颜晶晶¹, 蔡青波², 郭峰睿¹, 刘颖¹, 张业¹
1. 河北中石油中心医院, 河北 廊坊 065000;
2. 廊坊市人民医院, 河北 廊坊 065000
2020-08-28 收稿, 2020-12-29 录用
基金项目: 河北省廊坊市科学技术研究与发展计划自筹经费项目（2017013046）资助
^*通讯作者: 张业

摘要: 本文探讨了虚拟导航超声支气管镜灌洗液微小RNA（miRNA）在不同大体分型肺癌患者体内的表达差异及诊断周围型肺癌（PLC）的效能。选取65例中心型肺癌（CLC）患者（中心型组）及65例PLC患者（周围型组），均检测miR-1260b、miR-135a-3p、miR-299-3p、miR-3175及癌胚抗原（CEA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）表达。周围型组miR-1260b低于中心型组，miR-135a-3p、miR-3175高于中心型组（P < 0.05）；miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175与CEA、NSE相关，且与PLC显著相关（P < 0.05）；miR-1260b、miR-135a-3p联合诊断PLC的AUC高于单独诊断；miR-1260b、miR-135a-3p、miR-299-3p、miR-3175联合诊断PLC转移的效能高于单独诊断。故可知PLC和CLC患者虚拟导航超声支气管镜灌洗液中miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175表达存在差异，联合检测对PLC具有重要诊断价值。而且miR-1260b、miR-135a-3p、miR-299-3p、miR-3175联合检测可预测PLC转移，为临床诊治提供依据。
关键词: 虚拟支气管镜导航支气管超声导向鞘周围型肺癌中心型肺癌灌洗液微小RNA
Study on the Difference of MicroRNA Expression in Lavage Fluid of Virtual Navigation Ultrasound Bronchoscopy in Patients with Different Types of Lung Cancer and the Diagnostic Efficacy in Peripheral Lung Cancer
YAN Jingjing¹, CAI Qingbo², GUO Fengrui¹, LIU Ying¹, ZHANG Ye¹
1. Hebei Petrochina Central Hospital, Langfang 065000, Hebei, P. R. China;
2. Langfang People's Hospital, Langfang 065000, Hebei, P. R. China
^*Corresponding author: ZHANG Ye
Abstract: This study aimed to investigate the differences in the expression of microRNA (miRNA) in lavage fluid of virtual navigation ultrasound bronchoscopy in patients with different types of lung cancer and the diagnostic efficacy in peripheral lung cancer (PLC). There were 65 patients with central lung cancer (CLC) (central group) and 65 patients with PLC (peripheral group) who were selected. The expressions of miR-1260b, miR-135a-3p, miR-299-3p, miR-3175 in lavage fluid were detected, as well as the expression of carcinoembryonic antigen (CEA) and neuron-specific enolase (NSE). The miR-1260b of the peripheral 273group was lower than that of the central group, and the miR-135a-3p and miR-3175 were higher than that of the central group (P < 0.05). miR-1260b, miR-135a-3p, miR-3175 were related to CEA and NSE, and significantly related to PLC (P < 0.05). The AUC of miR-1260b and miR-135a-3p combined diagnosis of PLC was higher than that of single diagnosis. The combined diagnosis efficiency of miR-1260b, miR-135a-3p, miR-299-3p, and miR-3175 was higher than any single one. Therefore, it can be seen that miR-1260b, miR-135a-3p, and miR-3175 in the lavage fluid of virtual navigation ultrasound bronchoscope for PLC and CLC patients are differentially expressed. Combined detection is of great value for the diagnosis of PLC. In addition, the combined detection of miR-1260b, miR-135a-3p, miR-299-3p, and miR-3175 can predict PLC metastasis and provide a basis for clinical diagnosis and treatment.
Key words: virtual bronchoscopy navigationbronchial ultrasound guide sheathperipheral lung cancercentral lung cancerlavage fluidmicroRNA
肺癌是世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，有报道，2015年我国新发肺癌病例73.3万，死亡病例61.0万^[1], 肺癌患者约75%诊断时已属晚期，5年生存率仅为16.1%^[2], 因此，肺癌早期诊断具有积极意义。纤维支气管镜是诊断肺癌的主要临床方法之一，但肺外周病变是支气管镜检查盲区，难以发现周围型肺癌(peripheral lung cancer，PLC)病灶^{[3, 4]}。虚拟支气管镜导航联合支气管超声导向鞘，同步将气管镜引导至肺周围病变部位，可有效提高PLC的诊断率及诊断效率^[5]。微小RNA(miRNA)是目前肿瘤领域研究热点之一。大量miRNA在基因组上定位于肿瘤相关脆性位点，发挥类似抑癌基因或癌基因的功能，参与肿瘤细胞分化凋亡、侵袭迁移、新生血管生成等病理生理过程^{[6, 7]}。癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是肺癌经典肿瘤标志物。本研究探讨了虚拟导航超声气管镜灌洗液中的miRNA在不同大体分型肺癌患者体内表达差异、其与肺癌经典肿瘤标志物的关系及诊断PLC、判断是否转移的效能。
1 资料与方法1.1 一般资料选取2017年1月~2020年4月我院收治的65例CLC患者，设为中心型组；同期65例PLC患者，设为周围型组。纳入标准：均经细胞学或组织病理学检查明确为肺癌患者；均为初诊患者；常规支气管镜下无法看到病变；患者知晓本研究，已签署同意书。排除标准：合并其他肿瘤；严重呼吸困难；不能控制的高血压(收缩压＞180 mmHg)；严重脏器功能不全；拒绝接受支气管镜检查；对局麻药过敏(如利多卡因、丁卡因)。本研究经我院伦理委员会审批通过。
1.2 方法术前均行胸部64排螺旋CT扫描，参数：0.5 mm准直，120 kV，螺距0.9，双探测器，螺旋时间0.5 s，层厚1 mm，通过重建获得轴向CT图像。将螺旋CT扫描的数字图像通信医学数据(DICOM)导入DirectPath系统，生成合适引导路径。患者术前禁水4 h，禁食8 h，2%利多卡因雾化吸入局麻。经一侧鼻孔置入奥林巴斯BF-P260F型支气管镜至目标支气管，经活检管道置入带鞘管超声探头，获得满意超声图像。固定鞘管并退出超声探头，实施肺泡灌洗操作，收集灌洗液，离心10 min(3000 r/min)，采集上清液。CEA和NSE采用Roche E170全自动化学发光免疫分析仪测定。采用TRIzol法提取灌洗液中RNA，纯化后测定RNA浓度(NanoDropND-1000分光光度仪)，检测RNA完整性(电泳法)，A260/A280＞1.8，根据丹麦Exiqon公司方法进行RNA标记和杂交。采集芯片，用GenePix Pro 6.0软件读取芯片并扫描图像，提取探针信号值，合并相同探针取中值，保留信号值均≥30.0的探针，中值标准化，筛选差异表达探针，筛选标准：表达差异倍数变化＞1.5且P＜0.05，绘制火山图。用PCR法检测miR-1260b、miR-135a-3p、miR-299-3p和miR-3175表达量，用2^-ΔΔCT表示。
1.3 观察指标(1) 两组患者一般资料，灌洗液miRNA含量。
(2) 灌洗液miRNA与经典肿瘤标志物的相关性。
(3) miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175与PLC相关性。
(4) 灌洗液miRNA诊断PLC的效能。
(5) 按PLC是否转移进行分组，分析患者灌洗液miRNA表达。
(6) 评估PLC是否转移的ROC曲线。
(7) 诊断流程图。
1.4 统计学方法采用统计学软件SPSS 22.0处理数据，计数资料以n描述，计量资料采取Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov正态性检验，均确认具备方差齐性且近似服从正态分布，以(x±s)描述；相关性分析采用Pearson相关系数模型；诊断效能、转移预测效能分析采用受试者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线，获取曲线下面积(AUC)、置信区间、敏感度、特异度及cut-off值；联合预测实施Logistic二元回归拟合，返回预测概率logit(p)，将其作为独立检验变量。均采用双侧检验，α=0.05。
2 结果2.1 两组患者一般资料及灌洗液miRNA比较两组患者年龄45~86岁，组间年龄、性别、体质量指数、分化程度、肿瘤TNM分期、转移情况及miR-299-3p比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；周围型组灌洗液中miR-1260b低于中心型组，miR-135a-3p、miR-3175高于中心型组(P＜0.05)。见表 1。
表1

表 1 两组患者一般资料和灌洗液miRNA比较 临床资料 周围型组(n=65) 中心型组(n=65) t/u/χ2 P 年龄/岁 66.07±9.88 65.89±10.04 0.103 0.918 性别 ??男 35(53.85%) 39(60.00%) 0.502 0.479 ??女 30(46.15%) 26(40.00%) 体质量指数 ??正常 25(38.46%) 23(35.38%) 0.051 0.959 ??超重 26(40.00%) 30(46.15%) ??肥胖 14(21.54%) 12(18.46%) 分化程度 ??低分化 7(10.77%) 9(13.85%) 0.538 0.591 ??中分化 21(32.31%) 22(33.85%) ??高分化 37(56.92%) 34(52.31%) 肿瘤TNM分期 ??Ⅰ 14(21.54%) 16(24.62%) 0.376 0.707 ??Ⅱ 20(30.77%) 18(27.69%) ??Ⅲ 19(29.23%) 22(33.85%) ??Ⅳ 12(18.46%) 9(13.85%) 转移 ??是 25(38.46%) 22(33.85%) 0.300 0.584 ??否 40(61.54%) 43(66.15%) miR-1260b 0.58±0.23 1.04±0.49 6.851 ＜0.001 miR-135a-3p 1.39±0.47 0.46±0.11 15.533 ＜0.001 miR-299-3p 0.79±0.20 0.81±0.22 0.542 0.589 miR-3175 1.15±0.44 0.55±0.23 9.743 ＜0.001

表 1 两组患者一般资料和灌洗液miRNA比较

2.2 灌洗液miRNA与经典肿瘤标志物的相关性周围型组CEA高于中心型组，NSE低于中心型组(P＜0.05)；miR-1260b与CEA、NSE呈负相关，miR-135a-3p、miR-3175与CEA和NSE呈正相关；且各灌洗液miRNA的相关性系数r，周围型组均大于中心型组(P＜0.05)。见图 1、图 2和表 2。
图 1

图 1 两组患者CEA比较

图 2

图 2 两组患者NSE比较

表2

表 2 相关性参数 指标 CEA NSE r P r P 周围型组 ??miR-1260b -0.789 ＜0.001 -0.611 ＜0.001 ??miR-135a-3p 0.804 ＜0.001 0.725 ＜0.001 ??miR-3175 0.815 ＜0.001 0.768 ＜0.001 中心型组 ??miR-1260b -0.637 ＜0.001 -0.584 ＜0.001 ??miR-135a-3p 0.726 ＜0.001 0.697 ＜0.001 ??miR-3175 0.739 ＜0.001 0.705 ＜0.001

表 2 相关性参数

2.3 偏相关性分析将肿瘤TNM分期、是否转移等其他因素控制后，miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175仍与PLC显著相关(P＜0.05)，见表 3。
表3

表 3 偏相关性分析 自变量 β SE β(标准化) t P 常量 13.083 miR-1260b -0.703 0.041 -0.715 10.342 ＜0.001 miR-135a-3p 0.835 0.035 0.879 11.183 ＜0.001 miR-3175 0.749 0.029 0.715 9.054 ＜0.001

表 3 偏相关性分析

2.4 灌洗液miRNA诊断PLC的效能图 3为灌洗液miRNA诊断PLC的ROC曲线，由图可知miR-1260b诊断PLC的AUC为0.751，miR-135a-3p诊断PLC的AUC为0.814，miR-3175诊断PLC的AUC为0.800，各指标联合诊断PLC的AUC为0.899，详见表 4。
图 3

图 3 灌洗液miRNA诊断PLC的ROC曲线

表4

表 4 灌洗液miRNA诊断PLC的ROC曲线分析结果 项目 AUC 95%CI Z统计 P cut-off值 敏感性/% 特异性/% miR-1260b 0.751 0.667~0.835 5.828 ＜0.001 ≤1 95.38 44.62 miR-135a-3p 0.814 0.739~0.889 8.178 ＜0.001 ＞0.95 73.85 83.08 miR-3175 0.800 0.724~0.876 7.699 ＜0.001 ＞0.96 66.15 83.08 联合 0.899 0.849~0.950 15.442 ＜0.001 89.23 76.92

表 4 灌洗液miRNA诊断PLC的ROC曲线分析结果

2.5 PLC转移/未转移患者灌洗液miRNA表达比较PLC转移患者灌洗液中miR-1260b、miR-299-3p低于未转移患者，miR-135a-3p、miR-3175高于未转移患者(P＜0.05)。见表 5。
表5

表 5 PLC是否转移患者灌洗液miRNA表达比较 miRNA 转移(n=25) 未转移(n=40) t P miR-1260b 0.35±0.11 0.72±0.24 7.232 ＜0.001 miR-135a-3p 2.13±0.40 0.93±0.41 11.587 ＜0.001 miR-299-3p 0.52±0.19 0.96±0.24 7.764 ＜0.001 miR-3175 1.68±0.37 0.82±0.25 11.192 ＜0.001

表 5 PLC是否转移患者灌洗液miRNA表达比较

2.6 评估PLC是否转移的ROC曲线图 4为灌洗液miRNA评估PLC转移的ROC曲线。miR-1260b评估PLC转移的AUC为0.785，miR-135a-3p评估PLC转移的AUC为0.794，miR-299-3p评估PLC转移的AUC为0.814，miR-3175评估PLC转移的AUC为0.838；各指标联合评估PLC转移的AUC为0.888，高于单独评估。详见表 6。
图 4

图 4 灌洗液miRNA评估PLC转移的ROC曲线

表6

表 6 灌洗液miRNA评估PLC转移的ROC分析结果 CT评估项目 AUC 95%CI Z统计 P cut-off值 敏感性/% 特异性/% miR-1260b 0.785 0.676~0.894 5.116 ＜0.001 ≤0.53 80.00 67.50 miR-135a-3p 0.794 0.677~0.911 4.933 ＜0.001 ＞1.7 64.00 87.50 miR-299-3p 0.814 0.700~0.927 5.415 ＜0.001 ≤0.58 72.00 85.00 miR-3175 0.838 0.735~0.940 6.451 ＜0.001 ＞1.27 64.00 90.00 联合 0.888 0.808~0.967 9.522 ＜0.001 80.00 85.00

表 6 灌洗液miRNA评估PLC转移的ROC分析结果

2.7 诊断流程图以miR-1260b为例绘制诊断流程图如图 5。
图 5

图 5 诊断流程图

3 讨论3.1 研究背景PLC指位于肺段以下支气管直到细小支气管的肺癌，由于其早期无明显症状、不易与其他结节样疾病鉴别、确诊比CLC困难等原因，导致多数PLC患者诊断时已属中晚期^{[8, 9]}。因此，早期诊治对改善PLC预后尤为关键。
3.2 虚拟导航超声气管镜对PLC诊断价值病理学检查是肺外周病变临床诊断金标准^[10]，经纤维支气管镜肺活检已成为诊断肺癌的主要手段之一。而肺外周病变超出支气管镜可视范围，镜检阳性率仅30%左右，灌洗及痰检阳性率亦不高^[11]。导向鞘引导的超声支气管镜可获得支气管树、周围肺实质及纵膈结构的可视化图像，弥补了普通支气管镜无法观察管壁及临近组织结构的不足^[12]。虚拟导航支气管镜系统利用计算机软件处理患者胸部CT扫描图像，得到虚拟肺部三维可视化模型，与电子支气管镜视频同步将气管镜引导至肺周围病变部位^[13]。方芳^[14]研究显示，虚拟导航超声气管镜可显著缩短确认病灶位置的时间，且未增加并发症。李士杰等^[15]研究表明，虚拟导航超声气管镜引导肺活检，肺周围型病变显像率89.3%，明确诊断率73.5%，恶性病变诊断率82.5%。
3.3 miRNA与肺癌发生发展的相关性及CLC、PLC患者灌洗液中miRNA表达差异miRNA是一类广泛存在于真核生物中的相对分子质量较小的非编码蛋白RNA分子。人类基因组中，miRNA占比仅1%~3%，但却调控30%以上蛋白编码基因表达^[16]。据统计，已发现的miRNA中，约50%编码基因位于肿瘤相关脆性位点或基因区域，可能在肿瘤发生发展中发挥重要作用^[17]。Hou等^[18]研究发现，miR-155表达增高可促进肺癌细胞系A549增殖，并抑制叉头框蛋白1(FoxO1)表达，进而刺激活性氧(ROS)产生。Li等^[19]研究显示，弗兰德白血病病毒整合素l(FLI1)通过激活miR-17-92簇发挥促肿瘤形成作用。miR-205、miR-545、miR-25等与肺癌细胞增殖和凋亡相关^{[20, 21]}。本研究在上述研究的基础上探讨了虚拟导航超声气管镜灌洗液miRNA在CLC和PLC患者中的表达差异，以研究二者可能发病机制的差异。本研究数据显示，PLC患者miR-1260b表达较低，miR-135a-3p、miR-3175表达较高，有望通过进一步深入研究上述miRNA从而寻找肺癌靶向治疗新靶点。
3.4 灌洗液中miRNA诊断PLC及是否转移的效能本研究数据显示，miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175与PLC显著相关，且对PLC具有一定诊断价值，尤以联合诊断AUC值最高(达0.899)，进一步显示测定miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175表达可为PLC诊断提供有力参考。肺癌临床病例资料分析发现，PLC总生存期好于CLC^{[22, 23]}。PLC预后由多种因素决定，相关因素有吸烟史、年龄、TNM分期、分化程度、病理类型、淋巴结转移等^[24]。目前研究发现，miRNA(如has-miR-155、miRNA-31等)也能作为肺癌独立预后因素^{[25, 26]}。本研究创新性探讨发现，PLC转移患者的肺泡灌洗液中miR-1260b、miR-299-3p降低，miR-135a-3p、miR-3175升高，且各指标诊断PLC是否转移的AUC值均较高，推测miR-1260b、miR-299-3p可能作为抑癌基因，miR-135a-3p、miR-3175可能作为癌基因，通过控制细胞分化或凋亡途径，参与PLC转移病理过程。同时，各指标联合诊断PLC转移的AUC值为0.888，大于单一诊断，有助于早期检出PLC转移。
此外，miR-1260b与肺癌经典肿瘤标志物CEA和NSE呈负相关，miR-135a-3p、miR-3175与CEA和NSE呈正相关，从侧面表明灌洗液miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175表达可为肺癌患者诊断及预后评估提供有力参考。而各灌洗液miRNA的相关性系数r，周围型组均大于中心型组，考虑与虚拟导航超声气管镜可准确收集PLC病灶部位灌洗液有关，进一步证实虚拟导航超声支气管镜对PLC诊断的应用价值。
综上可知，PLC、CLC患者虚拟导航超声支气管镜灌洗液miR-1260b、miR-135a-3p、miR-3175存在差异表达，联合检测对PLC诊断具有重要价值，而miR-1260b、miR-135a-3p、miR-299-3p、miR-3175联合检测可预测PLC转移，为临床诊治提供依据。

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