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--> --> --> 菌渣含有丰富的蛋白、多糖、氨基酸等营养物质，若不对其充分利用，则会造成资源浪费。我国每年产生数量庞大的菌渣，其中好氧堆肥技术是实现菌渣资源化最常用途径。然而，传统堆肥腐熟过程是由自然微生物参与的生理生化过程，存在堆肥周期长、腐熟较慢等缺点[1]。目前，接种外源微生物促进堆肥过程[2]是好氧堆肥应用的常用方式。在应用广泛的外源添加物中，微生物菌剂的添加不仅能加速堆肥进程[3-5]，还可以提高堆肥产品品质。在堆肥初期，接种微生物菌剂可通过菌群联合作用缩短发酵周期[6]。因此，国内外众多****致力于培养不同功能的微生物菌剂应用于堆肥，使其快速升温，进而缩短堆肥周期。固态菌剂可弥补液体菌剂存货短、不易运输的缺陷[7]，故得到了广泛应用。目前，常见固态菌剂的制备方法有真空干燥法、低温冷冻干燥、喷雾干燥法等。而微生物固定化技术中的“吸附-包埋”法是近年来新兴的固态菌剂制备技术[8-10]。该技术的产品质量及保质期表现优异，广泛应用于大气和水处理中，但在农业固废处理中的应用却鲜有报道。
本研究利用“吸附-包埋”技术，以多孔淀粉为载体吸附剂[11-13]，将吸附筛选出的微生物进行冷冻干燥[14-18]得到“吸附”产品，即包埋基础产品，再将该产品通过“包埋”技术制备出可应用于菌渣堆肥体系中的新型固态菌剂，并对每个步骤的产品进行效果验证，以期为农用微生物菌剂的制备提供参考。
1.1. 菌剂制备及鉴定方法
1) 供试菌株。供试菌株为课题组前期筛选的堆肥用芽孢杆菌，编号为B402、B409、B508。参考文献[19]的方法制备混合菌剂：利用1.5 L Biltech-3JG-2发酵罐进行混菌发酵；优化培养基为NB，加入15 g·L?1葡萄糖和15 g·L?1酵母粉；培养参数为pH 7.5、转速 250 r·min?1、DO通气比(每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)为2.25 。制得混合菌液记为液态菌剂M，混合菌液的活菌数数量级为1010 cfu·mL?1。2) 吸附载体及冻干保护剂。载体为多孔淀粉，购买于西安某科技公司，其产品质量符合国家标准（GB 31637-2016）。冻干保护剂有3类：糖类保护剂(乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖)、醇类保护剂(甘露醇)、防腐剂(硫代硫酸钠、抗坏血酸、维生素E)。
3) “吸附-包埋”制备法。将液态菌剂M与多孔淀粉按特定比例混合，投加保护剂后置于?80 ℃低温冰箱中预处理30 min；将预处理后的样品置于冷冻干燥机中，等待20~30 min，直到冷冻舱温度低于?40 ℃；在低温下打开真空泵开关，等待10~15 min，直到系统压力低于1.33×104 Pa；待样品干燥完全后取出，一般为24 h。
对冻干过程中用到的糖类保护剂、醇类保护剂和抗氧化剂的种类和浓度进行单因素实验，以此为基础进行响应面优化，以确定最佳冻干保护剂组合，得到粉末态固态菌剂D，记为后续包埋处理的基础产品。将固态菌剂以1∶10的比例置于无菌水中，在40 ℃、160 r·min?1的条件下培养30 min获得发酵液，活菌数的测定采用稀释平板培养计数法，发酵液进行10倍稀释后，涂布平板进行活菌计数。将发酵液在70 ℃下处理15 min 后进行冷却，采用稀释梯度平皿计数法统计活菌数即为芽孢数。通过式(1)和(2)计算存活率和芽孢率。
式中：所有活菌数的单位均为cfu·mL?1。
利用海藻酸钠和CaCl2将包埋基础产品(固态菌剂D)制备成微生物小球(即固态菌剂Q)。包埋处理可进一步提高固态菌剂的保存期，并减少外源微生物菌剂投加到堆体时产生的拮抗及抑制作用。操作过程如图1所示。
4）固态微生物菌剂的产品质量及保存期的确定。与液态菌剂相比，固态菌剂更易运输、保存，货架期更长。为评估固态菌剂中活菌的保存期，每隔7 d测定1次制得微生物菌剂(菌剂M、D、Q)的存活率作为评价指标。 不同保存温度对固态菌剂的保存期可能会产生不同影响。将上述固态菌剂D、Q平均分为3份，每份约80 g，置于食品级PE自封袋中。将其分别置于室温条件下(20 ℃左右)、4 ℃冷藏室中、?20 ℃的冷冻室中，每隔7 d测定1次存活率。
5）菌剂堆肥效果的验证。在PVC箱中进行堆肥实验，堆肥材料为菌渣和秸秆。设置3个实验组，在堆肥初期分别投加放置已保存3个月的菌剂M、D、Q，记为CK、PF、GF组。调整实验条件C/N约为20%，含水率为60%。实验装置如图2所示。
1.2. 分析方法及手段
使用Design-Expert.v8.0.6.1进行响应面分析，采用平板计数法[20]测定有效活菌数。在堆肥效果验证中，温度早晚各测定1次取平均值，且分别在0、3、5、7、14、21、28、35 d时进行翻堆取样，测定堆肥过程中的有机质(organic matter，OM)、可溶性有机质成分的变化及GI，以此衡量不同菌剂处理下的堆肥腐熟度，判断制备菌剂的实际应用效果。2.1. “吸附-包埋法”制备固态菌剂的工艺条件优化
2.1.1. 基础产品固态菌剂D的最佳制备条件
1) 菌液M与多孔淀粉比例的优化。将菌液M与多孔淀粉以不同比例混合，测定冻干后吸附菌液在多孔淀粉中的存活率[21]和芽孢率。当菌液M(体积)与多孔淀粉(质量)的比例(v∶m)大于2.5时，菌液和多孔淀粉分层现象严重，表明此时多孔淀粉对菌液M已达吸附饱和。如图3所示，随着菌液M与多孔淀粉比例不断提高，产品中活菌存活率不断上升。而从经济角度考虑，确定菌液M与多孔淀粉的最佳混合比例为2.5∶1，此时的活菌存活率为41.08%、芽孢率为46.56%。
2) 冷冻干燥保护剂选择的响应面优化。响应面优化是通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[22]。对糖类、醇类、抗氧化剂[23]进行单因素实验，进而对冷冻干燥保护剂进行响应面优化。单因素实验结果表明，糖类、醇类、抗氧化剂分别选择质量分数为10%的乳糖、质量分数为2.5%的甘露醇、质量分数为0.015%硫代硫酸钠。
基于单因素实验，选乳糖的质量分数(A)、甘露醇的质量分数(B)、硫代硫酸钠的质量分数(C)3个关键影响因素，进行3因素3水平响应面优化研究；以活菌存活率为评价指标，研究关键影响因素对冷冻干燥后所得产品的综合效应，获得固态菌剂制备的最佳方法。因素水平设计如表1所示，实验方案设计及结果如表2所示，方差分析如表3所示。
以活菌存活率为评价指标对该模型进行方差分析及模型系数检验。由表3可知，模型的P=0.05<0.05，表明模型适应性好，具有统计学意义。由P值可知，模型变量中的A2、B2、C2对存活率影响显著，说明实验因素和响应因素之间不是简单的线性关系。在该模型中，失拟误差为P=0.112 4>0.05，表明模型拟合度较好，失拟误差可能来源于实验中的随机误差。在选取的各因素水平范围内，按照响应的影响因素顺序为A(乳糖的质量分数)>C(硫代硫酸钠的质量分数)>B(甘露醇的质量分数)。
为确定3个因素的最佳组合，对其进行两两交互，绘制响应曲面及等高线图[24]，即1个因素确定1个中值，观察其他2个因素之间的交互影响，并确定最佳范围，结果见图4。
根据响应面优化结果得到冷冻干燥过程保护剂中乳糖、甘露醇、硫代硫酸钠的最佳添加比例，分别为10%~11%、2.4%~2.6%、0.012%~0.015%。根据响应面分析结果，拟合响应面方程如式(3)所示。
通过模型方程确定最佳组合：在乳糖、甘露醇、硫代硫酸钠的质量分数分别为11%、2.6%、0.013%的条件下，预测的最大存活率为91.532 1%(可信度99.8%)。根据模拟得到的最佳组合，进行验证实验。此时，冷冻干燥后菌剂中活菌的存活率为(92.43±1.43)%，芽孢率可达(68.79±2.15)%。一般来说，市面上的冻干保护剂可保证冻干后的活菌存活率>90%。评估表明，优化保护剂与市面上所售冻干保护剂效果相当。该阶段制备的固态菌剂记为菌剂D。制得的固态菌剂实物如图5所示。
活菌数是衡量菌剂质量的关键指标。液态菌剂M中内含大量的芽孢杆菌，芽孢能适应不良环境，对物理伤害和很多有毒的化学物质都有很强的抗性，而在条件适宜时又可转变为营养细胞，从事正常的代谢活动，适合制作农用微生物菌剂，因此，在测定活菌数的同时，测定芽孢率的变化。
2.1.2. 固态菌剂Q的最佳包埋制备条件
利用海藻酸钠和CaCl2对固态菌剂D进行包埋，得到目标产品固态菌剂Q。以成型及较好的机械强度为前提，确定了最佳CaCl2的质量分数为5%、海藻酸钠的质量分数为6%，掺入量为20%，并将其放置室温条件下失水，以此制备微生物小球。图6为制得菌剂Q的外貌形态照片。
2.2. 固态菌剂的产品质量及保存期的评估
2.2.1. 固态菌剂的质量评价
制备的固态菌剂属于农用微生物菌剂，故将其与农用微生物菌剂国家标准(GB 20287-2006)中的各项指标进行对比(见表4)。对比结果表明，制得的固态菌剂D、Q各项指标均符合国家标准。2.2.2. 固态菌剂保存时间及温度
为研究不同温度条件对固态菌剂保存期的影响，研究了固态菌剂的保存温度。由图7可知，在90 d内，3种微生物菌剂的活性均呈现下降趋势。存活率下降最快的是液态菌剂M，在第60天其活性即低至无法检出，此时菌剂已严重腐臭变质，且出现了霉菌。而固态菌剂D、M在90 d后存活率仍然可达44.12%、47.69%，其有效活菌数依然达标。表4中其他指标亦可达到国家标准。
由图8中可知，不同保存温度下，固态菌剂M、Q的最终存活率均可达标，表4中涉及的其他指标在90 d后亦可达标。说明固态菌剂M、Q对保存温度并无苛刻要求。
2.3. 菌剂的堆肥效果验证
2.3.1. 堆肥过程中温度和有机质的变化
将制备的3种微生物菌剂放置90 d后，添加入堆肥初期的堆体中进行效果验证。由图9(a)可知，反应温度变化均呈现先上升后下降的趋势。设置3个处理组(CK、PF、GF)，以初始活菌数相同，CK、PF、GF组添加了保存6个月后的液态菌剂，PF组添加了菌剂M，添加了菌剂Q。3个处理组(CK、PF、GF)的高温期分别持续4、5、5 d，最高温分别为56、60、62 ℃，高温阶段的整体温度趋势为GF>PF>CK。由图7可知，CK处理组在3个月后发生变质、活菌数无法检出，故将其投加到堆体中并无促进作用。与PF处理组相比，GF处理组的效果更佳，说明单位质量GF组菌剂的活菌活性大于PF组，且GF组菌剂在3个月后的存活率更高(见图7)。以上结果表明，研究制得的固态菌剂可在保存若干月后仍维持较高的存活率。在整个堆肥过程中，在升温阶段，GF组菌剂的外貌形态除颜色外并无明显改变；高温期结束后，在堆体中已无法观察到颗粒态的菌剂，说明菌剂的外包结构已被破坏(海藻酸钠和可溶性淀粉已被降解)，致使微生物暴露入体系中，菌剂中的微生物的繁殖提升了堆肥温度，并加速了堆肥进程[25-26]。
随着堆肥进程深入，堆体中有机质不断消耗，呈现下降趋势(见图9(b))。随着微生物的增长繁殖，进入高温期后，有机质以较高速率降解；高温期结束时，降解速度减缓。由图9(b)可知，与放置3个月的液态菌剂相比，PF组和GF组表现出更佳的处理效果，说明与放置3个月失活的液态菌剂相比，固态菌剂存活率更能得以保证，特别是包埋后的GF组菌剂，其处理效果更佳。在堆肥后期(14~28 d)，GF组菌剂的处理效果出现较大幅度下降。其原因可能是：由于此时颗粒态菌剂外表已完全降解，菌剂已全部释放，进一步促进了堆体中有机质的降解。
2.3.2. 堆体腐熟度的变化
堆肥过程中堆体腐殖质的变化可衡量堆体的腐熟度。测定堆肥过程中可溶性有机质(dissolved organic matter，DOM)各成分的变化，并进行了区域积分(荧光区域积分)，结果如图10和表5所示。
在整个堆肥过程中，蛋白质的质量分数从初始的13.60%~18.13%，降至2.93%~3.88%(0~7 d)，说明高温期是蛋白质降解的主要时期。堆肥结束后，蛋白质的质量分数低至0~0.73%。腐殖酸的质量分数由最初的30.37%~33.81%增至80.43%~83.18%。与CK组相比，PF、GF处理组的微生物溶解产物较少且腐殖物质(富里酸和腐殖质)含量较高，说明添加微生物菌剂可促进堆肥的腐殖化过程。而GF处理组效果更佳说明包埋微生物菌剂在3个月后能发挥更好的作用。
2.3.3. 种子发芽指数的变化
种子发芽指数(germination index，GI)是衡量堆体中是否存在毒性物质的参数之一，也被认为是判断堆肥是否腐熟的间接指标[27]。研究表明，当种子GI达到50%时，可认为堆肥产品的植物毒性在可忍耐的水平；当种子GI达到80%时，可认为堆肥已达到无毒水平，堆肥已经腐熟[27]。由图11可知，3个处理组的种子GI均大于80%，由此可判断本研究的堆体已腐熟，且因为植物毒性低、堆肥效果较好。
2）对制备的固态菌剂D、Q进行了产品质量分析，结果表明：初始及3个月后的各项指标均符合国家农用微生物菌剂国家标准(GB 20287-2006)，且对保存温度研究发现，制备的固态菌剂更适宜放置在阴凉干燥环境中。
3）对制备菌剂进行了品质监控，发现菌剂稳定性及存活率均处于较高水平。对菌渣堆肥效果验证表明，与添加液态菌剂M组相比，添加D、Q的2组堆体更早进入高温期，堆体启动较快，且高温期持续时间更长；有机质降解率、最终产品质量更高。上述结果说明，利用“吸附-包埋”技术制备固态菌剂在农用领域是可行的且效果较好，可为今后微生物菌剂的制备提供参考。
参考文献
