南通大学附属东台医院 超声科, 江苏 东台 224200
2020-06-19 收稿, 2020-09-04 录用
*通讯作者: 刘福娟
摘要: 本研究选取了分化型甲状腺癌（DTC）患者106例为甲状腺癌组，同期106例甲状腺腺瘤患者为甲状腺腺瘤组，检测比较了两组患者的超声弹性成像参数（弹性比值、蓝色面积比值）、血清中期因子（midkine，MK）、血管内皮生长因子（VEGF）水平。研究结果发现，弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平与DTC患者淋巴结转移、包膜侵犯、临床分期相关（P < 0.05）；弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平联合诊断DTC的曲线下面积（AUC）为0.888；弹性比值、蓝色面积比值、血清MK及VEGF水平与DTC患者组织中趋化因子受体（CXCR）4、解聚素金属蛋白酶（ADAM）9、靶向Xklp2靶蛋白（TPX2）基因表达量呈正相关，与程序性细胞死亡因子（PDCD）4基因表达量呈负相关。这些结果提示超声弹性成像参数、血清MK及VEGF水平上调可能用来评估DTC患者病情程度及肿瘤恶性程度，三者联合对DTC具有可靠诊断价值，可为临床诊治提供参考。
关键词: 超声弹性成像参数中期因子血管内皮生长因子分化型甲状腺癌肿瘤恶性程度受试者工作特征曲线
The Efficacy of Ultrasound Elastography Parameters Combined with Serum MK and VEGF in the Diagnosis of Differentiated Thyroid Cancer and the Relationship with the Malignant Degree of Tumor
XU Linxia, WANG Suping, XU Guoxia, LIU Fujuan
Department of Ultrasound, Affiliated Dongtai Hospital of Nantong University, Dongtai 224200, Jiangsu, P. R. China
*Corresponding author: LIU Fujuan
Abstract: In this research, 106 patients with DTC were selected as the thyroid cancer group, and 106 patients with thyroid adenoma in the same period were selected as the thyroid adenoma group. The ultrasound elastography parameters (elasticity ratio, blue area ratio), serum midkine (MK) and vascular endothelial growth factor (VEGF) levels of patients in two groups were tested and compared. The study found that the elasticity ratio, blue area ratio, serum MK, and VEGF levels were related to lymph node metastasis, capsule invasion and clinical staging in DTC patients (P < 0.05). The area under the curve (AUC) for the combined diagnosis of DTC by elasticity ratio, blue area ratio, serum MK and VEGF levels is 0.888. In tissues of DTC patients, elasticity ratio, blue area ratio, serum MK and VEGF levels were positively correlated with the expression of chemokine receptor (CXCR) 4, disaggregated metalloproteinase (ADAM) 9 and targeting Xklp2 target protein (TPX2) gene, while negatively correlated with the expression of programmed cell death factor (PDCD) 4 gene. It was suggested that the up-regulation of ultrasound elastography parameters, serum MK and VEGF levels may evaluate the condition of patients with DTC and the degree of tumor malignancy. The combination of the three has a reliable diagnostic value for DTC and can provide new ideas for clinical diagnosis and treatment.
Key words: ultrasound elastography parametersmidkinevascular endothelial growth factordifferentiated thyroid cancertumor malignancyreceiver operating characteristic curve
甲状腺癌现已成为困扰我国居民健康的重要问题之一，流行病学调查显示，其发病率约占全身恶性肿瘤总人数的1.0%~5.0%，并以每年4.0%的速度呈明显上升趋势[1-3]，而分化型甲状腺癌(diffe-rentiated thyroid carcinoma，DTC)为主要病理分型之一，5年生存率可达97.0%[4, 5]，故早期确诊并治疗成为优化DTC治疗结局的关键。近年来，超声弹性成像参数在恶性肿瘤的临床初步筛查及病情评估方面得到广泛运用，通过比较病变组织与正常组织间的弹性差异，有助于评估病变性质[6, 7]，但其是否能评估DTC病情发展变化过程中的恶性程度尚未明确。另外，随甲状腺癌分子生物学研究的不断深入，细胞因子作用越来越凸显，其中中期因子(midkine，MK)属肝素结合生长因子，参与胚胎发育期细胞生长分化，并在恶性肿瘤组织中呈高表达状态[8]；血管内皮生长因子(VEGF)可能参与肿瘤演变过程，并与甲状腺癌转移、侵袭相关[9]。但关于超声弹性成像参数联合血清MK、VEGF等细胞因子对DTC的诊断价值有待进一步研究。同时，肿瘤细胞的恶性增殖主要与促增殖基因与抗增殖基因表达紊乱有关，其中增殖基因靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)、程序性细胞死亡因子(PDCD)4在诱导癌细胞凋亡中发挥重要作用，而趋化因子受体(CXCR)4、解聚素金属蛋白酶(ADAM)9等侵袭基因异常表达参与肿瘤细胞远处转移与肿瘤恶性程度加重过程。基于此，本研究综合分析了超声弹性成像参数联合血清MK和VEGF对DTC的诊断价值及它们与肿瘤恶性程度的关系。
1 资料和方法1.1 一般资料选取2017年4月~2020年2月我院收治的DTC患者106例为甲状腺癌组，其中女80例、男26例；年龄20~62岁，平均(48.29±3.66)岁；体质量47~63 kg，平均(55.87±2.59)kg；临床分期：64例Ⅰ~Ⅱ期，42例Ⅲ~Ⅳ期；淋巴结转移51例；包膜侵犯33例。另选取同期106例甲状腺腺瘤患者为甲状腺腺瘤组，其中女82例、男24例；年龄40~64岁，平均(47.98±3.40)岁；体质量48~65 kg，平均(56.06±2.77)kg；病理类型：63例滤泡状腺瘤、10例乳头状腺瘤、5例甲状腺囊肿、28例甲状腺腺瘤变性。两组基本资料(年龄、体质量、性别)均衡可比(P＞0.05)。本研究经我院医学伦理委员会审批同意。
1.2 病例选取标准1.2.1 纳入标准(1) 甲状腺癌组均符合DTC诊断标准[10]；均经组织病理学检查确诊为DTC；(2)甲状腺腺瘤组均经组织病理学检查确诊为甲状腺腺瘤；(3)两组临床资料完整，患者意识清楚，无任何沟通障碍，且患者及家属均签署知情同意书。
1.2.2 排除标准(1) 存在颈部局部或全身感染性疾病者；(2)存在甲状腺弥漫性病变、桥本甲状腺炎或甲状腺功能亢进等其他甲状腺疾病者；(3)伴有其他部位恶性肿瘤者；(4)合并肝肾等重要脏器器质性病变者；(5)伴有原发性影响促甲状腺激素水平疾病者；(6)单纯囊性甲状腺结节者；(7)患有感知障碍的精神疾病者。
1.3 方法1.3.1 超声弹性成像检查使用彩色多普勒超声诊断仪(型号Logiq-E9，购自美国GE公司)检查，探头频率为6~15 MHz，配有实时弹性成像技术。患者取仰卧位，完全显露颈部，探头涂抹耦合剂，首先实施常规超声检查，探查甲状腺中结节数量、体积、部位、边界情况、形态及内部回声情况，观察结节内部及周边血流分布情况。后切换至弹性超声成像模式，以结节为中心选取感兴趣区(ROC)，主要包括结节及周围充足正常组织，轻压探头，频率保持在2~4次/s，显示屏“弹簧”图标呈绿色，稳定3~4 s，以获取稳定图像，观察甲状腺病灶。采用机载弹性定量测量分析软件进行弹性成像定量分析，主要由2名具备弹性成像图像分析经验且未参与检查的独立观察者分析图像：(1)弹性比值：在弹性成像图像上手动圈定结节ROC及周围正常组织，保持同一深度、面积，且ROC应包括整个病灶，机载软件自动分析获取弹性图像ROC与周围正常组织对比所得弹性比值。(2)蓝色面积比值：沿结节及其蓝色区域边缘对轮廓进行勾画，软件分析计算蓝色面积所占整个ROC比值。存储并测量3组图像，取平均值。
1.3.2 血清指标检测空腹取4 mL静脉血，3000 r/min离心12 min，分离取血清，置于-80 ℃低温保存。采用酶标仪(型号：Model 680，美国伯乐公司)以酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清MK和VEGF水平，试剂盒购自美国Abcam公司，严格按照试剂盒说明书操作。
1.3.3 组织中侵袭基因和增殖基因表达量检测术中取组织标本，添加Trizol试剂、氯仿裂解细胞，4 ℃下以12000 r/min离心15 min，取无色液相层，添加等体积异丙醇，沉淀RNA生成胶块。采用乙醇(75%)反复清洗RNA沉淀，室温干燥，以紫外光吸收法检测总RNA纯度，以反转录试剂盒合成样品cDNA及RT-PCR试剂盒进行侵袭基因(CXCR4、ADAM9)、增殖基因(TPX2、PDCD4)的mRNA扩增。获取反应后PCR扩增曲线，计算目标基因mRNA表达量。
1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件分析处理数据，计量资料采用(x±s)表示，行t检验进行比较，计数资料用n(%)表示，行χ2检验进行比较。超声弹性成像参数和血清MK及VEGF水平与甲状腺癌组不同病理特征及组织中侵袭基因、增殖基因表达量的关系，采用Pearson进行线性相关性分析。采用受试者工作特征曲线(ROC)分析诊断价值。P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果2.1 两组患者的超声弹性成像参数和血清MK及VEGF水平比较甲状腺癌组患者的病灶弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平都高于甲状腺腺瘤组(P＜0.05)，见表 1。
表1
 表 1 两组患者的超声弹性成像参数、血清MK和VEGF水平比较(x±s)
| 表 1 两组患者的超声弹性成像参数、血清MK和VEGF水平比较(x±s) |
2.2 甲状腺癌组不同病理特征患者的各指标水平比较不同淋巴结转移、包膜侵犯、临床分期的DTC患者病灶弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表 2。
表2
表 2 DTA组不同病理特征患者的各指标水平比较(x±s)
| 表 2 DTA组不同病理特征患者的各指标水平比较(x±s) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3 分析各指标对DTC的诊断价值绘制ROC曲线如图 1所示，应用弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平联合诊断DTC的AUC最大，联合诊断敏感度为80.19%，特异度为86.79%。详见表 3。
图 1
 | 图 1 各指标对DTC的诊断价值 |
表3
表 3 各指标对DTC的诊断价值分析
| 表 3 各指标对DTC的诊断价值分析 |
2.4 两组患者组织中侵袭基因和增殖基因表达量DTC患者组织中CXCR4、ADAM9、TPX2基因表达量高于甲状腺腺瘤组，而PDCD4基因表达量低于甲状腺腺瘤组(P＜0.05)。见表 4。
表4
表 4 两组患者组织中侵袭基因、增殖基因表达量比较(x±s)
| 表 4 两组患者组织中侵袭基因、增殖基因表达量比较(x±s) |
2.5 DTC患者弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平与CXCR4、ADAM9、TPX2、PDCD4表达量的关系根据DTC患者的弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF的ROC最佳截断值将患者进行分组，即弹性比值＞1.65、蓝色面积比值＞51.21%、血清MK＞2.95 ng·mL-1、血清VEGF＞335.52 pg·mL-1为高水平组，反之为低水平组。经检验显示，弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF高水平组DTC患者的CXCR4、ADAM9、TPX2、PDCD4表达量均高于弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF低水平组的DTC患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，详见表 5。
表5
表 5 DTC患者弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平与CXCR4、ADAM9、TPX2、PDCD4表达量的关系(x±s)
| 表 5 DTC患者弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平与CXCR4、ADAM9、TPX2、PDCD4表达量的关系(x±s) |
2.6 各指标水平与DTC患者组织中侵袭基因、增殖基因表达量关系Pearson线性相关分析发现，弹性比值、蓝色面积比值、血清MK和VEGF水平与DTC患者组织中CXCR4、ADAM9、TPX2基因表达量呈正相关，与患者PDCD4基因表达量呈负相关(P＜0.05)。详见表 6。
表6
表 6 各指标水平与DTC患者组织中侵袭基因、增殖基因表达量的关系
| 表 6 各指标水平与DTC患者组织中侵袭基因、增殖基因表达量的关系 |
3 讨论目前临床尚未完全明确DTC发病机制，多项研究认为[11-13]，其与癌症基因、生长因子、遗传等因素有关。病理组织活检是现阶段国内外公认的DTC诊断“金标准”，但其属有创性操作，存在一定局限性。因此积极寻找合理有效的早期预警诊断手段是目前临床研究主要方向。
国外研究显示[14, 15]，肿瘤中新毛细血管形成、新生血管管壁薄弱、结构不完整、基底膜变薄或缺少、肿瘤细胞穿透性增高等是肿瘤快速生长与转移的重要原因。本研究结果表明，在DCT发生、发展过程中，存在血清MK和VEGF水平异常高表达，并与DTC患者局部侵犯、淋巴结转移及临床分期存在正相关关系，这可能与血清MK和VEGF高表达一定程度会刺激血管内皮细胞增殖，加速肿瘤组织新生血管形成，进一步抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和上皮间充质转化及细胞迁徙有关。由此推测阻断血清MK和VEGF水平表达可能是减少肿瘤新生血管形成、抑制DTC患者肿瘤细胞生长的重要环节。通过绘制ROC曲线还发现，血清MK和VEGF对DTC具有较高诊断价值，提示血清MK和VEGF有望成为鉴别与诊断甲状腺良/恶性疾病的辅助指标，为临床治疗提供有效靶点。另外，Zhang等[16]研究表明，肿瘤细胞促增殖基因与抗增殖基因表达紊乱可导致结节迅速扩大并对周围组织、脏器产生压迫，检测其含量可反映肿瘤细胞增殖活性。Atala[17]研究还发现，侵袭相关基因异常表达是肿瘤远处转移的分子学机制之一，检测其含量可客观反映肿瘤细胞侵袭活性及肿瘤恶性程度。本研究表明，血清MK和VEGF水平高表达可能会增加DTC患者组织中CXCR4、ADAM9、TPX2基因表达量，抑制PDCD4基因表达量。说明DTC患者机体对肿瘤细胞抑制能力减弱，肿瘤细胞生长能力增加。故未来研究方向准备进一步明确血清MK和VEGF水平作为治疗靶目标的可行性。
超声弹性成像作为新型超声检查手段，能有效弥补常规超声无法对病变部位定位及鉴别的缺陷，通过测定超声反射回波在不同组织中的差异[18]，采用灰阶或彩色方法对所得结果进行编码，可有效实现对目标组织硬度的定量化显示，有助于准确评估不同组织细微硬度差异，减少评分法所致主观因素的影响。徐丹凤等[19]研究显示，甲状腺癌组织、甲状腺良性肿瘤及甲状腺正常组织弹性系数各不相同，有助于区分甲状腺病变情况。在此基础上，本研究通过超声弹性成像检查可知，DTC患者弹性比值、蓝色面积比值较高，并随淋巴结转移、包膜侵犯、临床分期增加出现增长趋势，推测机制在于病灶内肿瘤细胞过度增殖，导致病灶组织硬度改变，进而造成DTC患者局部区域弹性比值、蓝色面积比值上升，从而增加复发及远处转移风险。另外，经Pearson线性相关分析，弹性比值、蓝色面积比值与DTC患者组织中CXCR4、ADAM9、TPX2、PDCD4基因表达量存在一定相关性，说明超声弹性参数一定程度上可反映增殖基因、侵袭基因表达情况，因此可对DTC恶性程度进行有效评估。但弹性比值、蓝色面积比值诊断DTC的效果有限，故本研究尝试联合超声弹性成像参数、血清MK和VEGF对DTC进行诊断，由ROC曲线表明，三者联合可为临床提供准确度较高的诊断。
综上可知，超声弹性成像参数、血清MK和VEGF水平上调可评估DTC患者病情程度及肿瘤恶性程度，三者联合对DTC具有可靠诊断价值，可为临床诊治提供参考。
参考文献
| [1] | 张腾, 宋丽萍, 赵腾, 等. 淋巴结转移对分化型甲状腺癌手术及~(131)I治疗后血清甲状腺球蛋白抗体转阴的影响[J]. 中国医学科学院学报, 2017, 39(4): 87-91. |
| [2] | 温琥玲, 谢建平, 林师宇, 等. 血清癌胚抗原、甲状腺球蛋白及半乳凝集素-3水平在甲状腺癌鉴别诊断中的价值[J]. 分子诊断与治疗杂志, 2019, 11(1): 58-62. |
| [3] | 刘媛超, 丁汉, 王义增, 等. 甲状腺癌AJCC/TNM分期系统第8版与第7版在分化型甲状腺癌诊治中应用比较[J]. 中国实用外科杂志, 2018, 38(6): 639-642. |
| [4] | Moon J H, Kim K M, Oh T, et al. The effect of TSH suppression on vertebral trabecular bone scores in patients with differentiated thyroid carcinoma[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2017, 102(1): 78-85. |
| [5] | De Mingo Dominguez M L, Guadalix Iglesias S, et al. Low trabecular bone score in postmenopausal women with differentiated thyroid carcinoma after long-term TSH suppressive the-rapy[J]. Endocrine, 2018, 62(1): 166-173. DOI:10.1007/s12020-018-1671-8 |
| [6] | 张鹏, 李小宇, 刘海静, 等. 甲状腺良恶性结节超声弹性成像特征及定量参数分析[J]. 临床超声医学杂志, 2017, 19(12): 816-819. DOI:10.3969/j.issn.1008-6978.2017.12.009 |
| [7] | 敖丽君, 张英霞. 超声弹性成像技术在甲状旁腺疾病中的应用进展[J]. 中国医学影像技术, 2020, 36(2): 307-310. |
| [8] | 孟召伟, 谭建, 张桂芝, 等. 血清midkine测定在分化型甲状腺癌诊断和预后评价中的价值[J]. 中华核医学与分子影像杂志, 2015, 35(3): 177-181. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2015.03.005 |
| [9] | Aydln K, Ers?z Gül?elik N, Tuncel M, et al. Thyroid vo-lumes and serum VEGF levels in dyslipidemic patients:effect of statin[J]. Turkish Journal of Medical Sciences, 2019, 49(3): 738-745. DOI:10.3906/sag-1708-106 |
| [10] | Haugen B R, Alexander E K, Bible K, et al. 2015 American thyroid association management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer:the American thyroid association guidelines task force on thyroid nodules and differentiated thyroid cancer[J]. Thyroid, 2016, 26(1): 1-133. DOI:10.1089/thy.2015.0020 |
| [11] | Liu Z, Sun M, Xiao Y, et al. Predictors of metastasis to lymph nodes posterior to the right recurrent laryngeal nerve in differentiated thyroid carcinoma:a prospective study[J]. Asian Journal of Surgery, 2017, 40(4): 270-277. DOI:10.1016/j.asjsur.2015.12.003 |
| [12] | Yin D T, Lei M, Xu J, et al. The Chinese herb Prunella vulgaris promotes apoptosis in human well-differentiated thyroid carcinoma cells via the B-cell lymphoma-2/Bcl-2-associated X protein/caspase-3 signaling pathway[J]. Oncology Letters, 2017, 14(2): 1309-1314. DOI:10.3892/ol.2017.6317 |
| [13] | Liu Y, Chen T Y, Yang Z Y, et al. Identification of hub genes in papillary thyroid carcinoma:robust rank aggregation and weighted gene co-expression network analysis[J]. Journal of Translational Medicine, 2020, 18(1): 170. DOI:10.1186/s12967-020-02327-7 |
| [14] | Song Y S, Kim M J, Sun H J, et al. Aberrant thyroid-stimulating hormone receptor signaling increases VEGF-A and CXCL8 secretion of thyroid cancer cells, contributing to angiogenesis and tumor growth[J]. Clinical Cancer Research, 2019, 25(1): 414-425. DOI:10.1158/1078-0432.CCR-18-0663 |
| [15] | Kilic I, Guldiken S, Sipahi T, et al. Investigation of VEGF and IL-8 gene polymorphisms in patients with differentiated thyroid cancer[J]. Clinical Laboratory, 2016, 62(12): 2319-2325. |
| [16] | Zhang S, Liu Q, Zhang Q, et al. MicroRNA-30a-5psuppresses proliferation, invasion and tumor growth of hepatocellular cancer cells via targeting FOXA1[J]. Oncology Letters, 2017, 14(4): 5018-5026. DOI:10.3892/ol.2017.6745 |
| [17] | Atala A. Re:prostate cancer-associated SPOP mutations confer resistance to BET inhibitors through stabilization of BRD4[J]. Journal of Urology, 2018, 199(4): 895-896. |
| [18] | Nell S, Kist J W, Debray T P, et al. Qualitative elastography can replace thyroid nodule fine-needle aspiration in patients with soft thyroid nodules. A systematic review and meta-analysis[J]. European Radiology, 2015, 84(4): 652-661. DOI:10.1016/j.ejrad.2015.01.003 |
| [19] | 徐丹凤, 王志利, 刘洋, 等. 超声弹性成像对甲状腺良恶性结节的诊断价值[J]. 实用医学杂志, 2019, 35(6): 141-145. |
