mg·L-1时，斑马鱼胚胎的心率与对照组相比显著减少(p < 0.05或p < 0.01).3-OH-BDE-47所有暴露组的胚胎心率与对照组相比均无显著性差异.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 4种OH-PBDEs暴露对斑马鱼胚胎96 h心率的影响 Fig. 1Heart rates of zebrafish embryo/larvae after exposure to 4 OH-PBDEs for 96 h |
由图 1还可知，暴露于相同浓度梯度的6-OH-BDE-47和5-OH-BDE-47，斑马鱼胚胎的心率分别由0.01 mg·L-1时的(166.00±1.26)、(166.00±2.17)次·min-1降低到0.10 mg·L-1时的(121.00±2.48)和(134.00±2.61)次·min-1；暴露于相同样浓度梯度的3-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68，斑马鱼胚胎的心率分别由0.04 mg·L-1时的(167.00±1.50)、(162.00±3.96)次·min-1降低到0.64 mg·L-1时的(158.00±2.23)、(134.00±1.96)次·min-1.
3.1.2 4种OH-PBDEs对斑马鱼胚胎120 h孵化率的影响4种OH-PBDEs对斑马鱼胚胎120 h孵化率的影响如图 2所示.由图可知，空白对照组孵化率达到98.9%，当6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47浓度为0.10 mg·L-1，胚胎孵化率与空白对照组相比显著减少(p < 0.01).2′-OH-BDE-68浓度为0.32、0.64 mg·L-1, 3-OH-BDE-47浓度为0.64 mg·L-1时，胚胎孵化率均显著减少(p < 0.05).当6-OH-BDE-47和5-OH-BDE-47浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08 mg·L-1，3-OH-BDE-47浓度分别为0.04、0.08、0.16、0.32 mg·L-1，2′-OH-BDE-68浓度分别为0.04、0.08、0.16 mg·L-1时，均无显著性差异(p>0.05).
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 4种OH-PBDEs暴露对斑马鱼胚胎120 h孵化率的影响 Fig. 2Hatching rates of zebrafish embryo/larvae after exposure to 4 OH-PBDEs for 120 h |
本实验中观察到OH-PBDEs对斑马鱼胚胎发育延迟现象较为明显，直到第6 d仍有少数孵化个体，在体视显微镜下观察还有心跳并未死亡.4种OH-PBDEs对斑马鱼孵化率均有不同程度的抑制作用，具有明显剂量-效应关系.暴露于相同浓度梯度的6-OH-BDE-47和5-OH-BDE-47，胚胎孵化率分别由0.01 mg·L-1时的98.90%±1.92%、97.70%±1.92%降低到0.10 mg·L-1时的42.20%±5.09%、67.8%±5.09%；暴露于相同浓度梯度的3-OH-BDE-47和2′-OH-BDE-68，胚胎孵化率分别由0.04 mg·L-1时的96.70%±1.92%、98.9%±1.92%下降至0. 64 mg·L-1时的75.60%±3.85%、58.90%±5.09%.OH-PBDEs与甲状腺激素(TH)具有类似的结构，能与甲状腺激素竞争甲状腺运载蛋白(TTR)和甲状腺受体(TRs)的结合，具有一定的甲状腺内分泌干扰效应(Li et al., 2010)，这也许是斑马鱼胚胎发育障碍的原因之一.
3.1.3 4种OH-PBDEs对斑马鱼胚胎/幼鱼的异常表征研究表明，6-OH-BDE-47浓度为0.10 mg·L-1、2′-OH-BDE-68浓度为0.32、0.64 mg·L-1时，斑马鱼胚胎的生长发育受到抑制并出现了少数畸形，在胚胎期就出现了卵黄囊肿、脊椎弯曲等症状.2′-OH-BDE-68暴露最为明显，而6-OH-BDE-47暴露主要表现为发育延缓.2′-OH-BDE-68在0.08、0.1 mg·L-1处理组中部分胚胎出现孵化抑制、发育缺陷、色素减少等现象.6-OH-BDE-47在0.10 mg·L-1处理组的正常率与对照组相比显著性减少(p < 0.05). 3-OH-BDE-47所有浓度组与对照组的正常率均达到了100%，与对照组相比无显著性差异.5-OH-BDE-47浓度为0.01、0.02 mg·L-1时，正常率达到100%，当浓度为到0.04、0.08、0.10 mg·L-1时，出现部分异常，正常率由100%(0.01 mg·L-1)分别下降到97.80%±1.92%(0.04 mg·L-1)、96.70%±3.33%(0.08 mg·L-1)、95.60%±5.09%(0.10 mg·L-1)，但与对照组相比统计无显著性差异(图 3).
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 4种OH-PBDEs暴露对斑马鱼幼鱼8 d正常率的影响 Fig. 3Normal rates of zebrafish larvae after exposure to 4 OH-PBDEs for 8 d |
试验期间，4种OH-PBDEs暴露均使斑马鱼胚胎出现类似的异常现象，由图 4a可见，对照组的胚胎发育正常；4种不同浓度的OH-PBDEs可导致斑马鱼的胚胎表现出发育延缓、体型变小、色素减少、心包囊肿、卵黄囊肿、致畸甚至死亡等症状(图 4b、4c、4d、4e、4f)，且多种畸形效应往往出现于各种化合物的较高浓度组.4种受试物中，2′-OH-BDE-68的畸形现象最为明显，在胚胎期就出现了卵黄囊肿、脊椎弯曲等症状，而6-OH-BDE-47主要异常为发育延缓症状.有文献报道(Macaulay et al., 2015)，6-OH-BDE-47可导致斑马鱼出现显著的发育迟缓，色素沉积减少，并且在较高剂量下出现斑马鱼胚胎的致死现象，这与本研究结果基本一致.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 OH-PBDEs对斑马鱼胚胎染毒症状(a.48 h发育正常胚胎；b.48 h发育迟缓胚胎；c.120 h发育迟缓+色素减少仔鱼；d.120 h脊椎弯曲仔鱼；e.120 h心包囊肿+卵黄囊肿仔鱼；f.120 h尾部弯曲仔鱼) Fig. 4Toxicity symptoms of OH-PBDEs on zabrafish embryo(a.48 h normal embryonic development, b.48 h developmental delay embryo, c.120 h developmental delay and pigment reduction embryo, d.120 h spinal curvature larvae, e.120 h pericardial edema and yolk sac edema, f.120 h tail curvature larvae) |
3.1.4 4种OH-PBDEs暴露对斑马鱼幼鱼8 d存活率的影响图 5是4种OH-PBDEs的浓度和斑马鱼幼鱼存活率之间的关系图.由图 5可见，4种OH-PBDEs暴露组幼鱼存活率也随6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、3-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68浓度的增加而降低.当6-OH-BDE-47、3-OH-BDE-68浓度分别为0.10、0.64 mg·L-1时，存活率分别为41.10%±6.93%、58.80%±6.94%，与对照组存活率(98.90%±1.92%)相比，显著减少(p < 0.05或p < 0.01).当6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-47浓度分别为0.08、0.10、0.64 mg·L-1时，存活率分别为62.20%±3.85%、68.90%±5.09%、75.60%±1.92%，显著减少(p < 0.05或p < 0.01).其他暴露浓度组与对照组相比，均无显著性差异.
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 4种OH-PBDEs暴露对斑马鱼幼鱼8 d存活率的影响 Fig. 5Survival rates of zebrafish larvae after exposure to 4 OH-PBDEs for 8 d |
3.1.5 4种OH-PBDEs暴露对斑马鱼幼鱼8 d体长(全长)的影响类似地，4种OH-PBDEs对斑马鱼幼鱼暴露8 d后，对斑马鱼幼鱼的体长(全长)影响如图 6所示.从图中可以看出，6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、3-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68所有浓度组与8 d斑马鱼幼鱼体长呈现出剂量-效应关系.随着4种物质的浓度升高，斑马鱼幼鱼体长减小.当6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、3-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68浓度分别为0.04、0.08、0.64、0.32 mg·L-1时，与对照组体长((4.59±0.17) mm)相比，显著减少(p < 0.05).当6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68浓度分别为0.08和0.10、0.64 mg·L-1时，显著减少(p < 0.01).可见，4种OH-PBDEs对斑马鱼幼鱼的生长均产生了明显抑制作用.
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 4种OH-PBDEs暴露对斑马鱼幼鱼8 d体长的影响 Fig. 6Length of zebrafish larvae after exposure to 4 OH-PBDEs for 8 d |
由图 6还可以看出，暴露于相同浓度梯度的6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47，斑马鱼幼鱼的体长分别由0.01 mg·L-1时的(4.67±0.17) mm、(4.68±0.20) mm减小到0.10 mg·L-1时的(3.98±0.12) mm、(4.35±0.30) mm.同样暴露于相同浓度组的3-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68的斑马鱼幼鱼的体长分别由0.04 mg·L-1时的(4.71±0.25) mm、(4.72±0.27) mm减小到0.64 mg·L-1时的(4.38±0.24) mm、(4.28±0.18) mm.
3.1.6 组织病理切片检查结果图 7为4种OH-PBDEs暴露120 h后斑马鱼仔鱼显微拍照和病理切片图，对应的病理切片异常部位如图中的箭头所指.4种OH-PBDEs对斑马鱼幼鱼暴露120 h后，由于斑马鱼幼鱼刚孵化成仔鱼，难以解剖成各个组织进行组织病理切片观察，因此, 进行整条斑马鱼仔鱼病理组织检查(图 7).正常斑马鱼鳃小片独立，平行排列整齐，并与鳃丝纵轴垂直.组织病理切片结果显示，空白对照组斑马鱼仔鱼腮结构清晰，外面呼吸上皮细胞完整、表面平滑舒展(图 7a)；而暴露在4种OH-PBDEs的斑马鱼与对照组相比出现异常，主要表现为鳃结构紊乱、腮丝上皮增厚、组织残损、脱落甚至坏死等症状(图 7b和7d加粗箭头所指).试验期间还发现，高浓度OH-PBDEs处理组的斑马鱼仔鱼鱼体部位有肿块突起部分(图 7B中箭头所指)，经组织切片检查证实是由脊椎变形造成的肿块突起(图 7b箭头所示).同样，从图 7C的显微图发现，斑马鱼仔鱼身体弯曲，切片检查证实为脊椎处为明显的畸形，如对应的切片检查图 7c中箭头所示.
图 7(Fig. 7)
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| 图 7 4种OH-PBDEs对斑马鱼胚胎暴露120 h病理切片检查结果(A~D为显微拍照仔鱼图；a~d为120 h显微拍照仔鱼所对应的病理切片图，a.空白对照(CK), b.脊椎畸形+鱼鳃排列紊乱, c.脊椎弯曲, d.鳃组织残损+脊椎弯曲) Fig. 7Histopatholgical images of 4 OH-PBDEs on 120 h zebrafish embryo(A~D.larvae under the micro-photographed, a~d.Histopathological biopsy on 120 h zabrafish embryo, a.control group, b.spinal malformation and gill arrangement disorder, c.spinal curvature, d.gills tissure damaged and spinal curvature) |
3.2 生物富集性试验3.2.1 4种OH-PBDEs的生物富集结果斑马鱼对4种OH-PBDEs生物富集结果如图 8所示.结果表明，4种OH-PBDEs均具有一定的生物富集能力，其富集性大小依次5-OH-BDE-47>2′-OH-BDE-68>3-OH-BDE-47>6-OH-BDE-47.45 d-BCF值分别为588、424、244和144.有文献报道(Liu et al., 2016)，6-OH-BDE-47对斑马鱼幼鱼的96 h-BCF值为23.3，与本次研究结果6-OH-BDE-47的5 d-BCF值(89)相差不大.
图 8(Fig. 8)
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| 图 8 4种OH-PBDEs生物富集结果 Fig. 8The bioconcentration of 4 OH-PBDEs |
3.2.2 4种OH-PBDEs的生物富集规律图 9是4种OH-PBDEs在斑马鱼胚胎内的生物富集规律.从时间轴度观察，4种OH-PBDEs在斑马鱼胚胎体内的BCF值随着浓度的增大和暴露时间的延长均呈先快速增加后减少再逐渐增加的过程.4种OH-PBDEs在斑马鱼早期生命阶段(前14 d)的富集性呈快速增长状态，第14~21 d的BCF值到达最高值，而后逐步下降，原因可能是OH-PBDEs富集性与斑马鱼生长具有密切的关系.早期斑马鱼体重轻、生物量小、代谢量低，OH-PBDEs在体内迅速积累；而随着斑马鱼进入快速生长期，体重增长的幅度大于OH-PBDEs富集的速度，此外，鱼体内已具备一定的代谢去除能力，OH-PBDEs在体内的富集量反而有所下降；但随着鱼体生长速度趋缓，BCF值又呈现增加趋势.近年也有文献(Liu et al., 2016)报道了斑马鱼胚胎暴露于BDE-47、6-OH-BDE-47和6-MeO-BDE-47在4~120 h的富集情况，研究发现，BDE-47在鱼体内的生物蓄积最高，120 h-BCF值高达2430，其次是6-MeO-BDE-47，120 h-BCF值达到935，而6-OH-BDE-47的富集性最低，120 h-BCF值只有23.3.这与本研究中结果6-OH-BDE-47对斑马鱼胚胎暴露5 d的BCF值(89)及暴露45 d的BCF值(144)基本接近，其中差异可能是暴露时间不同引起的.由此可见，在早期生命阶段斑马鱼生物富集系数BCF与生长率有较强的关联性.
图 9(Fig. 9)
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| 图 9 4种OH-PBDEs在斑马鱼胚胎内的生物富集规律 Fig. 9The bioconcentration kinetics of 4 OH-PBDEs in zebrafish embryo/larvae |
4 讨论(Disscussion)OH-PBDEs表现出比母体PBDEs更高的水生急性毒性，例如，母体BDE-47对斑马鱼胚胎96 h-LC50为3.77 mg·L-1(吉贵祥等, 2013)，而其衍生物6-OH-BDE-47的96 h-LC50为0.96 mg·L-1(Usenko et al., 2012)，可见6-OH-BDE-47的毒性比母体高.同样，研究发现，BDE-47、6-OH-BDE-47、6-MeO-PBDEs对斑马鱼的毒性大小依次为6-OH-BDE-47＞6-MeO-PBDEs＞BDE-47(郑新梅, 2013).据报道，OH-PBDEs对鲤鱼的毒性也很高(Zhao et al., 2012).各种OH-PBDEs对鲤鱼的毒性分别为：2′-OH-BDE-7的96 h-LC50为0.697 mg·L-1，4′-OH-BDE-17的96 h-LC50为1.130 mg·L-1，4′-OH-BDE-90的96 h-LC50为0.644 mg·L-1，2′-OH-BDE-123的96 h-LC50为0.522 mg·L-1.其中，除4′-OH-BDE-17属于高毒物质外，其它均属于极高毒性物质.相对于PBDEs而言，OH-PBDEs因结构中含有酚羟基而具有较高的亲水性和极性，更容易进入生物组织而引发毒性效应.表 3是PBDEs及其衍生物OH-PBDEs的急性毒性比较.
表 3(Table 3)
| 表 3 PBDEs及其衍生物OH-PBDEs的急性毒性比较 Table 3 Acute toxicity comparison of PBDEs and their derivatives OH-PBDEs | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 3 PBDEs及其衍生物OH-PBDEs的急性毒性比较 Table 3 Acute toxicity comparison of PBDEs and their derivatives OH-PBDEs
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与母体PBDEs相比，OH-PBDEs可能具有更强的甲状腺激素干扰效应，能导致更明显的发育延缓、生长抑制等毒性效应.OH-PBDEs结构和甲状腺素(T4)相似，能够与甲状腺转移蛋白(TTR)结合，进而显著影响体内的甲状腺激素水平.例如，4-OH-BDE-42、3-OH-BDE-47、4′-HO-BDE-49和5-OH-BDE-47等同类物与TTR结合的能力要比甲状腺激素高1倍.研究发现，6-OH-BDE-47与TTR结合，能把T4从TTR中置换出来，而母体PBDEs取代T4的能力要远小于OH-PBDEs(Li et al., 2010; Heijlen et al., 2014).体外试验结果表明，OH-PBDEs能够干扰Ca2+的动态平衡和神经递质释放，导致细胞凋亡(Dingemans et al., 2008).Ji等(2011)研究发现，OH-PBDEs还具有基因毒性诱导DNA损伤.这些可能是OH-PBDEs导致斑马鱼胚胎畸形和发育迟缓的原因.
与母体PBDEs相比较，OH-PBDEs的生物富集作用相对较低.原因可能是OH-PBDEs结构中的—OH基团增强了亲水性，使脂溶性下降，被生物体摄入也随之减少.有文献报道BDE-47的生物富集系数高达2430，6-MeO-BDE-47的生物富集系数为937，6-OH-BDE-47的生物富集系数只有23.3(Liu et al., 2016).
综上所述，4种OH-PBDEs对斑马鱼胚胎毒性高于母体，而蓄积性低于母体.近年来，OH-PBDEs在环境中的检出浓度总体呈现增高趋势，OH-PBDEs在低剂量条件下就对鱼类具有高毒性，即便是鱼体内的低量蓄积也能造成高危害，因此，应引起足够重视.
5 结论(Conclusions)1) 毒性试验结果表明，4种OH-PBDEs引起斑马鱼胚胎孵化率、心率、存活率下降，畸形率升高并抑制生长发育.
2) 病理切片发现，受试组斑马鱼与空白相比，出现鳃结构紊乱、腮丝上皮增厚、组织残损、脱落甚至坏死及脊椎变形等症状.
3) 斑马鱼胚胎对4种OH-PBDEs的富集试验表明，4种OH-PBDEs在斑马鱼胚胎体内的BCF值随着浓度的增大和暴露时间的延长均呈现先快速增加后减少再逐渐增加的过程，富集作用大小为5-OH-BDE-47>2′-OH-BDE-68>3-OH-BDE-47>6-OH-BDE-47.
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