鲁丹, 王丽, 宋凡, 陶菊红, 张大兵, 袁政^*,
上海交通大学生命科学技术学院, 上海 200240
Lu Dan, Wang Li, Song Fan, Tao Juhong, Zhang Dabing, Yuan Zheng^*,
School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
引用本文
鲁丹, 王丽, 宋凡, 陶菊红, 张大兵, 袁政. 水稻基因可选择性多聚腺苷酸化序列的 克隆及生殖发育期表达模式. 植物学报, 2018, 53(5): 594-602

贡献者
* 通讯作者。E-mail: zyuan@sjtu.edu.cn
基金资助
国家七大农作物育种专项(No.2016YFD0101107)、上海市科委基础研究重大重点项目(No.14JC1403901)和国家自然科学基金(No.31470397, No.31671260);
接受日期:2017-06-7接受日期:2017-10-7网络出版日期:2018-09-10
-->Copyright
2018《植物学报》编辑部

---

Contributors
* Author for correspondence. E-mail: zyuan@sjtu.edu.cn

History
Received:Accepted:Online:

---

摘要:可选择性多聚腺苷酸化是真核生物重要的基因调控机制之一, 通过形成不同长度的3'端非翻译区影响信使RNA的稳定性、定位和翻译效率, 从而增加转录本的复杂度。已有研究表明, 拟南芥(Arabidopsis thaliana)中参与DNA去甲基化调控IBM1基因的可选择性多聚腺苷酸化加工受染色质调节因子EDM2调控, 从而影响拟南芥基因组数千基因的CHG甲基化水平, 但该类调控机制是否在其它物种中同样存在仍然未知。以水稻(Oryza sativa)基因组中IBM1同源基因OsJMJ718为研究对象, 利用生物信息学分析和3'RACE实验, 发现IBM1同源基因也存在可选择性多聚腺苷酸化修饰, OsJMJ718基因可能存在9个可选择性多聚腺苷酸化序列。序列比对分析表明, NCBI网站现存日本晴OsJMJ718基因组3'末端序列与9522和明辉63等其它生态型基因组序列组成可能不同。荧光实时定量PCR分析表明, OsJMJ718的9个转录本在水稻生殖发育阶段呈现不同的动态表达模式, 其中TVX5转录本表达量最高。研究获得的OsJMJ718基因可选择性多聚腺苷酸化序列信息及相关的表达模式分析为进一步揭示水稻OsJMJ718基因的可选择性多聚腺苷酸化分子机制和生物学功能奠定了基础。
关键词: 水稻 ; OsJMJ718 ; 可选择性多聚腺苷酸化 ; 3'RACE ; 表达模式

Abstract: Alternative polyadenylation (APA) is one of the important regulatory pathways of eukaryotic gene expression. By forming different lengths of 3' untranslated regions, APA affects the stability, localization and translation efficiency of mRNA and increases the complexity of transcripts. The expression of the Arabidopsis gene increased polyadenylation of BONSAI methylation 1 (IBM1) is regulated by chromatin regulatory factor enhanced downy mildew 2 (EDM2), which can further affect the CHG methylation level of the Arabidopsis thaliana genome. However, whether such regulatory mechanisms exist in other species is unknown. To answer this question, we selected OsJMJ718, an IBM1 homologous gene of rice, for research. By using bioinformatics analysis and 3'RACE experiments, we found that homologous genes of IBM1 also had APA modification. Among them, the OsJMJ718 gene may have 9 alternative polyadenylation sequences. Further sequence alignment analysis revealed that the 3' terminal sequence of OsJMJ718 in the existing Japonica genome in the NCBI database may be different from that of the other ecotype genome sequences, such as 9522 and Minghui 63. Quantitative real-time PCR showed that the 9 transcripts of OsJMJ718 present diverse dynamic expression patterns in different stages of rice reproductive development. The expression of OsJMJ718-TVX5 was higher than that of other transcripts. In summary, this work provides information for APA sequences of OsJMJ718, and the expression pattern analysis of these transcripts would also help further study of the mechanism of APA and biological function of OsJMJ718.

Key words:rice ; OsJMJ718 ; alternative polyadenylation ; 3'RACE ; expression pattern


真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013)。基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012)。多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列。APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014)。近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009)。

拟南芥(Arabidopsis thaliana) IBM1 (Increase in BONSAI Methylation 1)基因最初由Saze等(2008)发现, IBM1编码1个含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶, 催化组蛋白H3K9单甲基和双甲基的去除。IBM1基因突变导致多种发育缺陷, 包括小而窄的叶片、花粉败育、花器官和胚胎发育异常以及繁殖能力下降(Saze et al., 2008; Inagaki et al., 2010)。研究显示, IBM1有2个转录本, 只有编码JmjC结构域的长转录本IBM1-L可以翻译成有功能的IBM1蛋白。而基因组中CG的甲基化是IBM1-L转录本积累所必需的, 它包含1个长度大于2 kb的内含子(拟南芥平均内含子长度为180 bp)。有意思的是, 虽然在产生IBM1-L信使RNA时该内含子会被剪切, 但是野生型基因组中该内含子在CG和CHG区被密集地甲基化。MET1 (ME- THYLTRANSFERASE 1)、CMT3 (CHROMOME- THYLASE 3)及KYP (KRYPTONITE)等参与控制基因组CG和CHG的甲基化水平, 这些基因的突变会导致IBM1-L表达量降低(Rigal et al., 2012)。进一步研究表明, 染色质调节因子EDM2 (Enhanced Downy Mildew 2)识别IBM1异染色质化内含子上的H3K9甲基化标记, 从而促进其转录本3'末端的多聚腺苷酸化, 产生IBM1-L转录本的积累(Lei et al., 2014)。

为探究水稻(Oryza sativa)中是否存在类似拟南芥基因组中的可选择性多聚腺苷酸化修饰机制, 我们以拟南芥IBM1为模板, 通过生物信息学分析获得拟南芥和水稻基因中IBM1同源基因家族及其转录本信息(Sun and Zhou, 2008), 并以OsJMJ718为研究对象, 通过3'RACE实验, 在粳稻9522背景下克隆得到另外3个新的转录本。测序和比对分析表明, TVX8 (OsJMJ718-Transcription Variants X8)和OsJMJ- 718-TVX9的3'末端在NCBI网站提供的粳稻品种日本晴基因组中是不存在的, 但在明辉63 (MH63)基因组中存在(Zhang et al., 2016), 暗示日本晴基因组在该区段组装错误, 或与9522及MH63等生态型基因组的序列组成不同。在生殖发育期进行qRT-PCR分析, 表明OsJMJ718的9个转录本在水稻生殖发育期呈现显著的动态变化, 而OsJMJ718-TVX5相较于其它8个转录本呈现更高的表达水平。该研究为进一步揭示OsJMJ718的生物学功能奠定了重要基础。

1 材料与方法1.1 实验材料实验材料为水稻(Oryza sativa L.)野生型粳稻品种9522。该材料种植于上海交通大学实验田(121.44ºE, 31.03ºN)。

1.2 试剂实验所用Trizol Reagent购自Invitrogen公司。3'RA- CE Kit购自TAKARA clontech公司。SYBR Green Realtime PCR Master MIX购自天根生化科技有限公司。反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser购自TAKARA公司。本研究所需引物(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。DNA测序由华大和桑尼公司提供服务。
表1
Table 1
表1
表1 本研究所用引物 Table 1 Primers used in this research

Primer name	Primer sequence (5′-3′)	Type
qRT-F-TVX1	GAGCTTGGATAGCCCGCCTC	qRT PCR
qRT-R-TVX1	TCTTTTCTTCCCGGGAGTGC	qRT PCR
qRT-F-TVX2	CAATAATTGAACTCTAGGTC	qRT PCR
qRT-R-TVX2	TAAGGAAATACAATCAGATC	qRT PCR
qRT-F-TVX3	ACGGACGCTGGATCGGCGAG	qRT PCR
qRT-R-TVX3	TAACAAGAGCAGTAGAGCAC	qRT PCR
qRT-F-TVX4	ACGGACGCTGGATCGGCGAG	qRT PCR
qRT-R-TVX4	AAGGACGGGGATGCGGCGT	qRT PCR
qRT-F-TVX5	AACGACAACTTTAGGGTTCG	qRT PCR
qRT-R-TVX5	TCGTTACAAGAAAGATGAAC	qRT PCR
qRT-F-TVX6	ATCGAATTGCCACGTAAGCG	qRT PCR
qRT-R-TVX6	TCATCCTCACTCTCTTCTTC	qRT PCR
qRT-F-TVX7	GAACCACAGGGCCAAAGAAG	qRT PCR
qRT-R-TVX7	TAATCCAATTAAAAGTGTTG	qRT PCR
qRT-F-TVX9	AACTCTTCACCACGCGTATG	qRT PCR
qRT-R-TVX9	TAACCGGCGATGGCTGCATC	qRT PCR
qRT-F-TVX11	GAATAAGATGATAATCTATG	qRT PCR
qRT-R-TVX11	ATATCTCTAACTCTACATGC	qRT PCR
3'RACE-F-OsJMJ718	GATTACGCCAAGCTTAGTGAGACCAACAAGGGAGGTGCT	3'RACE

表1
本研究所用引物
Table 1
Primers used in this research



1.3 实验方法1.3.1 水稻花序及组织取材
水稻花序的长度和形态, 以及心皮、浆片、雄蕊、外稃和内稃组织的形态结构参见Itoh等(2005)的描述。取材全程使用无RNase镊子及EP管。材料取下后立即置于液氮中, 或保存于-80°C备用。
1.3.2 水稻RNA提取
RNA抽提采用Liu等(2013)报道的方法。将新鲜水稻组织样品用液氮速冻, 用钢珠充分研磨成粉末后加入800 μL Trizol, 混合均匀后加入200 μL氯仿, 剧烈振荡混匀。4°C 13 523 ×g离心10分钟。吸取400 μL上清转入新的1.5 mL EP管中, 加入与上清等体积的异丙醇, -20°C放置1小时或更长时间以充分沉淀。沉淀完全后, 4°C 13 523 ×g离心5分钟。小心移去上清, 防止沉淀丢失。用70%乙醇洗2次, 每次700 μL, 13 523 ×g离心5分钟。最后, 尽可能吸走上清, 在超净台上将乙醇吹干, 加入30 μL DEPC水溶解, -80°C保存。
1.3.3 反转录获取水稻cDNA
使用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser获取水稻cDNA, 反应体系参照试剂盒(TAKARA, Cat No. RR047A)使用说明书进行。
1.3.4 3'RACE实验
为提取高质量水稻RNA, 使用RACE (rapid-amplifica- tion of cDNA ends)试剂盒中3'-CDS PrimerA及SMARTScribe™ Reverse Transcriptase合成cDNA第1条链。具体操作步骤参照SMARTer^® RACE 5'/3' Kit (TAKARA, Cat No.634858, 634859)。根据序列分析结果, 从OsJMJ718的预测3'端上游300-500 bp处设计1条基因特异性引物(GSP)作为正向引物, 用RACE试剂盒中的UPM作为反向引物。以上述cDNA为模板, 进行PCR扩增。引物序列见表1。将含目的基因片段的PCR产物纯化, In-Fusion连接进入线性化的pRACE载体, 转化DH5α感受态细胞, PCR或者酶切鉴定阳性克隆。测序由桑尼公司完成。使用DNAMAN生物学软件对OsJMJ718的3'端序列进行分析, 并与日本晴、9522和MH63基因组序列进行 比对。
1.3.5 OsJMJ718转录本的序列分析
使用OsJMJ718保守外显子区核酸序列, 在NCBI数据库(National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行BLAST比对, 下载其转录本序列。转录本序列来自网站(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_1002297858)。日本晴基因组序列来源于NCBI数据库。MH63基因组序列来源于RIGW (Rice Information Gateway, http://rice.hzau.edu.cn/rice/)。基因结构分析使用IBS (Illustrator for Biology Sequences)软件。
1.3.6 荧光实时定量PCR
使用Primer 5.0设计引物, 不同转录本下游引物选择在特异UTR区段, 并用BLAST检测其特异性。采用Livak (2001)的方法, 以ACTIN作为内参基因。每个反应重复3次。使用2^-∆∆Ct方法进行相对定量分析。qRT- PCR (quantitative real-time PCR)反应体系(10 μL): 5 μL SYBR Mix, 0.3 μL上游引物(F), 0.3 μL下游引物(R), 1 μL cDNA (经反转录后的原始cDNA稀释5倍), 3.4 μL H₂O。PCR反应程序: 95°C预变性15分钟; 95°C变性10秒, 55°C退火20秒, 72°C延伸20秒, 65°C 5秒, 40个循环。表达模式热图的制作使用MEV (Multiple-Expression Viewer)软件合成。

2 结果与讨论2.1 拟南芥和水稻JHDM2家族基因mRNA可选择性多聚腺苷酸化分析拟南芥IBM1 (At3g07610/JMJ25)基因属于JHDM2基因家族(Sun and Zhou, 2008)。为深入分析IBM1基因mRNA可选择性多聚腺苷酸化现象是否普遍存在, 我们首先在NCBI和TAIR (The Arabidopsis Information Resource, https://www.arabidopsis.org/index.jsp)数据库中进行转录本BLAST分析。结果表明, 拟南芥和水稻JHDM2基因家族中的其它基因也存在mRNA可选择性多聚腺苷酸化现象。例如, 拟南芥At1g09060 (JMJ24)基因有4个转录本, At1g11950基因有3个转录本, At4g00990基因有3个转录本, 多于IBM1基因转录本数目(图1); 水稻IBM1同源基因也存在类似现象, OsJMJ718基因有6个转录本, OsJMJ715基因有10个转录本(图1)。以上结果暗示, 水稻和拟南芥IBM1类基因可能存在同样的mRNA可选择性多聚腺苷酸化调控机制。
图1https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-594/img_1.png
Figure 1https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-594/img_1.png

在新窗口打开
下载 下载原图ZIP
生成PPT


图1
拟南芥和水稻中JHDM2家族基因mRNA可选择性多聚腺苷酸化加工序列数目
Os09g22540 (JMJ718)为研究对象OsJMJ718; At3g07610 (JMJ25)是拟南芥IBM1, OsJMJ718的同源基因。
Figure 1
The number of alternative polyadenylation sequences of JHDM2 family genes in Arabidopsis thaliana and rice
Os09g22540 (JMJ718) is OsJMJ718, the target sequence of this study; At3g07610 (JMJ25) is IBM1, which is the homo- logous gene of OsJMJ718 in Arabidopsis thaliana.



2.2 OsJMJ718转录本序列分析及3'RACE克隆为了进一步确认水稻中IBM1类基因存在mRNA可选择性多聚腺苷酸化修饰, 我们首先对从NCBI网站BLAST分析获得的6个转录本进行了序列比对。如图2所示, OsJMJ718-TVX1、TVX2、TVX3、TVX4、TVX5和TVX6六个转录本具有共同的5'UTR和前10个外显子序列, 但第11个外显子、终止密码子和3'UTR序列具有明显差异。不同转录本的第11个外显子、终止密码子和3'UTR序列分布在参考基因组日本晴基因组的不同位置, 为方便区分, 我们根据其在序列上的位置分别命名为E11-E18 (图2)。其中, TVX1转录本C端由E15和E16序列组成, 终止密码子和3'UTR均在E16序列中。TVX2转录本C端由E11及E12序列组成, 终止密码子在E11序列末端, 3'UTR在E12序列中。TVX3转录本C端由E13及E14序列组成, 终止密码子位于E13号外显子中, E13号外显子部分序列和E14号序列作为3'UTR区域。TVX4转录本C端由E13及E15序列组成, 终止密码子位于E13号外显子中, E13号外显子部分序列和E15号外显子作为3'UTR区域。值得注意的是, TVX3与TVX4转录本编码的蛋白质序列相同, 但通过可选择性多聚腺苷酸化产生了不同的3'UTR。TVX5转录本C端由E18号外显子组成, 终止密码子位于E18号外显子中, E18号外显子末端序列是3'UTR区域。TVX6转录本C端由E17及E18号外显子组成, 终止密码子位于E17号外显子中, E17号外显子部分序列及E18号外显子组成3'UTR区域。
图2https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-594/img_2.png
Figure 2https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-594/img_2.png
Figure 2 Sequence analysis of OsJMJ718-TVX transcripts
Nine transcripts were named as TVX1-TVX9, respectively; Exon1-Exon10 represent common exon sequences for each transcript; Exon11-Exon18 were marked in different color, the 8 exons were processed in TVX1-TVX7 by alternative polyadenylation. However, 3’ terminal sequences of TVX8 and TVX9 are only exist in MH63 genomic sequences. * indicates stop codon'>
在新窗口打开
下载 下载原图ZIP
生成PPT


图2
OsJMJ718-TVX转录本序列
9个转录本分别命名为TVX1-TVX9; Exon1-Exon10表示各转录本共有外显子序列, Exon11-Exon18为不同颜色表示基因组上的8个外显子通过可选择性多聚腺苷酸化被特异加工至TVX1-TVX7转录本。其中, TVX8和TVX9的3'端序列仅存在于明辉63 (MH63)基因组中。* 表示终止密码子
Figure 2
Sequence analysis of OsJMJ718-TVX transcripts
Nine transcripts were named as TVX1-TVX9, respectively; Exon1-Exon10 represent common exon sequences for each transcript; Exon11-Exon18 were marked in different color, the 8 exons were processed in TVX1-TVX7 by alternative polyadenylation. However, 3’ terminal sequences of TVX8 and TVX9 are only exist in MH63 genomic sequences. * indicates stop codon


为了验证是否存在上述mRNA可选择性多聚腺苷酸化加工修饰的真实性, 我们通过3'RACE实验, 从水稻花序mRNA中克隆和确认OsJMJ718-TVX转录本序列。令人意外的是, 测序结果显示, 在9522花序mRNA中还存在TVX7、TVX8和TVX9三个新的转录本(图2)。其中, TVX7转录本3'端为第11号外显子, 与TVX2相比仅在第2518号核苷酸处存在G变为A的单碱基核苷酸多态性, 相应编码的氨基酸由精氨酸变为组氨酸, 这可能与自然界存在的核苷酸多态性有关。有意思的是, BLAST分析显示, TVX8第10号外显子后的36 bp序列及3'UTR和TVX9第10号外显子后的78 bp序列并未在NCBI数据库给出的日本晴基因组中找到, 但与MH63基因组比对发现此段序列是存在的(Zhang et al., 2016) , 而且TVX8和TVX9转录本基因组中包含一段大于12 kb的大片段内含子序列(图2), 暗示日本晴基因组在此区段序列拼接组装上可能存在错误, 或该区段与9522及MH63等生态型的基因组序列组成不同。

2.3 水稻生殖发育期OsJMJ718不同转录本表达模式分析基因mRNA的可选择性多聚腺苷酸化是基因转录表达调控的重要方式之一。为探究OsJMJ718基因9个转录本在水稻生殖器官发育过程中的可能功能性转录本, 我们利用荧光定量PCR对9个转录本进行了表达模式分析。结果(图3)显示, OsJMJ718-TVX转录本在水稻不同生殖发育阶段具有特异的表达模式。其中, TVX5在水稻花器官发育早期至后期均呈现高表达, 且在心皮和浆片组织中表达量也很高。TVX3和TVX8只在发育早期、心皮和浆片组织中具有高表达, 且呈现相似的表达模式。预测转录本TVX2、TVX4和TVX6在整个发育进程中表达量均相对较低。有意思的是, 3'末端仅有5个核苷酸的TVX7相较于TVX2在花序发育早期和中期、心皮、浆片和外稃具有一定的表达量, 而TVX2仅在浆片器官中表达量较高。TVX1和TVX9具有相似的表达模式, 同样在发育早期、心皮和浆片中高表达。另一个有趣的现象是, 所有的OsJMJ718- TVX转录本均在心皮和浆片中表达量较高。
图3https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-594/img_3.png
Figure 3https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-594/img_3.png

在新窗口打开
下载 下载原图ZIP
生成PPT


图3
OsJMJ718-TVX转录本表达模式
Figure 3
Expression pattern analysis of OsJMJ718-TVX transcripts



2.4 讨论可选择性多聚腺苷酸化通过产生不同长度的3'末端序列增加了转录本的多样性, 使得有限数量的基因产生更加丰富的mRNA (Rosonina and Manley, 2010)。本研究表明, 拟南芥和水稻JHDM2基因家族多个基因(At1g09060、At1g11950、At4g00990、OsJMJ718和OsJMJ715)存在APA现象, 暗示APA作为一种重要的mRNA加工过程, 在调控拟南芥和水稻的基因表达方面发挥重要作用。已有研究表明, APA影响诸多重要的生命进程, 如动物的胚胎发育、癌症等疾病、植物的开花通路及应激反应等(Xing and Li, 2011)。拟南芥中对于这种现象已有一定程度的认识, 而在水稻中的研究和认识则相对较少。水稻是重要的单子叶模式植物, 也是重要的粮食作物。因此, 挖掘水稻基因APA修饰并检测其表达模式, 有助于深入揭示水稻APA的作用机制和生物学功能。
组蛋白甲基化和去甲基化是一种重要的表观遗传修饰。拟南芥IBM1编码的JmjC结构域蛋白是一种组蛋白去甲基化酶, 参与组蛋白H3K9的去甲基化。IBM1突变会导致叶片变窄小、花粉败育及花器官和胚的发育异常, 影响植物的繁殖(Saze et al., 2008)。有功能的IBM1-L蛋白表达则受到其甲基化水平以及识别甲基化标记的EDM2调控(Lei et al., 2014), 但这一调控机制是否在其它植物中存在尚未见报道。水稻OsJMJ718是IBM1的同源基因。本研究显示, OsJMJ- 718基因APA修饰后产生了更多的转录本, NCBI网站预测的转录本有6个(TVX1-6)。通过cDNA末端快速克隆技术(3'RACE), 我们还获得OsJMJ718基因在9522生态型中的TVX7、TVX8和TVX9三个转录本。有趣的是, TVX8和TVX9转录本3'末端在日本晴基因组中并不存在, 但在MH63基因组中发现这2段特异的序列(图2)。故推测日本晴基因组测序拼接时, 该段基因可能存在拼接错误。MH63基因组是我国科学家通过构建组装超过4 000个BAC克隆获得的高质量基因组拼接(Zhang et al., 2016)。我们的实验结果一定程度上暗示MH63基因组组装是准确的, 但这也不排除OsJMJ718基因组在不同的生态型背景中可能存在不同的基因组序列, 在9522或其它生态型基因组中该段序列的组成仍有待进一步测序验证。本研究表明, OsJMJ718基因TVX8和TVX9转录本的外显子10与其3'末端序列中间存在长度大于12 kb的大片段内含子, 其加工方式和生物学功能值得深入研究。Rigal等(2012)研究显示, IBM1也具有1个长度大于2 kb的内含子, 在编码有功能IBM1蛋白的长转录本IBM1-L中, 此大内含子CG和CHG被密集地甲基化, 但在最后产生IBM1-L mRNA时该内含子被剪切。这暗示了大内含子的存在可能是很多基因APA的调控方式, OsJMJ718基因的转录是否存在类似的调控机制有待进一步研究。另一方面, OsJMJ718各转录本在营养器官中的表达模式和功能也值得深入探究。
表达模式分析显示, OsJMJ718基因各转录本在水稻生殖器官的生殖发育进程中呈现动态变化。APA 事件使基因产生不同的mRNA转录本。APA主要有2种类型。一种为编码区-APA (coding region-APA, CR- APA), 即近端poly(A)位点在基因的内含子或者外显子上, 由此产生的转录本将缺失近端poly(A)位点到远端poly(A)位点之间的这段外显子和内含子区域, 外显子的缺失使得蛋白质的编码序列发生变化(Mayr and Bartel, 2009)。CR-APA事件产生的截短或全长蛋白拮抗或者抑制体内其它基因的表达, 从而精细调控基因的表达(Yao et al., 2012)。另一种为UTR-APA, 即近端poly(A)位点位于3'UTR, 使得基因产生具有不同长度3'UTR的mRNA转录本, 但编码的蛋白相同。UTR-APA会影响mRNA的翻译、定位及稳定性(Licatalosi and Darnell, 2010)。本研究表明, OsJMJ718基因的转录调控为UTR-APA, 转录本TVX5在整个花器官发育过程中呈现高表达, TVX1表达量也相对较高, 而通过qRT-RCR实验检测到的TVX9在发育早期和心皮及浆片中表达量高, 暗示TVX9可能也是OsJMJ718的功能性转录本。有趣的是, 所有的OsJMJ718-TVX转录本均在心皮和浆片中表达量较高, 暗示OsJMJ718可能与生殖发育调控密切相关。而OsJMJ718基因如何产生这些转录本值得深入研究。这些转录本在其它生态型中是否存在类似的表达模式和作用机制也是值得关注的生物学问题。综上, 本研究为深入揭示OsJMJ718的基因功能提供了转录本序列信息, 为阐明OsJMJ718的可选择性多聚腺苷酸化分子机制及其生物学功能奠定了重要基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
文献选项
原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

---

[11]	Saze H, Shiraishi A, Miura A, Kakutani T (2008). Control of genic DNA methylation by a jmjC domain-containing pro- tein in Arabidopsis thaliana. Science 319, 462-465. [本文引用: 3]
[12]	Shen YJ, Venu RC, Nobuta K, Wu XH, Notibala V, Demirci C, Meyers BC, Wang GL, Ji GL, Li QQ (2011). Transcrip- tome dynamics through alternative polyadenylation in developmental and environmental responses in plants revealed by deep sequencing.Genome Res 21, 1478-1486. [本文引用: 1]
[13]	Shi YS (2012). Alternative polyadenylation: new insights from global analyses.RNA 18, 2105-2117. [本文引用: 1]
[14]	Simpson GG, Dijkwel PP, Quesada V, Henderson I, Dean C (2003). FY is an RNA 3′ end-processing factor that inter- acts with FCA to control the Arabidopsis floral transition.Cell 113, 777-787. [本文引用: 1]
[15]	Sun Q, Zhou DX (2008). Rice jmjC domain-containing gene JMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organ development. Proc Natl Acad Sci USA 105, 13679-13684. [本文引用: 2]
[16]	Wu XH, Liu M, Downie B, Liang C, Ji GL, Li QQ, Hunt AG (2011). Genome-wide landscape of polyadenylation in Arabidopsis provides evidence for extensive alternative polyadenylation.Proc Natl Acad Sci USA 108, 12533-12538. [本文引用: 1]
[17]	Xing DH, Li QQ (2011). Alternative polyadenylation and gene expression regulation in plants.Wiley Interdiscip Rev RNA 2, 445-458. [本文引用: 2]
[18]	Yao P, Potdar AA, Arif A, Ray PS, Mukhopadhyay R, Willard B, Xu YC, Yan J, Saidel GM, Fox PL (2012). Coding region polyadenylation generates a truncated tRNA synthetase that counters translation repression.Cell 149, 88-100. [本文引用: 1]
[19]	Zhang JX, Addepalli B, Yun KY, Hunt AG, Xu RQ, Rao S, Li QQ, Falcone DL (2008). A polyadenylation factor subunit implicated in regulating oxidative signaling in Ara- bidopsis thaliana. PLoS One 3, e2410. [本文引用: 1]
[20]	Zhang JW, Chen LL, Xing F, Kudrna DA, Yao W, Copetti D, Mu T, Li WM, Song JM, Xie WB, Lee S, Talag J, Shao L, An Y, Zhang CL, Ouyang YD, Sun S, Jiao WB, Lv F, Du BG, Luo MZ, Maldonado CE, Goicoechea JL, Xiong LZ, Wu CY, Xing YZ, Zhou DX, Yu SB, Zhao Y, Wang GW, Yu Y, Luo YJ, Zhou ZW, Hurtado BEP, Danowitz A, Wing RA, Zhang QF (2016). Extensive sequence divergence between the reference genomes of two elite indica rice varieties Zhenshan 97 and Minghui 63. Proc Natl Acad Sci USA 113, E5163-E5171. [本文引用: 3]
[1]	Elkon R, Ugalde AP, Agami R (2013). Alternative cleavage and polyadenylation: extent, regulation and function.Nat Rev Genet 14, 496-506. [本文引用: 1]
[2]	Inagaki S, Miura-Kamio A, Nakamura Y, Lu FL, Cui X, Cao XF, Kimura H, Saze H, Kakutani T (2010). Autocatalytic differentiation of epigenetic modifications within the Ara- bidopsis genome.EMBO J 29, 3496-3506. [本文引用: 1]
[3]	Itoh JI, Nonomura KI, Ikeda K, Yamaki S, Inukai Y, Yamagishi H, Kitano H, Nagato Y (2005). Rice plant development: from zygote to spikelet.Plant Cell Physiol 46, 23-47. [本文引用: 1]
[4]	Lei MG, La HG, Lu K, Wang PC, Miki D, Ren ZZ, Duan CG, Wang XG, Tang K, Zeng L, Yang L, Zhang H, Nie WF, Liu P, Zhou JP, Liu RY, Zhong YL, Liu D, Zhu JK (2014). Arabidopsis EDM2 promotes IBM1 distal poly- adenylation and regulates genome DNA methylation pat- terns. Proc Natl Acad Sci USA 111, 527-532. [本文引用: 2]
[5]	Licatalosi DD, Darnell RB (2010). RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.Nat Rev Genet 11, 75-87. [本文引用: 1]
[6]	Liu Y, Cui SJ, Wu F, Yan S, Lin XL, Du XQ, Chong K, Schilling S, Theissen G, Meng Z (2013). Functional conservation of MIKC*-type MADS box genes in Ara- bidopsis and rice pollen maturation.Plant Cell 25, 1288-1303. [本文引用: 1]
[7]	Ma LY, Guo C, Li QQ (2014). Role of alternative poly- adenylation in epigenetic silencing and antisilencing.Proc Natl Acad Sci USA 111, 9-10. [本文引用: 1]
[8]	Mayr C, Bartel DP (2009). Widespread shortening of 3'UTRs by alternative cleavage and polyadenylation activates onco- genes in cancer cells.Cell 138, 673-684. [本文引用: 2]
[9]	Rigal M, Kevei Z, Pélissier T, Mathieu O (2012). DNA methylation in an intron of the IBM1 histone demethylase gene stabilizes chromatin modification patterns.EMBO J 31, 2981-2993. [本文引用: 1]
[10]	Rosonina E, Manley JL (2010). Alternative polyadenylation blooms.Dev Cell 18, 172-174. [本文引用: 1]

3
2008

... 拟南芥(Arabidopsis thaliana) IBM1 (Increase in BONSAI Methylation 1)基因最初由Saze等(2008)发现, IBM1编码1个含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶, 催化组蛋白H3K9单甲基和双甲基的去除.IBM1基因突变导致多种发育缺陷, 包括小而窄的叶片、花粉败育、花器官和胚胎发育异常以及繁殖能力下降(Saze et al., 2008; Inagaki et al., 2010).研究显示, IBM1有2个转录本, 只有编码JmjC结构域的长转录本IBM1-L可以翻译成有功能的IBM1蛋白.而基因组中CG的甲基化是IBM1-L转录本积累所必需的, 它包含1个长度大于2 kb的内含子(拟南芥平均内含子长度为180 bp).有意思的是, 虽然在产生IBM1-L信使RNA时该内含子会被剪切, 但是野生型基因组中该内含子在CG和CHG区被密集地甲基化.MET1 (ME- THYLTRANSFERASE 1)、CMT3 (CHROMOME- THYLASE 3)及KYP (KRYPTONITE)等参与控制基因组CG和CHG的甲基化水平, 这些基因的突变会导致IBM1-L表达量降低(Rigal et al., 2012).进一步研究表明, 染色质调节因子EDM2 (Enhanced Downy Mildew 2)识别IBM1异染色质化内含子上的H3K9甲基化标记, 从而促进其转录本3'末端的多聚腺苷酸化, 产生IBM1-L转录本的积累(Lei et al., 2014). ...
... 基因突变导致多种发育缺陷, 包括小而窄的叶片、花粉败育、花器官和胚胎发育异常以及繁殖能力下降(Saze et al., 2008; Inagaki et al., 2010).研究显示, IBM1有2个转录本, 只有编码JmjC结构域的长转录本IBM1-L可以翻译成有功能的IBM1蛋白.而基因组中CG的甲基化是IBM1-L转录本积累所必需的, 它包含1个长度大于2 kb的内含子(拟南芥平均内含子长度为180 bp).有意思的是, 虽然在产生IBM1-L信使RNA时该内含子会被剪切, 但是野生型基因组中该内含子在CG和CHG区被密集地甲基化.MET1 (ME- THYLTRANSFERASE 1)、CMT3 (CHROMOME- THYLASE 3)及KYP (KRYPTONITE)等参与控制基因组CG和CHG的甲基化水平, 这些基因的突变会导致IBM1-L表达量降低(Rigal et al., 2012).进一步研究表明, 染色质调节因子EDM2 (Enhanced Downy Mildew 2)识别IBM1异染色质化内含子上的H3K9甲基化标记, 从而促进其转录本3'末端的多聚腺苷酸化, 产生IBM1-L转录本的积累(Lei et al., 2014). ...
... 组蛋白甲基化和去甲基化是一种重要的表观遗传修饰.拟南芥IBM1编码的JmjC结构域蛋白是一种组蛋白去甲基化酶, 参与组蛋白H3K9的去甲基化.IBM1突变会导致叶片变窄小、花粉败育及花器官和胚的发育异常, 影响植物的繁殖(Saze et al., 2008).有功能的IBM1-L蛋白表达则受到其甲基化水平以及识别甲基化标记的EDM2调控(Lei et al., 2014), 但这一调控机制是否在其它植物中存在尚未见报道.水稻OsJMJ718是IBM1的同源基因.本研究显示, OsJMJ- 718基因APA修饰后产生了更多的转录本, NCBI网站预测的转录本有6个(TVX1-6).通过cDNA末端快速克隆技术(3'RACE), 我们还获得OsJMJ718基因在9522生态型中的TVX7、TVX8和TVX9三个转录本.有趣的是, TVX8和TVX9转录本3'末端在日本晴基因组中并不存在, 但在MH63基因组中发现这2段特异的序列(图2).故推测日本晴基因组测序拼接时, 该段基因可能存在拼接错误.MH63基因组是我国科学家通过构建组装超过4 000个BAC克隆获得的高质量基因组拼接(Zhang et al., 2016).我们的实验结果一定程度上暗示MH63基因组组装是准确的, 但这也不排除OsJMJ718基因组在不同的生态型背景中可能存在不同的基因组序列, 在9522或其它生态型基因组中该段序列的组成仍有待进一步测序验证.本研究表明, OsJMJ718基因TVX8和TVX9转录本的外显子10与其3'末端序列中间存在长度大于12 kb的大片段内含子, 其加工方式和生物学功能值得深入研究.Rigal等(2012)研究显示, IBM1也具有1个长度大于2 kb的内含子, 在编码有功能IBM1蛋白的长转录本IBM1-L中, 此大内含子CG和CHG被密集地甲基化, 但在最后产生IBM1-L mRNA时该内含子被剪切.这暗示了大内含子的存在可能是很多基因APA的调控方式, OsJMJ718基因的转录是否存在类似的调控机制有待进一步研究.另一方面, OsJMJ718各转录本在营养器官中的表达模式和功能也值得深入探究. ...

1
2011

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...

1
2012

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...

1
2003

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...

2
2008

... 为探究水稻(Oryza sativa)中是否存在类似拟南芥基因组中的可选择性多聚腺苷酸化修饰机制, 我们以拟南芥IBM1为模板, 通过生物信息学分析获得拟南芥和水稻基因中IBM1同源基因家族及其转录本信息(Sun and Zhou, 2008), 并以OsJMJ718为研究对象, 通过3'RACE实验, 在粳稻9522背景下克隆得到另外3个新的转录本.测序和比对分析表明, TVX8 (OsJMJ718-Transcription Variants X8)和OsJMJ- 718-TVX9的3'末端在NCBI网站提供的粳稻品种日本晴基因组中是不存在的, 但在明辉63 (MH63)基因组中存在(Zhang et al., 2016), 暗示日本晴基因组在该区段组装错误, 或与9522及MH63等生态型基因组的序列组成不同.在生殖发育期进行qRT-PCR分析, 表明OsJMJ718的9个转录本在水稻生殖发育期呈现显著的动态变化, 而OsJMJ718-TVX5相较于其它8个转录本呈现更高的表达水平.该研究为进一步揭示OsJMJ718的生物学功能奠定了重要基础. ...
... 拟南芥IBM1 (At3g07610/JMJ25)基因属于JHDM2基因家族(Sun and Zhou, 2008).为深入分析IBM1基因mRNA可选择性多聚腺苷酸化现象是否普遍存在, 我们首先在NCBI和TAIR (The Arabidopsis Information Resource, https://www.arabidopsis.org/index.jsp)数据库中进行转录本BLAST分析.结果表明, 拟南芥和水稻JHDM2基因家族中的其它基因也存在mRNA可选择性多聚腺苷酸化现象.例如, 拟南芥At1g09060 (JMJ24)基因有4个转录本, At1g11950基因有3个转录本, At4g00990基因有3个转录本, 多于IBM1基因转录本数目(图1); 水稻IBM1同源基因也存在类似现象, OsJMJ718基因有6个转录本, OsJMJ715基因有10个转录本(图1).以上结果暗示, 水稻和拟南芥IBM1类基因可能存在同样的mRNA可选择性多聚腺苷酸化调控机制. ...

1
2011

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...

2
2011

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...
... 可选择性多聚腺苷酸化通过产生不同长度的3'末端序列增加了转录本的多样性, 使得有限数量的基因产生更加丰富的mRNA (Rosonina and Manley, 2010).本研究表明, 拟南芥和水稻JHDM2基因家族多个基因(At1g09060、At1g11950、At4g00990、OsJMJ718和OsJMJ715)存在APA现象, 暗示APA作为一种重要的mRNA加工过程, 在调控拟南芥和水稻的基因表达方面发挥重要作用.已有研究表明, APA影响诸多重要的生命进程, 如动物的胚胎发育、癌症等疾病、植物的开花通路及应激反应等(Xing and Li, 2011).拟南芥中对于这种现象已有一定程度的认识, 而在水稻中的研究和认识则相对较少.水稻是重要的单子叶模式植物, 也是重要的粮食作物.因此, 挖掘水稻基因APA修饰并检测其表达模式, 有助于深入揭示水稻APA的作用机制和生物学功能. ...

1
2012

... 表达模式分析显示, OsJMJ718基因各转录本在水稻生殖器官的生殖发育进程中呈现动态变化.APA 事件使基因产生不同的mRNA转录本.APA主要有2种类型.一种为编码区-APA (coding region-APA, CR- APA), 即近端poly(A)位点在基因的内含子或者外显子上, 由此产生的转录本将缺失近端poly(A)位点到远端poly(A)位点之间的这段外显子和内含子区域, 外显子的缺失使得蛋白质的编码序列发生变化(Mayr and Bartel, 2009).CR-APA事件产生的截短或全长蛋白拮抗或者抑制体内其它基因的表达, 从而精细调控基因的表达(Yao et al., 2012).另一种为UTR-APA, 即近端poly(A)位点位于3'UTR, 使得基因产生具有不同长度3'UTR的mRNA转录本, 但编码的蛋白相同.UTR-APA会影响mRNA的翻译、定位及稳定性(Licatalosi and Darnell, 2010).本研究表明, OsJMJ718基因的转录调控为UTR-APA, 转录本TVX5在整个花器官发育过程中呈现高表达, TVX1表达量也相对较高, 而通过qRT-RCR实验检测到的TVX9在发育早期和心皮及浆片中表达量高, 暗示TVX9可能也是OsJMJ718的功能性转录本.有趣的是, 所有的OsJMJ718-TVX转录本均在心皮和浆片中表达量较高, 暗示OsJMJ718可能与生殖发育调控密切相关.而OsJMJ718基因如何产生这些转录本值得深入研究.这些转录本在其它生态型中是否存在类似的表达模式和作用机制也是值得关注的生物学问题.综上, 本研究为深入揭示OsJMJ718的基因功能提供了转录本序列信息, 为阐明OsJMJ718的可选择性多聚腺苷酸化分子机制及其生物学功能奠定了重要基础. ...

1
2008

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...

3
2016

... 为探究水稻(Oryza sativa)中是否存在类似拟南芥基因组中的可选择性多聚腺苷酸化修饰机制, 我们以拟南芥IBM1为模板, 通过生物信息学分析获得拟南芥和水稻基因中IBM1同源基因家族及其转录本信息(Sun and Zhou, 2008), 并以OsJMJ718为研究对象, 通过3'RACE实验, 在粳稻9522背景下克隆得到另外3个新的转录本.测序和比对分析表明, TVX8 (OsJMJ718-Transcription Variants X8)和OsJMJ- 718-TVX9的3'末端在NCBI网站提供的粳稻品种日本晴基因组中是不存在的, 但在明辉63 (MH63)基因组中存在(Zhang et al., 2016), 暗示日本晴基因组在该区段组装错误, 或与9522及MH63等生态型基因组的序列组成不同.在生殖发育期进行qRT-PCR分析, 表明OsJMJ718的9个转录本在水稻生殖发育期呈现显著的动态变化, 而OsJMJ718-TVX5相较于其它8个转录本呈现更高的表达水平.该研究为进一步揭示OsJMJ718的生物学功能奠定了重要基础. ...
... 为了验证是否存在上述mRNA可选择性多聚腺苷酸化加工修饰的真实性, 我们通过3'RACE实验, 从水稻花序mRNA中克隆和确认OsJMJ718-TVX转录本序列.令人意外的是, 测序结果显示, 在9522花序mRNA中还存在TVX7、TVX8和TVX9三个新的转录本(图2).其中, TVX7转录本3'端为第11号外显子, 与TVX2相比仅在第2518号核苷酸处存在G变为A的单碱基核苷酸多态性, 相应编码的氨基酸由精氨酸变为组氨酸, 这可能与自然界存在的核苷酸多态性有关.有意思的是, BLAST分析显示, TVX8第10号外显子后的36 bp序列及3'UTR和TVX9第10号外显子后的78 bp序列并未在NCBI数据库给出的日本晴基因组中找到, 但与MH63基因组比对发现此段序列是存在的(Zhang et al., 2016) , 而且TVX8和TVX9转录本基因组中包含一段大于12 kb的大片段内含子序列(图2), 暗示日本晴基因组在此区段序列拼接组装上可能存在错误, 或该区段与9522及MH63等生态型的基因组序列组成不同. ...
... 组蛋白甲基化和去甲基化是一种重要的表观遗传修饰.拟南芥IBM1编码的JmjC结构域蛋白是一种组蛋白去甲基化酶, 参与组蛋白H3K9的去甲基化.IBM1突变会导致叶片变窄小、花粉败育及花器官和胚的发育异常, 影响植物的繁殖(Saze et al., 2008).有功能的IBM1-L蛋白表达则受到其甲基化水平以及识别甲基化标记的EDM2调控(Lei et al., 2014), 但这一调控机制是否在其它植物中存在尚未见报道.水稻OsJMJ718是IBM1的同源基因.本研究显示, OsJMJ- 718基因APA修饰后产生了更多的转录本, NCBI网站预测的转录本有6个(TVX1-6).通过cDNA末端快速克隆技术(3'RACE), 我们还获得OsJMJ718基因在9522生态型中的TVX7、TVX8和TVX9三个转录本.有趣的是, TVX8和TVX9转录本3'末端在日本晴基因组中并不存在, 但在MH63基因组中发现这2段特异的序列(图2).故推测日本晴基因组测序拼接时, 该段基因可能存在拼接错误.MH63基因组是我国科学家通过构建组装超过4 000个BAC克隆获得的高质量基因组拼接(Zhang et al., 2016).我们的实验结果一定程度上暗示MH63基因组组装是准确的, 但这也不排除OsJMJ718基因组在不同的生态型背景中可能存在不同的基因组序列, 在9522或其它生态型基因组中该段序列的组成仍有待进一步测序验证.本研究表明, OsJMJ718基因TVX8和TVX9转录本的外显子10与其3'末端序列中间存在长度大于12 kb的大片段内含子, 其加工方式和生物学功能值得深入研究.Rigal等(2012)研究显示, IBM1也具有1个长度大于2 kb的内含子, 在编码有功能IBM1蛋白的长转录本IBM1-L中, 此大内含子CG和CHG被密集地甲基化, 但在最后产生IBM1-L mRNA时该内含子被剪切.这暗示了大内含子的存在可能是很多基因APA的调控方式, OsJMJ718基因的转录是否存在类似的调控机制有待进一步研究.另一方面, OsJMJ718各转录本在营养器官中的表达模式和功能也值得深入探究. ...

1
2013

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...

1
2010

... 拟南芥(Arabidopsis thaliana) IBM1 (Increase in BONSAI Methylation 1)基因最初由Saze等(2008)发现, IBM1编码1个含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶, 催化组蛋白H3K9单甲基和双甲基的去除.IBM1基因突变导致多种发育缺陷, 包括小而窄的叶片、花粉败育、花器官和胚胎发育异常以及繁殖能力下降(Saze et al., 2008; Inagaki et al., 2010).研究显示, IBM1有2个转录本, 只有编码JmjC结构域的长转录本IBM1-L可以翻译成有功能的IBM1蛋白.而基因组中CG的甲基化是IBM1-L转录本积累所必需的, 它包含1个长度大于2 kb的内含子(拟南芥平均内含子长度为180 bp).有意思的是, 虽然在产生IBM1-L信使RNA时该内含子会被剪切, 但是野生型基因组中该内含子在CG和CHG区被密集地甲基化.MET1 (ME- THYLTRANSFERASE 1)、CMT3 (CHROMOME- THYLASE 3)及KYP (KRYPTONITE)等参与控制基因组CG和CHG的甲基化水平, 这些基因的突变会导致IBM1-L表达量降低(Rigal et al., 2012).进一步研究表明, 染色质调节因子EDM2 (Enhanced Downy Mildew 2)识别IBM1异染色质化内含子上的H3K9甲基化标记, 从而促进其转录本3'末端的多聚腺苷酸化, 产生IBM1-L转录本的积累(Lei et al., 2014). ...

1
2005

... 水稻花序的长度和形态, 以及心皮、浆片、雄蕊、外稃和内稃组织的形态结构参见Itoh等(2005)的描述.取材全程使用无RNase镊子及EP管.材料取下后立即置于液氮中, 或保存于-80°C备用. ...

2
2014

... 拟南芥(Arabidopsis thaliana) IBM1 (Increase in BONSAI Methylation 1)基因最初由Saze等(2008)发现, IBM1编码1个含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶, 催化组蛋白H3K9单甲基和双甲基的去除.IBM1基因突变导致多种发育缺陷, 包括小而窄的叶片、花粉败育、花器官和胚胎发育异常以及繁殖能力下降(Saze et al., 2008; Inagaki et al., 2010).研究显示, IBM1有2个转录本, 只有编码JmjC结构域的长转录本IBM1-L可以翻译成有功能的IBM1蛋白.而基因组中CG的甲基化是IBM1-L转录本积累所必需的, 它包含1个长度大于2 kb的内含子(拟南芥平均内含子长度为180 bp).有意思的是, 虽然在产生IBM1-L信使RNA时该内含子会被剪切, 但是野生型基因组中该内含子在CG和CHG区被密集地甲基化.MET1 (ME- THYLTRANSFERASE 1)、CMT3 (CHROMOME- THYLASE 3)及KYP (KRYPTONITE)等参与控制基因组CG和CHG的甲基化水平, 这些基因的突变会导致IBM1-L表达量降低(Rigal et al., 2012).进一步研究表明, 染色质调节因子EDM2 (Enhanced Downy Mildew 2)识别IBM1异染色质化内含子上的H3K9甲基化标记, 从而促进其转录本3'末端的多聚腺苷酸化, 产生IBM1-L转录本的积累(Lei et al., 2014). ...
... 组蛋白甲基化和去甲基化是一种重要的表观遗传修饰.拟南芥IBM1编码的JmjC结构域蛋白是一种组蛋白去甲基化酶, 参与组蛋白H3K9的去甲基化.IBM1突变会导致叶片变窄小、花粉败育及花器官和胚的发育异常, 影响植物的繁殖(Saze et al., 2008).有功能的IBM1-L蛋白表达则受到其甲基化水平以及识别甲基化标记的EDM2调控(Lei et al., 2014), 但这一调控机制是否在其它植物中存在尚未见报道.水稻OsJMJ718是IBM1的同源基因.本研究显示, OsJMJ- 718基因APA修饰后产生了更多的转录本, NCBI网站预测的转录本有6个(TVX1-6).通过cDNA末端快速克隆技术(3'RACE), 我们还获得OsJMJ718基因在9522生态型中的TVX7、TVX8和TVX9三个转录本.有趣的是, TVX8和TVX9转录本3'末端在日本晴基因组中并不存在, 但在MH63基因组中发现这2段特异的序列(图2).故推测日本晴基因组测序拼接时, 该段基因可能存在拼接错误.MH63基因组是我国科学家通过构建组装超过4 000个BAC克隆获得的高质量基因组拼接(Zhang et al., 2016).我们的实验结果一定程度上暗示MH63基因组组装是准确的, 但这也不排除OsJMJ718基因组在不同的生态型背景中可能存在不同的基因组序列, 在9522或其它生态型基因组中该段序列的组成仍有待进一步测序验证.本研究表明, OsJMJ718基因TVX8和TVX9转录本的外显子10与其3'末端序列中间存在长度大于12 kb的大片段内含子, 其加工方式和生物学功能值得深入研究.Rigal等(2012)研究显示, IBM1也具有1个长度大于2 kb的内含子, 在编码有功能IBM1蛋白的长转录本IBM1-L中, 此大内含子CG和CHG被密集地甲基化, 但在最后产生IBM1-L mRNA时该内含子被剪切.这暗示了大内含子的存在可能是很多基因APA的调控方式, OsJMJ718基因的转录是否存在类似的调控机制有待进一步研究.另一方面, OsJMJ718各转录本在营养器官中的表达模式和功能也值得深入探究. ...

1
2010

... 表达模式分析显示, OsJMJ718基因各转录本在水稻生殖器官的生殖发育进程中呈现动态变化.APA 事件使基因产生不同的mRNA转录本.APA主要有2种类型.一种为编码区-APA (coding region-APA, CR- APA), 即近端poly(A)位点在基因的内含子或者外显子上, 由此产生的转录本将缺失近端poly(A)位点到远端poly(A)位点之间的这段外显子和内含子区域, 外显子的缺失使得蛋白质的编码序列发生变化(Mayr and Bartel, 2009).CR-APA事件产生的截短或全长蛋白拮抗或者抑制体内其它基因的表达, 从而精细调控基因的表达(Yao et al., 2012).另一种为UTR-APA, 即近端poly(A)位点位于3'UTR, 使得基因产生具有不同长度3'UTR的mRNA转录本, 但编码的蛋白相同.UTR-APA会影响mRNA的翻译、定位及稳定性(Licatalosi and Darnell, 2010).本研究表明, OsJMJ718基因的转录调控为UTR-APA, 转录本TVX5在整个花器官发育过程中呈现高表达, TVX1表达量也相对较高, 而通过qRT-RCR实验检测到的TVX9在发育早期和心皮及浆片中表达量高, 暗示TVX9可能也是OsJMJ718的功能性转录本.有趣的是, 所有的OsJMJ718-TVX转录本均在心皮和浆片中表达量较高, 暗示OsJMJ718可能与生殖发育调控密切相关.而OsJMJ718基因如何产生这些转录本值得深入研究.这些转录本在其它生态型中是否存在类似的表达模式和作用机制也是值得关注的生物学问题.综上, 本研究为深入揭示OsJMJ718的基因功能提供了转录本序列信息, 为阐明OsJMJ718的可选择性多聚腺苷酸化分子机制及其生物学功能奠定了重要基础. ...

1
2013

... RNA抽提采用Liu等(2013)报道的方法.将新鲜水稻组织样品用液氮速冻, 用钢珠充分研磨成粉末后加入800 μL Trizol, 混合均匀后加入200 μL氯仿, 剧烈振荡混匀.4°C 13 523 ×g离心10分钟.吸取400 μL上清转入新的1.5 mL EP管中, 加入与上清等体积的异丙醇, -20°C放置1小时或更长时间以充分沉淀.沉淀完全后, 4°C 13 523 ×g离心5分钟.小心移去上清, 防止沉淀丢失.用70%乙醇洗2次, 每次700 μL, 13 523 ×g离心5分钟.最后, 尽可能吸走上清, 在超净台上将乙醇吹干, 加入30 μL DEPC水溶解, -80°C保存. ...

1
2014

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...

2
2009

... 真核生物基因组中广泛存在可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)现象(Xing and Li, 2011; Elkon et al., 2013).基因组深度测序分析发现70%-80%的人类(Homo sapiens)和植物基因存在APA (Shen et al., 2011; Wu et al., 2011; Shi, 2012).多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site, PAS)决定了转录本的末端位置及其3'端非翻译区(3' untranslated region, 3'UTR)序列.APA修饰会导致引入或者去除一段特异RNA序列, 如mRNA (信使RNA)稳定因子、翻译抑制因子或miRNA的靶点序列, 从而影响功能性mRNA的产生(Ma et al., 2014).近年来的研究表明, APA参与改变细胞命运或发育过程, 改变细胞对环境的反应, 包括肿瘤的发生、开花时间的控制以及氧化反应等(Simpson et al., 2003; Zhang et al., 2008; Mayr and Bartel, 2009). ...
... 表达模式分析显示, OsJMJ718基因各转录本在水稻生殖器官的生殖发育进程中呈现动态变化.APA 事件使基因产生不同的mRNA转录本.APA主要有2种类型.一种为编码区-APA (coding region-APA, CR- APA), 即近端poly(A)位点在基因的内含子或者外显子上, 由此产生的转录本将缺失近端poly(A)位点到远端poly(A)位点之间的这段外显子和内含子区域, 外显子的缺失使得蛋白质的编码序列发生变化(Mayr and Bartel, 2009).CR-APA事件产生的截短或全长蛋白拮抗或者抑制体内其它基因的表达, 从而精细调控基因的表达(Yao et al., 2012).另一种为UTR-APA, 即近端poly(A)位点位于3'UTR, 使得基因产生具有不同长度3'UTR的mRNA转录本, 但编码的蛋白相同.UTR-APA会影响mRNA的翻译、定位及稳定性(Licatalosi and Darnell, 2010).本研究表明, OsJMJ718基因的转录调控为UTR-APA, 转录本TVX5在整个花器官发育过程中呈现高表达, TVX1表达量也相对较高, 而通过qRT-RCR实验检测到的TVX9在发育早期和心皮及浆片中表达量高, 暗示TVX9可能也是OsJMJ718的功能性转录本.有趣的是, 所有的OsJMJ718-TVX转录本均在心皮和浆片中表达量较高, 暗示OsJMJ718可能与生殖发育调控密切相关.而OsJMJ718基因如何产生这些转录本值得深入研究.这些转录本在其它生态型中是否存在类似的表达模式和作用机制也是值得关注的生物学问题.综上, 本研究为深入揭示OsJMJ718的基因功能提供了转录本序列信息, 为阐明OsJMJ718的可选择性多聚腺苷酸化分子机制及其生物学功能奠定了重要基础. ...

1
2012

... 拟南芥(Arabidopsis thaliana) IBM1 (Increase in BONSAI Methylation 1)基因最初由Saze等(2008)发现, IBM1编码1个含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶, 催化组蛋白H3K9单甲基和双甲基的去除.IBM1基因突变导致多种发育缺陷, 包括小而窄的叶片、花粉败育、花器官和胚胎发育异常以及繁殖能力下降(Saze et al., 2008; Inagaki et al., 2010).研究显示, IBM1有2个转录本, 只有编码JmjC结构域的长转录本IBM1-L可以翻译成有功能的IBM1蛋白.而基因组中CG的甲基化是IBM1-L转录本积累所必需的, 它包含1个长度大于2 kb的内含子(拟南芥平均内含子长度为180 bp).有意思的是, 虽然在产生IBM1-L信使RNA时该内含子会被剪切, 但是野生型基因组中该内含子在CG和CHG区被密集地甲基化.MET1 (ME- THYLTRANSFERASE 1)、CMT3 (CHROMOME- THYLASE 3)及KYP (KRYPTONITE)等参与控制基因组CG和CHG的甲基化水平, 这些基因的突变会导致IBM1-L表达量降低(Rigal et al., 2012).进一步研究表明, 染色质调节因子EDM2 (Enhanced Downy Mildew 2)识别IBM1异染色质化内含子上的H3K9甲基化标记, 从而促进其转录本3'末端的多聚腺苷酸化, 产生IBM1-L转录本的积累(Lei et al., 2014). ...

1
2010

... 可选择性多聚腺苷酸化通过产生不同长度的3'末端序列增加了转录本的多样性, 使得有限数量的基因产生更加丰富的mRNA (Rosonina and Manley, 2010).本研究表明, 拟南芥和水稻JHDM2基因家族多个基因(At1g09060、At1g11950、At4g00990、OsJMJ718和OsJMJ715)存在APA现象, 暗示APA作为一种重要的mRNA加工过程, 在调控拟南芥和水稻的基因表达方面发挥重要作用.已有研究表明, APA影响诸多重要的生命进程, 如动物的胚胎发育、癌症等疾病、植物的开花通路及应激反应等(Xing and Li, 2011).拟南芥中对于这种现象已有一定程度的认识, 而在水稻中的研究和认识则相对较少.水稻是重要的单子叶模式植物, 也是重要的粮食作物.因此, 挖掘水稻基因APA修饰并检测其表达模式, 有助于深入揭示水稻APA的作用机制和生物学功能. ...