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接受日期:2016-08-21接受日期:2017-01-10网络出版日期:2017-11-1
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2017《植物学报》编辑部
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中药雷公藤为根类药材, 来源于卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)的根。其味辛、苦, 性凉, 具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛以及杀虫止血等功效。雷公藤的主要活性物质为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类。具有抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等作用(Zhou et al., 2012), 在现代临床治疗中主要应用于类风湿、肿瘤、帕金森和系统性红斑狼疮等疾病(Wang et al., 2008; Lu et al., 2010; Chugh et al., 2012)。目前, 雷公藤萜类活性成分越来越受到国内外研究者的关注, 其中对雷公藤甲素和雷公藤红素的研究最为深入(Titov et al., 2011; Liu et al., 2015)。
原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂。早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法。此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂。原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(刘继红和邓秀新, 1999), 因此可以用来进行遗传育种研究。此外, 可利用原生质体进行离子通道研究, 以了解诱导子、渗透压及机械刺激等外界刺激下原生质体的调节机制(Knight et al., 1991; Gilroy and Jones, 1992; Sheen, 2001)。原生质体还可用于遗传转化研究。据文献报道, 有多种途径可以将外源基因导入原生质体中, 包括农杆菌转化法、显微注射法和PEG介导转化法等(Woo et al., 2015; Duarte et al., 2016)。此外, 原生质体还可以用于细胞融合和细胞膜研究等(Guo et al., 2006; Tudses et al., 2015)。近年来, 雷公藤萜类合成途径中关键酶基因研究取得了一定的进展(Zhao et al., 2015; Zhang et al., 2015; Su et al., 2016), 但雷公藤的遗传转化体系尚不健全, 这在很大程度上限制了雷公藤的功能基因及合成生物学等方面研究的深入开展。本文旨在探讨影响雷公藤原生质体提取效率的因素(如酶解液配比、甘露醇浓度、酶解时间及处理转速), 探索高效的雷公藤原生质体提取方法, 并在此基础上建立雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时表达体系, 为深入开展雷公藤功能基因及合成生物学研究奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料
将雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook. f.)愈伤组织(由福建农林大学吴承祯教授惠赠)接种于0.5 mg?L-1 2,4-D+0.1 mg?L-1 KT+0.5 mg?L-1 IBA的MS琼脂培养基上, 25°C黑暗下继代培养。继代培养3代以上, 选取生长良好、质地疏松且生长状况一致(或相似)的愈伤组织, 用镊子夹成小块, 以每瓶1.0 g的愈伤组织量转接入含100 mL 0.5 mg?L-1 2,4-D+0.1 mg?L-1 KT+0.5 mg?L-1 IBA的MS液体培养基的250 mL三角瓶中, 放于摇床上, 25°C、黑暗下以每分钟120转悬浮培养, 20天继代1次。选取继代培养10-12天的悬浮细胞作为原生质体提取材料。
含有绿色荧光蛋白编码序列的植物亚细胞定位质粒E3025由中国农业大学董江丽副教授惠赠。
1.1.2 实验试剂
实验试剂包括: 纤维素酶(R-10, YAKULT, 150703- 02)、果胶酶(Y-23, YAKULT)、离析酶(R-10, YAKULT)、台盼蓝染液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司, 5BR00130)、甘露醇(D-Mannitol, Solarbio, 1126F034)、牛血清白蛋白(BSA, Roche)、吗啉乙磺酸(MES, 赛克林, C10035338)、二水合氯化钙(Ca- Cl2·2H2O, 国药集团化学试剂有限公司, 20130130), 聚乙二醇(PEG4000, Solarbio, 1226B034)、氯化钠(NaCl, 北京现代东方精细化学品有限公司, 2014- 0301)、氯化钾(KCl, 国药集团化学试剂有限公司, 20120925)和磷酸盐缓冲液(PBS, gibco, 1760235)。
酶解液: 将纤维素酶、果胶酶Y-23和离析酶R-10按不同配比制成酶溶液, 其溶剂组成为甘露醇、0.6% BSA、0.1% MES、0.05 mol?L-1 CaCl2·2H2O, 用KOH调pH值至5.6。在55°C水浴锅中活化10分钟, 0.22 μm微孔滤膜过滤除菌, 4°C保存。
W5溶液: 0.125 mol?L-1 CaCl2、0.154 mol?L-1 NaCl、5 mmol?L-1 KCl、2 mmol?L-1 MES, 用KOH调pH值至5.6, 高温高压灭菌, 室温保存。
MMG溶液: 15 mmol?L-1 MgCl2、0.1% MES、0.4 mol?L-1甘露醇, 用KOH调pH值至5.6, 高温高压灭菌, 室温保存。
台盼蓝染液: 用PBS缓冲液将台盼蓝稀释成0.4%的溶液。
PEG溶液: 40% PEG4000、0.2 mol?L-1甘露醇、0.1 mol?L-1 CaCl2 (现配现用, 4°C最多可保存5天)。
WI溶液: 0.5 mol?L-1甘露醇、4 mmol?L-1 MES、20 mmol?L-1 KCl, 用KOH调pH值至5.6, 高温高压灭菌, 室温保存。
1.1.3 实验仪器
实验仪器包括: 超净工作台(ESCD)、循环水式多用真空泵(SHB-III, 郑州长城科工贸有限公司)、离心机(3-18K, SIGMA)、恒温培养振荡器(ZHWY-200D, 上海智城分析仪器制造有限公司)、倒置荧光显微镜(3327000427, Carl Zeiss)、天平(BSA3202S, 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、0.22 μm微孔滤膜(12491302, Acrodisc)、300目不锈钢细胞筛(Sol- arbio)、血球计数器(02270113, 上海市求精生化试剂仪器有限公司)、移液器(Transferpette)、高压灭菌锅(SX-700, TOMY)和激光共聚焦扫描显微镜(Visi- Tech)。
1.2 实验方法1.2.1 原生质体分离
选取继代培养10-12天的悬浮细胞作为原生质体提取材料。将纤维素酶、果胶酶Y-23和离析酶R-10按不同比例配制成酶解液, 酶溶剂为甘露醇、0.6% BSA、0.1% MES和0.05 mol?L-1 CaCl2·2H2O, 用KOH调pH值至5.6。将酶解液在55°C水浴锅中活化10分钟, 0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。取0.5 g雷公藤悬浮细胞, 吸干培养基, 尽量压碎, 按照10 mL?g-1的量加入酶解液, 25°C、以每分钟50转黑暗振摇以分离原生质 体。
考察条件包括: (1) 不同酶解液配比(表1); (2) 酶溶剂甘露醇浓度(0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mol?L-1); (3) 酶解时间(6、8、10、12、14和16小时)。
表1
Table 1
表1
表1 雷公藤悬浮细胞细胞壁酶解液配比 Table 1 Proportion of enzymic digestion to remove Triptery- gium wilfordii suspension cells cytoderm| Group | Cellulase (%) | Pectinase (%) | Macerozyme (%) |
|---|---|---|---|
| 1 | 1.5 | 0.3 | 0.5 |
| 2 | 2.0 | 0.3 | 0.5 |
| 3 | 2.0 | 0.5 | 0.5 |
| 4 | 2.0 | 0.7 | 0.5 |
| 5 | 2.5 | 0.3 | 0.5 |
表1
雷公藤悬浮细胞细胞壁酶解液配比
Table 1
Proportion of enzymic digestion to remove Triptery- gium wilfordii suspension cells cytoderm
1.2.2 原生质体纯化
在规定时间终止酶解, 用滴管抽吸悬浮细胞混悬液数次, 以促进原生质体的释放。用无菌的300目不锈钢细胞筛过滤, 滤液离心(考察不同转速) 5分钟收集原生质体, 弃上清。加入5 mL W5溶液, 重悬以清洗原生质体, 离心5分钟, 弃上清。再分别用5和2 mL W5溶液各洗涤1次。弃去上清液, 加入1 mL MMG溶液重悬, 即可获得纯化的原生质体。原生质体纯化过程中考察条件为转速, 探讨17、37、67和104 ×g四种转速对原生质体纯化效果的影响, 获得原生质体得率高又对其无机械损伤的最佳转速。
1.2.3 原生质体计数
用MMG溶液将原生质体原液稀释5倍, 将稀释的悬浮液滴在血球计数板上。待原生质体将计数室充满, 在显微镜下观察并计数(4个大格中的原生质体数目)。每个样品重复计数3次。每克雷公藤悬浮细胞原生质体产量(个?g-1 FW)计算公式为:
原生质体产量=(原生质体总个数/4×材料质量)×稀释倍数×104
1.2.4 原生质体活力检测
原生质体的活力检测采用台盼蓝染色法, 将配好的台盼蓝染液按体积比1:10加入到稀释后的原生质体悬浮液中染色, 选取4个有代表性的视野进行统计。原生质体活力的计算方法为: 未被台盼蓝染色的原生质体占该视野下原生质体总数的百分比。计算公式为:
原生质体活力=(未染色的原生质体数/视野下全部原生质体数)×100%
1.2.5 原生质体分离纯化方法优化及提取效率检测
将上述考察得到的最佳酶解液配比、最适甘露醇浓度、最佳酶解时间及最优处理转速进行组合, 使用最优条件对雷公藤原生质体再次进行提取, 检测原生质体产量和活力。
1.2.6 雷公藤悬浮细胞原生质体瞬时转化体系的建立
将原生质体浓度调至约为5×105个?mL-1, 取200 μL与20 μg含GFP蛋白编码序列的植物表达载体E3025质粒混合, 再加入220 μL PEG溶液, 轻敲混匀, 在黑暗条件下诱导转化混合物20分钟。室温下用880 μL W5溶液稀释转化混合液, 然后轻柔颠倒摇动离心管, 使之混合完好以终止转化反应。67 ×g离心2分钟, 去上清, 将W5溶液重复清洗1次, 去上清, 用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中, 25°C黑暗静置培养。18小时后取出, 67 ×g离心2分钟, 去掉部分上清, 对原生质体溶液进行浓缩, 取适量制片, 在激光共聚焦扫描显微镜下观察GFP表达情况。观察5个视野下原生质体的转化情况, 按照以下公式计算转化率:
原生质体转化效率=(激发光下发出绿色荧光的原生质体数/明场下所有原生质体数)×100%
2 结果与讨论2.1 原生质体分离纯化条件优化2.1.1 酶解液配比对原生质体产量和活力的影响
将雷公藤悬浮细胞用不同配比酶解液酶解(用0.5 mol?L-1甘露醇调节渗透压), 酶解12小时, 纯化转速67 ×g收集原生质体。对得到的原生质体进行产量和活力检测(图1)。1、2、5三组中, 纤维素酶浓度依次增加(表1), 第2组的原生质体产量(图1A)和活力(图1B)最高, 分别可达1.86×105?g-1 FW和67.8%。以上结果表明, 纤维素酶浓度过低不能充分解离细胞壁, 而纤维素酶浓度过高则会使细胞膜破裂, 影响原生质体活性, 故纤维素酶的最佳浓度为2.0%。在第2、3、4三组中, 果胶酶浓度依次增加(表1), 但第3组原生质体产量(图1A)和活力(图1B)最高, 分别可达3.08× 105?g-1 FW和80.15%, 与其它组相比存在显著差异, 故果胶酶的最佳浓度为0.5%。综上, 雷公藤悬浮细胞原生质体分离的最佳酶液配比为2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶。
图1
Figure 1
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图1
酶解液浓度对雷公藤悬浮细胞原生质体产量(A)和活力(B)的影响
不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。
Figure 1
The influence of enzyme concentration on Tripterygium wilfordii suspension cells protoplast yield (A) and activity (B)
Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05.
2.1.2 酶解时间对原生质体产量和活力的影响
选用2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶配比的酶解液进行原生质体的分离与纯化(甘露醇浓度为0.5 mol?L-1, 处理转速67 ×g), 考察不同酶解时间对原生质体分离效果的影响。将得到的原生质体进行产量和活力检测, 结果见图2。从图2可以看出, 原生质体的产量随酶解时间的增加有所提高(图2A), 但原生质体的活力在酶解10小时达到最高(82.2%) (图2B)。以上结果表明, 酶解时间过短不能使原生质体完全分离出来, 提取效率低; 而酶解时间过长, 细胞压力过大, 容易破碎, 镜下检测死细胞和碎片增多, 活细胞所占比例小, 不利于后续实验的开展。综上, 10小时为雷公藤悬浮细胞原生质体的最佳酶解时间。
图2
Figure 2
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图2
不同酶解时间对雷公藤悬浮细胞原生质体产量(A)及活力(B)的影响
不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。
Figure 2
The influence of enzymatic hydrolysis time on Trip- terygium wilfordii suspension cells protoplast yield (A) and activity (B)
Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05.
2.1.3 甘露醇浓度对原生质体产量和活力的影响
将2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶分别溶解到甘露醇浓度为0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mol?L-1的酶溶剂中, 对雷公藤悬浮细胞原生质体进行分离纯化(酶解12小时, 处理转速67 ×g)。将得到的原生质体进行产量(图3A)和活力检测(图3B)。由图3可知, 当甘露醇浓度为0.5 mol?L-1时原生质体产量最高, 但此时其活力不是最高的, 当甘露醇浓度为0.6 mol?L-1时, 虽然产量比0.5 mol?L-1时稍低, 但此时原生质体活力最高。表明溶液渗透压低于原生质体的渗透压会导致细胞胀破死亡; 当甘露醇浓度过高时原生质体失水皱缩, 且不利于原生质体的释放。虽然0.5与0.6 mol?L-1两个甘露醇浓度处理组中存活的原生质体总数相近, 但只有活力高的原生质体才能用于瞬时转化, 因此, 甘露醇浓度为0.6 mol?L-1更有利于下一步实验的开展。综上, 分离原生质体的最佳甘露醇浓度为0.6 mol?L-1。
图3
Figure 3
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图3
不同甘露醇浓度对雷公藤悬浮细胞原生质体产量(A)和活力(B)的影响
不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。
Figure 3
The influence of mannitol concentration on Tripterygium wilfordii suspension cells protoplast yield (A) and activity (B)
Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05.
2.1.4 处理转速对原生质体产量和活力的影响
选用2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶配比的酶解液进行原生质体的分离与纯化(甘露醇浓度为0.5 mol?L-1, 酶解12小时), 考察不同处理转速对原生质体纯化效果的影响。将得到的原生质体进行产量和活力检测(图4)。从图4可以看出, 当转速为67 ×g时, 原生质体产量可达2.17×105?g-1 FW (图4A); 活力最高可达78.4% (图4B), 即产量和活力均在转速为67 ×g时达到最高水平。这表明转速过低不利于原生质体的沉降, 碎片和原生质体不能得到有效分离; 而转速过高则会对原生质体造成机械损伤, 同样不利于原生质体的分离纯化。综上, 分离纯化原生质体的最佳转速为67 ×g。
图4
Figure 4
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图4
不同转速对雷公藤悬浮细胞原生质体的产量(A)及活力(B)的影响
不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。
Figure 4
The influence of centrifugal speed on Tripterygium wilfordii suspension cells protoplast yield (A) and activity (B)
Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05.
2.1.5 原生质体分离纯化方法提取效率检测
选用2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶、甘露醇浓度为0.6 mol?L-1的酶液, 酶解10小时, 处理转速为67 ×g。获得的原生质体产量高达4.24×105?g-1 FW, 活力可达94.5%。正常状态下的原生质体形态及台盼蓝染色后的原生质体形态见图5。
图5
Figure 5
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图5
光学显微镜下雷公藤悬浮细胞原生质体形态
(A) 台盼蓝染色前的原生质体; (B) 台盼蓝染色后的原生质体(红框标出的为死细胞)。Bars=100 μm
Figure 5
Morphology of Tripterygium wilfordii suspension cells protoplast under optical microscope
(A) Morphology of protoplast before trypan blue staining; (B) Morphology of protoplast after trypan blue staining, and the blue cell in red box was dead. Bars=100 μm
2.2 PEG介导雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化利用PEG介导转化法对雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化进行了研究, 结果如图6。由于原生质体来源于黑暗培养的雷公藤悬浮细胞, 因此其细胞中不含叶绿体。图6B为激光共聚焦扫描显微镜488 nm激发光下观察到的GFP绿色荧光; 图6C显示原生质体无自发荧光; 图6D为叠加效果图, 可以观察到原生质体荧光均来源于GFP表达的绿色荧光。由此证明编码GFP的E3025质粒已转化到原生质体中, 并成功表达, 转化效率可达60%以上。本研究成功建立了雷公藤悬浮细胞原生质体瞬时转化体系。
图6
Figure 6
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图6
激光共聚焦扫描显微镜下观察雷公藤悬浮细胞原生质体
(A) 明场下的原生质体; (B) 488 nm激发光下GFP荧光; (C) 原生质体无自发荧光; (D) 叠加效果图。Bars=1 μm
Figure 6
Protoplast of Tripterygium wilfordii suspension cells under laser scanning confocal microscop
(A) Protoplasts under the laser confocal microscope in bright field; (B) GFP fluorescence of protoplast under the laser confocal microscope in excitation 488 nm; (C) There is no red chloroplast spontaneous fluorescence of protoplast under the laser confocal microscope in excitation 488 nm; (D) Red chlorophyll fluorescence signals and GFP signals from protoplast. Bars=1 μm
2.3 讨论雷公藤悬浮细胞具有生长速度快和次生代谢物积累迅速等优点, 是开展雷公藤次生代谢产物分子机制研究的良好材料。悬浮细胞来源于愈伤组织, 具有大量的细胞间隙, 细胞壁易被酶解, 也是制备原生质体的理想材料。雷公藤为木质藤本植物, 其无菌苗的生长速度较为缓慢, 因此本研究选择雷公藤悬浮细胞作为原生质体提取原料。
酶解法通过混合酶将细胞壁的成分降解, 使原生质体充分暴露出来(张良波等, 2011)。该方法具有条件温和, 获得的原生质体形态好、产量和活力高等优点, 是现代研究中分离植物原生质体最常用的方法。在已有的报道中, 研究者对纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶R-10等酶类以及多种辅助消化物质做过酶解效率的探索, 不同植物不同组织原生质体的分离往往采用不同的酶解液, 如用3%纤维素酶和0.6%果胶酶可从水稻(Oryza sativa)的幼茎中分离得到产量较高的原生质体(段炼等, 2014); 1.5%纤维素酶+0.4%离析酶可以很好地分离棉花(Gossypium hirsutum)叶片原生质体(李妮娜, 2014); 而分离药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza)的悬浮细胞原生质体则采用1.5%纤维素酶+0.3%果胶酶+0.5%离析酶的混合酶液(朱楠等, 2014)。本研究中的分离材料同样为悬浮培养细胞, 与丹参悬浮细胞的组织成分具有一定相似性。经过条件优化, 发现当酶解液配比为2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶时, 可以获得产量和活力俱佳的雷公藤原生质体。
目前, 在原生质体纯化过程中使用较多的是离心沉降法。该方法的优点是快速便捷, 但得到的原生质体常常出现大小不均和破碎等情况。因此, 实验过程中要根据细胞的具体情况选择适合的离心力。用于原生质体纯化的离心力大小一般介于60-100 ×g之间, 本研究中采用67 ×g的离心力可以获得产量较高且杂质较少的原生质体。除了离心沉降法以外, 还可以通过密度梯度自然沉降法对原生质体进行纯化, 该方法虽然相对耗时, 但得到的原生质体大小均一、形态完整且无杂质(段炼等, 2014), 特别适用于纯化纤维性较强、酶解分离后杂质较多的组织的原生质体。本研究中使用的材料为雷公藤悬浮细胞, 杂质较少。综合考虑实验效率, 采用离心沉降法可以获得满足后续实验要求的原生质体, 因此未采用自然沉降法。
外源基因转化原生质体的方法有多种, 如农杆菌转化法、显微注射法及PEG介导转化法等。PEG介导转化法具有重复性好、成本低、操作简便以及省时高效等优点, 在生物学研究中已经得到广泛应用。Mass和Werr (1989)认为, 导入到细胞中的外源DNA是沉淀状态的, 而发生有效的沉淀必须有PEG和二价阳离子共同作用。利用PEG介导的瞬时转化法已在多种植物中成功建立了原生质体转化体系, 例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草、水稻和小麦(Triticum aestivum)等, 并且能够达到较高的转化率, 为基因功能的验证和基因编辑技术的开展提供了帮助。PEG介导的瞬时转化效率与质粒DNA浓度、PEG浓度和原生质体数目等因素息息相关。本研究采用40%的PEG- 4000将20 μg质粒瞬时转化到1×105个雷公藤悬浮细胞原生质体中, 转化效率大于60%, 满足后续实验的要求, 但悬浮细胞为分裂旺盛的新生细胞, 胞质较为脆弱, PEG处理过程中仍有小部分细胞发生破裂, 因此, 该转化体系仍有优化的空间。
原生质体是快速、高效分析植物基因功能的良好材料, 在植物功能基因组研究中发挥重要作用。此外, 细胞具有全能性, 转化后的原生质体依然具有再生植株的能力(刘凡等, 2006)。PEG介导的瞬时转化, 外源质粒可在再生植株中去除, 这使原生质体成为基因编辑技术在植物中应用的理想材料, 可以获得无外源基因插入的纯净突变(编辑)株系, 这对植物分子育种和品种改良等具有重大意义(Woo et al., 2015)。本实验通过对影响原生质体分离纯化的因素进行探讨, 筛选得到了提取雷公藤悬浮细胞原生质体的优化条件, 并在此基础之上, 建立一套简单、高效的原生质体瞬时表达体系, 为深入开展雷公藤的功能基因组学以及后续的基因编辑研究奠定了基础。
参考文献
文献选项
原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子
| [1] | URL在模式植物拟南芥中,原生质体瞬时表达技术已被广泛地应用到功能基因组学的研究中,但水稻原生质体因其制备过程相对繁琐,转化效率偏低,尚未在基因功能研究中获得广泛应用。本研究在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上,对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。以水稻幼茎为起始材料,采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10,对水稻组织进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体,获得了高纯度的原生质体。对质粒转化原生质体时的转化方法、转化时间及质粒浓度进行探索,在缩短原生质体分离时间的同时,大大提高了转化效率。用较少量的质粒DNA即可获得外源基因在原生质体内高效的表达,且转化效率可达70%。我们建立的这种快速有效的水稻原生质体制备和转化方法,可为水稻功能基因组学研究提供技术支持。 [本文引用: 2] |
| [2] | DOI:10.3724/SP.J.1006.2014.00231URLIn this paper, taking healthy cotyledon leaves as explants material, combining with the screening of key factors related to isolation and transformation of cotton mesophyll protoplasts, a stable and efficient transient expression and identification system for the target genes was established via transfoming the cotton mesophyll protoplast cells. The major technical system includes: the enzymatic method is used to isolate mesophyll protoplasts. In detail, healthy 12-day-old young cotton cotyledons in natural growth condition were selected as the explant, and were digested with enzyme solution including 1.5% cellulose, 0.4% macerozyme, 0.5 mol L mannitol, 20 mmol LKCl, 20 mmol LMES, 0.1 mol LCaCl, and 1.0 g LBSA for eight hours with gentle shaking at 28 and under dark conditions. The concentration of the pure cotton mesophyll protoplasts was more than 1.0 10 mL. Using the system, we integrated a cotton zinc finger protein gene [本文引用: 1] |
| [3] | DOI:10.3969/j.issn.1674-3466.2006.03.007URL结球白菜(Brassicacampestrisssp.pekinensis)的原生质体培养由于基因型依赖性强,细胞易褐化,愈伤组织的芽诱导率低等而难于再生植株。本实验以结球白菜的下胚轴原生质体为试材,研究了影响其细胞分裂及愈伤组织形成的因素,探索了经过体细胞胚发生途径获得再生植株的技术。结果表明,试材的基因型及培养基组成影响细胞分裂及褐化;KM8P是结球白菜原生质体培养更适宜的培养基,能显著减轻细胞的褐化;液体培养基中一定浓度的活性炭能在一定程度上减轻细胞褐化进程,并有利于星状细胞团的形成;基因型Asko中,愈伤组织形成体细胞胚的结构,其发生的频率约为5%,该类体细胞胚能全部顺利地发育成完整植株。本技术具有再生植株形成容易、频率较高且通过体细胞胚发生途径等优点。 [本文引用: 1] |
| [4] | URL物种间生殖隔离在一定程度上阻碍了作物遗传育种的进程，使经性状重组以得到优良品种的工作受到限制。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，自得到首例烟草体细胞杂种以来，原生质体融合技术发展很快，已得到很多作物种、属间甚至科间体细胞杂种，越过了传统的生殖 [本文引用: 1] |
| [5] | DOI:10.3969/j.issn.1673-923X.2011.08.018URL对木本植物原生质体制备国内外研究发展历程和现状进行了回顾,详细阐述了构成木本植物原生质体制备体系的各个环节和注意事项。分析了木本植物原生质体研究早期缓慢和后期发展迅速的原因,主要是由于原生质体制备体系技术的进步。分析结果对利用木本植物原生质体进行木本植物遗传改良具有重要意义。 [本文引用: 1] |
| [6] | DOI:10.13345/j.cjb.140014URL对丹参悬浮培养细胞原生质体制备条件进行了研究，并利用FDA染色和钙离子荧光探针Fluo-3／AM装载对制备得到的原生质体的活力和功能进行了检测。丹参悬浮培养细胞原生质体的制备条件为：悬浮培养细胞酶解的适宜酶液组合为纤维素酶1．5％、果胶酶0.3％和离析酶0．5％；适宜的甘露醇浓度为0．4mol／L；酶解时间为12h；在600r／min转速下离心5min收集，纯化得到原生质体，其产量为1．1×10^6/gFW，FDA检测显示其活力为95％以上，荧光探针Fluo-3／AM可成功装载到原生质体中。 [本文引用: 1] |
| [7] | [本文引用: 1] |
| [8] | DOI:10.1038/187962a0PMID:14459425URLTHE isolation of bacterial 1 and fungal protoplasts 2,3 following the use of enzymes digesting the cell wall suggested that protoplasts might be obtained from plant cells by treatment with cellulase. Root tips of tomato seedlings ( Lycopersicum esculentum Mill. var. Sutton's ‘Best of All’) were selected for investigation and a fungal cellulase obtained from Myrothecium verrucaria 4 (kindly supplied by Dr. D. R. Whitaker, National Research Council, Canada) was employed. |
| [9] | DOI:10.1007/978-1-4939-3393-8URL [本文引用: 1] |
| [10] | DOI:10.1073/pnas.89.8.3591URL [本文引用: 1] |
| [11] | [本文引用: 1] |
| [12] | DOI:10.1038/352524a0URL [本文引用: 1] |
| [13] | DOI:10.1016/j.cell.2015.05.011URL [本文引用: 1] |
| [14] | DOI:10.2174/187152710791012035URL [本文引用: 1] |
| [15] | DOI:10.1007/BF00716828PMID:24233091URLExperimental conditions influencing DNA uptake efficiency by maize protoplasts in polyethyleneglycol (PEG) mediated transfection experiments have been studied systematically. The data provide evidence that the extracellular DNA is precipitated efficiently by combined action of PEG together with divalent cations and DNA is taken up by the plant protoplasts in the precipitated form. The particle size is strongly effected by the pH of the PEG solution. At optimal pH 6 6.5 a very fine and homogenous precipitate forms in presence of Ca 2+ and Mg 2+ ions and is efficiently incorporated by maize and rice protoplasts. |
| [16] | DOI:10.1007/BF00385097URL |
| [17] | DOI:10.1104/pp.010820PMID:11743090URLPlant protoplasts show physiological perceptions and responses to hormones, metabolites, environmental cues, and pathogen-derived elicitors, similar to cell-autonomous responses in intact tissues and plants. The development of defined protoplast transient expression systems for high-throughput screening and systematic characterization of gene functions has greatly contributed to elucidating plant signal transduction pathways, in combination with genetic, genomic, and transgenic approaches. [本文引用: 1] |
| [18] | [本文引用: 1] |
| [19] | DOI:10.1038/nchembio.522PMID:21278739URLAbstract Triptolide (1) is a structurally unique diterpene triepoxide isolated from a traditional Chinese medicinal plant with anti-inflammatory, immunosuppressive, contraceptive and antitumor activities. Its molecular mechanism of action, however, has remained largely elusive to date. We report that triptolide covalently binds to human XPB (also known as ERCC3), a subunit of the transcription factor TFIIH, and inhibits its DNA-dependent ATPase activity, which leads to the inhibition of RNA polymerase II-mediated transcription and likely nucleotide excision repair. The identification of XPB as the target of triptolide accounts for the majority of the known biological activities of triptolide. These findings also suggest that triptolide can serve as a new molecular probe for studying transcription and, potentially, as a new type of anticancer agent through inhibition of the ATPase activity of XPB. [本文引用: 1] |
| [20] | URLABSTRACT Jatropha curcas L. and Ricinus communis L. belong to Euphorbiaceae and considered as important alternative biofuel. Somatic hybridization between J. curcas L. and R. communis L. was proposed to solve low genetic variability of J. curcas L. The intergeneric hybrid will provide a novel variety which perform as an annual crop and bear fruits to ease harvesting for commercial production. Protoplast fusion between J. curcas L. and R. communis L. to create intergeneric hybrid was attempted via PEG-mediated method. Mesophyll protoplasts of J. curcas L. and calli protoplasts of R. communis L. were used in this study. Concentration and molecular weight of PEG, fusion period, microfusion and macrofusion method were optimized. The highest (66%) viability of heterokaryon was obtained from using 30% PEG (MW6000) assisted with macrofusion method for 10 minutes. 89 Index Terms—Jatropha curcas L., Ricinus communis L. protoplast fusion, PEG-mediated method. [本文引用: 1] |
| [21] | DOI:10.1007/s11064-008-9691-zURL [本文引用: 1] |
| [22] | DOI:10.1038/nbt.3389PMID:26479191URLAbstract Editing plant genomes without introducing foreign DNA into cells may alleviate regulatory concerns related to genetically modified plants. We transfected preassembled complexes of purified Cas9 protein and guide RNA into plant protoplasts of Arabidopsis thaliana, tobacco, lettuce and rice and achieved targeted mutagenesis in regenerated plants at frequencies of up to 46%. The targeted sites contained germline-transmissible small insertions or deletions that are indistinguishable from naturally occurring genetic variation. [本文引用: 2] |
| [23] | [本文引用: 1] |
| [24] | [本文引用: 1] |
| [25] | DOI:10.1039/c2np00088aPMID:22270059URLCovering: 1972 to 2011 Triptolide, a principal bioactive ingredient ofTripterygium wilfordiiHook F, has attracted extensive exploration due to its unique structure of a diterpenoid triepoxide and multiple biological activities. This review will focus on the structural modifications, structure–activity relationships, pharmacology, and clinical development of triptolide in the last forty years. [本文引用: 1] |
一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立
2
2014
... 酶解法通过混合酶将细胞壁的成分降解, 使原生质体充分暴露出来(
... 目前, 在原生质体纯化过程中使用较多的是离心沉降法.该方法的优点是快速便捷, 但得到的原生质体常常出现大小不均和破碎等情况.因此, 实验过程中要根据细胞的具体情况选择适合的离心力.用于原生质体纯化的离心力大小一般介于60-100 ×g之间, 本研究中采用67 ×g的离心力可以获得产量较高且杂质较少的原生质体.除了离心沉降法以外, 还可以通过密度梯度自然沉降法对原生质体进行纯化, 该方法虽然相对耗时, 但得到的原生质体大小均一、形态完整且无杂质(
棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立
1
2014
... 酶解法通过混合酶将细胞壁的成分降解, 使原生质体充分暴露出来(
结球白菜下胚轴原生质体培养及其体细胞胚植株再生
1
2006
... 原生质体是快速、高效分析植物基因功能的良好材料, 在植物功能基因组研究中发挥重要作用.此外, 细胞具有全能性, 转化后的原生质体依然具有再生植株的能力(
植物原生质体非对称融合及其在育种上的应用
1
1999
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
木本植物原生质体制备体系的研究进展
1
2011
... 酶解法通过混合酶将细胞壁的成分降解, 使原生质体充分暴露出来(
丹参悬浮培养细胞原生质体的制备和活力检测
1
2014
... 酶解法通过混合酶将细胞壁的成分降解, 使原生质体充分暴露出来(
1
2012
... 中药雷公藤为根类药材, 来源于卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)的根.其味辛、苦, 性凉, 具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛以及杀虫止血等功效.雷公藤的主要活性物质为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类.具有抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等作用(
1960
1
2016
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
1
1992
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
1
2006
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
1
1991
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
1
2015
... 中药雷公藤为根类药材, 来源于卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)的根.其味辛、苦, 性凉, 具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛以及杀虫止血等功效.雷公藤的主要活性物质为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类.具有抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等作用(
1
2010
... 中药雷公藤为根类药材, 来源于卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)的根.其味辛、苦, 性凉, 具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛以及杀虫止血等功效.雷公藤的主要活性物质为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类.具有抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等作用(
1989
1970
1
2001
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
1
2016
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
1
2011
... 中药雷公藤为根类药材, 来源于卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)的根.其味辛、苦, 性凉, 具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛以及杀虫止血等功效.雷公藤的主要活性物质为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类.具有抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等作用(
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2015
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
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2008
... 中药雷公藤为根类药材, 来源于卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)的根.其味辛、苦, 性凉, 具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛以及杀虫止血等功效.雷公藤的主要活性物质为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类.具有抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等作用(
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2015
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
... 原生质体是快速、高效分析植物基因功能的良好材料, 在植物功能基因组研究中发挥重要作用.此外, 细胞具有全能性, 转化后的原生质体依然具有再生植株的能力(
1
2015
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
1
2015
... 原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”细胞, 最外层由1层质膜包围, 内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核, 具有细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.早在20世纪60年代初期, 原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking (1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的实验方法.此外, 20世纪70年代初, Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂.原生质体的应用非常广泛, 由于缺少细胞壁, 避免了远缘杂交不亲和性的问题, 为获得具有优良性状的植物提供了一种新方法(
1
2012
... 中药雷公藤为根类药材, 来源于卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)的根.其味辛、苦, 性凉, 具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛以及杀虫止血等功效.雷公藤的主要活性物质为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类.具有抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等作用(
