黄海清^1,2, 肖赛金^1,2, 杨光赵耀¹, 赵家辉¹
1. 东华理工大学 核资源与环境省部共建国家重点实验室培育基地, 江西 南昌 330013;
2. 东华理工大学, 化学生物与材料科学学院, 江西 南昌 330013
2020-06-01 收稿, 2020-07-23 录用
基金项目: 江西省自然科学基金（20161BAB213090）和核资源与环境国家重点实验室开放基金（NRE1314）
^*通讯作者: 肖赛金

摘要: 以MoS₂和H₂O₂为原料，采用室温"一锅法"制备具有荧光性的氧化钼量子点（MoO_x QDs）。以MoO_x QDs为荧光探针，Cu²⁺为猝灭剂，构建了无标记"off-on"型ATP荧光检测。在pH为7.5，50 mol/L Cu²⁺，0.051 mg/mL MoO_x QDs的最优条件下，ATP浓度在25~250 mol/L时，520 nm处荧光强度会随ATP浓度增大而增强，且荧光强度与ATP浓度呈良好的线性关系，F=785.40+9.05c，R=0.993；BSA、Ni²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ca²⁺等共存对ATP产生的干扰小。因此，"off-on"型MoO_x QDs-Cu²⁺检测平台可实现ATP的快速半定量检测，测试灵敏性高，稳定性好。
关键词: 三磷酸腺苷氧化钼量子点铜离子荧光探针
Label-free and Rapid Detection of ATP Based on Molybdenum Oxide Quantum Dots
HUANG Haiqing^1,2, XIAO Saijin^1,2, YANG Guangzhaoyao¹, ZHAO Jiahui¹
1. State Key Laboratory Breeding Base of Nuclear Resources and Environment, East China University of Technology, Nanchang 330013, Jiangxi, P. R. China;
2. School of Chemistry, Biology and Material Science, East China University of Technology, Nanchang 330013, Jiangxi, P. R. China
^*Corresponding author: XIAO Saijin
Abstract: Molybdenum oxide quantum dots (MoO_x QDs) with excellent fluorescence performance were synthesized using MoS₂ and H₂O₂ as the raw materials by a one-pot method at the room temperature. Based on the fluorescence "off-on" mode, a new rapid fluorescence detection of ATP was constructed, in which MoO_x QDs was a fluorescent probe and Cu²⁺ was a quencher. Under the optimized condition, pH 7.5, 0.051 mg/mL MoO_x QDs and 50 mol/L Cu²⁺, the fluorescence at 520 nm was gradually enhanced with increasing ATP concentration in the range of 25-250 mol/L. The calibration curve was F=785.40+9.05c with the correlation coefficient of 0.993. The coexistence of BSA, Ni²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, Fe³⁺, Co²⁺ and Ca²⁺ has negligible effect on ATP detection. Therefore, the "off-on" detection platform shows rapid and stable for sensing for ATP.
Key words: adenosine triphosphateMoO_x quantum dotsCu²⁺fluorescent probe
三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)是各种活细胞内普遍存在的一种高能化合物，是各种生物活动的直接能量来源，在光合、酶催化、生物合成、DNA复制、细胞呼吸等各种生物过程中，ATP还是一种重要的信号分子^{[1, 2]}，ATP水平的异常变化可用于指示疾病及病变的程度。此外，ATP含量与活细胞数目有着线性关系，可间接表达样品中细菌数量。因此，ATP快速检测可在临床诊断、药物筛选、食品卫生、环境监测等领域发挥重要作用^[3-5]。
目前，已报道的ATP检测方法主要包括电泳分析法^{[6, 7]}、色谱分析法^[8]、光学分析法^[9]和生物传感器法^{[10, 11]}等。其中，光学分析法中的荧光分析在检测生物分子方面显示出独特的优势，有灵敏度高、选择性好等特点，是目前公认的较为理想的检测方法之一。常见的荧光探针有贵金属纳米团簇、有机染料、量子点(QDs)。相比较而言，QDs具有荧光产率高、激发光谱宽、荧光光谱窄的特点，因此QDs的应用受到越来越多的关注，尤其是在化学及生物分析领域。如Tedsana等^[12]将半胱胺修饰CdS量子点(Cys-CdS QDs)的荧光强度与ATP呈正比关系用于ATP的高选择性检测。Shi等^[13]采用Cys-CdTe QDs为荧光团，Zn²⁺为猝灭剂，添加ATP，荧光性能恢复，实现了“off-on”模式的ATP检测。但重金属型量子点因毒性较大，在生物医学尤其是活体检测中难以展开应用^[14]。因此，研究者开始尝试探寻低毒或无毒性的量子点。如胡先运等^[15]以氧化石墨烯(GO)为猝灭剂，ATP适配体标记InP/ZnS量子点(ABA-QDs)，通过GO与ABA-QDs之间的长程共振能量转移(LrRET)，对ATP进行检测。Xiong等^[16]用MPA-Mn:ZnS QDs为荧光探针，采用ATP适配体为猝灭剂，实现生物体液中ATP的检测。但是，这些量子点荧光探针的合成过程要求严格，工艺偏复杂，且制备成本偏高。
氧化物钼是一种过渡金属半导体，其自然资源丰富、价廉、低毒，且有独特的电子、光学和力学性能^{[17, 18]}；在气体传感、催化剂、光致变色等领域备受关注^[19-21]。本课题组采用常温一步法制备出低毒性的荧光氧化钼量子点(MoO_x QDs)，目前已将基于MoO_x QDs的荧光探针用于对卡托普利、2, 4, 6-三硝基苯、乙酰胆碱酯酶的快速检测^{[22, 23]}。本文以MoO_x QDs为荧光探针，Cu²⁺为荧光猝灭剂，建立一种简单、快速、高灵敏的ATP检测方法。
1 实验部分1.1 试剂与仪器寡三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞嘧啶(CTP)、牛血清白蛋白(BSA)，上海生工生物工程有限公司；二硫化钼粉末(MoS₂)，美国Sigma-Aldrach公司；氢氧化钠(NaOH)、30%双氧水(30% H₂O₂)、浓盐酸(HCl)、氯化铜(CuCl₂)、乙二胺四乙酸二胺(EDTA)、硫酸铁[Fe₂(SO₄)₃]、氯化钙(CaCl₂)、氯化镍(NiCl₂)、氯化钴(CoCl₂)、硫酸锰(MnSO₄)，均购于西陇化工股份有限公司；磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、焦磷酸钠，国药集团化学试剂有限公司；Tris缓冲液(C₄H₁₁O₃)，美国Solarbio公司。实验中所用试剂均为分析纯，使用前未经纯化，所有溶液均采用二次蒸馏水配制。
JEM-2010透射电子显微镜(日立公司，日本)，USB-4000荧光分光光谱仪(海洋光谱，美国)，F-7000荧光分光光度计(日立公司，日本)。
1.2 实验方法1.2.1 氧化钼荧光量子点的制备氧化钼荧光量子点(MoO_x QDs)的制备方法参考文献[22]。200 mg MoS₂粉末和16 mL 30% H₂O₂、6 mL H₂O在40 ℃水浴反应4 h，加入NaOH调至pH中性，然后8000 r/min离心10 min，所得上清液即为氧化钼荧光量子点。
1.2.2 Cu²⁺对MoO_x QDs荧光猝灭的影响在离心管中加入20 L 1 mg/mL MoO_x QDs溶液、40 L 50 mmol//L Tris-HCl缓冲溶液、不同体积的1 mmol/L CuCl₂溶液，最后用去离子水定容至400 L，充分振荡后静置，10 min后在405 nm下测定溶液荧光光谱。
在离心管中加入20 L 1 mg/mL MoO_x QDs溶液、40 L 50 mmol/L Tris-HCl，20 L 1 mmol/L CuCl₂溶液，以及不同体积的1 mmol/L EDTA溶液，最后用去离子水定容至400 L，充分振荡后静置，10 min后在405 nm下测定溶液荧光光谱。
1.2.3 ATP测定方法在离心管中加入20 L 1 mg/mL MoO_x QDs溶液、40 L 50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液、20 L 1 mmol/L CuCl₂溶液，以及不同浓度ATP溶液，最后用去离子水定容至400 L，充分振荡后静置，10 min后在405 nm下测定溶液荧光光谱，用520 nm处最强发射峰的荧光强度(FL)定量分析ATP含量。
2 结果与讨论2.1 MoO_x QDs的表征通过TEM对MoO_x QDs进行扫描测试可知，合成的MoO_x QDs外貌为类球形，颗粒分散性能较好，粒径分布范围较窄，平均粒径约为1.7 nm(见图 1)。
图 1

图 1 MoOx QDs的TEM图(A)和粒径分布图(B)

在307~447 nm不同激发光照射下，MoO_x QDs均具有很强的荧光发光性能(图 2)，且在367nm激发波下，于495 nm处产生最强的荧光信号；不同激发光下，发射峰位置随着激发波长变长而发生红移，说明MoO_xQDs的荧光性能具有连续性和可调性。本文合成量子点的基本荧光性能与文献[22]报道基本吻合。
图 2

图 2 不同激发光下MoOx QDs荧光发射光谱

2.2 Cu²⁺对MoO_x QDs荧光猝灭的影响为考察Cu²⁺对MoO_x QDs荧光猝灭的动力学特征，研究了Cu²⁺和EDTA共同加入量对荧光强度的影响。图 3显示，Cu²⁺浓度变化不影响荧光发射峰的形状，它们的最大发射波长均在520 nm，这表明Cu²⁺与MoO_x QDs作用不会改变其晶体结构。当[Cu²⁺]为5~50 mol/L时，体系的荧光峰强度会随着Cu²⁺加入量增加而迅速下降(图 3内插图)，35~50 mol/L时，荧光猝灭率可达70%。本试验选择50 mol/L Cu²⁺溶液作为猝灭剂。如图 4，在MoO_x QDs-Cu²⁺体系中继续添加EDTA时，体系的荧光峰强度会随EDTA浓度增大而逐渐增强，即产生荧光恢复。当[EDTA]:[Cu²⁺]=1时，体系荧光强度可恢复到初始的95%以上。说明Cu²⁺对MoO_x QDs的荧光猝灭性是可逆的。
图 3

图 3 Cu2+浓度对MoOx QDs荧光发射光谱的影响 插图为520nm处Cu2+浓度与荧光发射强度关系曲线(实验条件：0.05 mg/mL MoOx QDs，pH 7.5，Cu2+浓度从上到下为0、0.5、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mol/L)

图 4

图 4 EDTA对MoOx QDs-Cu2+荧光发射光谱的影响(实验条件：0.05 mg/mL MoOx QDs，[Cu2+]=50mol/L, pH 7.5, EDTA的浓度从下到上分别为0、12.5、25、37.5、50 mol/L)

Cu²⁺对MoO_x QDs的荧光猝灭作用机理大致为：Cu²⁺通过弱键与MoO_x QDs之间发生结合作用形成了非荧光的基态化合物，产生静态荧光猝灭，即“off”状态。与Cu²⁺能产生强亲和作用的化合物，将Cu²⁺从MoO_x QDs上分离并释放出MoO_x QDs，体系荧光性能得到恢复，即“on”状态。ATP是一种典型的磷酸化合物，其磷酸基团可通过P-O-与Cu²⁺产生强烈作用。向MoO_x QDs-Cu²⁺体系加入ATP时，Cu²⁺会从MoO_x QDs表面分离下来，重新释放量子点，从而使猝灭的荧光性能得到恢复，如图 5所示。基于上述分析，本文构建“off-on”型MoO_x QDs-Cu²⁺检测平台用于ATP检测。
图 5

图 5 检测ATP原理示意图

2.3 ATP的检测一般情况下，检测环境的pH值对检测效果影响很大，为了增强MoO_x QDs-Cu²⁺检测平台的稳定性和选择性，优化检测方法，实验考察了溶液pH值对MoO_xQDs荧光猝灭及荧光恢复的影响。如图 6所示，在弱酸性条件下，荧光强度较低，且酸性越强荧光强度越弱。当pH 7.5时，荧光强度最弱。在pH 8.0~9.5碱性性条件下，荧光强度随碱性的显著增强。这可能是在碱性条件下-OH与Cu²⁺作用的几率增大，从而抑制了Cu²⁺对MoO_xQDs的结合，导致荧光猝灭不完全，甚至无荧光猝灭产生。ATP对MoO_x QDs的荧光恢复性在pH 6.0~9.5时，变化幅度不大。当Cu²⁺与MoO_x QDs的作用完全被抑制时，MoO_x QDs的荧光强度可恢复到初始状态。为使检测的“off-on”过程明显，本试验pH值优化为7.5。
图 6

图 6 pH对MoOx QDs-Cu2+和MoOx QDs-Cu2+/ATP对520 nm处荧光发射性能的影响(实验条件：0.05 mg/mL MoOx QDs，[Cu2+]=50mol/L，或ATP：200mol/L)

如图 7所示，在优化后的实验条件下，荧光强度随着ATP浓度的增大而不断增强；且ATP浓度为25~250 mol/L时，荧光强度(F)与ATP浓度(c，μmol/L)呈现良好的线性关系(图 7插图)，拟合线性方程为F=785.40+9.05c，相关系数R=0.993，该线性使用范围比文献[12]中的20~80mol/L宽。
图 7

图 7 ATP对MoOx QDs-Cu2+荧光发射光谱的影响 插图为520 nm处ATP浓度与荧光发射强度关系曲线(实验条件：0.05 mg/mL MoOx QDs，[Cu2+]=50 mol/L，pH 7.5，ATP浓度自下而上依次为0、25、50、75、100、125、150、175、200、250 mol/L)

为进一步验证MoO_x QDs-Cu²⁺检测平台对ATP荧光检测方法的灵敏性，本文考察了BSA、Ni²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ca²⁺等可能共存物对量子点荧光的影响，见图 8。当干扰物为非磷酸盐化合物时，对应的荧光恢复程度不及ATP的1/10；当干扰物为含磷酸盐的CTP时，其荧光恢复程度仅为ATP的1/2。所以，该检测方法在无磷酸盐干扰时检测灵敏性高，由于该荧光检测的机理主要为离子间键的相互作用，该作用没有方向性，但在含磷酸盐干扰环境下可进行半定量分析。
图 8

图 8 MoOx QDs荧光探针对ATP的选择性(实验条件：0.05 mg/mL MoOx QDs，[Cu2+]=50 mol/L，pH 7.5，ATP：250 mol/L，Ni2+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ca2+、BSA、H2PO4-、HPO42-、PO43-浓度均为500 mol/L)

3 结论本文以MoO_x QDs为荧光探针，Cu²⁺为猝灭剂，构建新型“off-on”荧光传感器用于ATP快速检测，该检测响应时间快，荧光性能强且稳定。在1 mg/mL MoO_x QDs，50mol/L CuCl₂，Tris-HCl缓冲pH 7.5、ATP浓度为25~250 mol/L优化条件时，体系荧光强度与ATP浓度呈线性关系，相关系数为0.993；除含磷酸盐化合物外，该检测方法的抗干扰性高。因此，本文的ATP检测方法具有制备技术简单、性能稳定、检测时间短、灵敏度高，且线性使用范围宽等特点，可为环境及食品等领域的品质评价提供一种新的快捷检测方法。

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