宋爱华¹, 张文斌¹, 孙姝兰¹, 李凌飞^1,2,*,, 王小菁^1
1华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州 510631
²深圳市中国科学院仙湖植物园, 深圳市南亚热带植物多样性重点实验室, 深圳 518004
Song Aihua¹, Zhang Wenbin¹, Sun Shulan¹, Li Lingfei^1,2,*,, Wang Xiaojing^1
1Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China
²Key Laboratory of Southern Subtropical Plant Diversity, Fairy Lake Botanical Garden, Shenzhen & Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518004, China;
引用本文
宋爱华, 张文斌, 孙姝兰, 李凌飞, 王小菁. 非洲菊原生质体制备及瞬时转化系统的建立. , 2017, 52(4): 511-519

贡献者
* 通讯作者。E-mail: lingfei_li@m.scnu.edu.cn
基金资助
基金项目: 国家自然科学基金(No.31372099, No.31601784)、教育部高等学校博士学科点专项科研基金(No.20104407110005)和广东省自然科学基金(No.9251063101000002);
接受日期:2016-07-22接受日期:2016-10-16网络出版日期:2017-07-1
-->Copyright
20172010 《植物学报》编辑部

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Contributors
* Author for correspondence. E-mail: lingfei_li@m.scnu.edu.cn

History
Received:Accepted:Online:

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摘要:非洲菊(Gerbera hybrida)已成为研究复杂花序进化与发育的模式植物。以非洲菊无菌组培苗叶片为材料, 分析不同浓度纤维素酶及离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响, 建立了稳定、高效的非洲菊原生质体提取与瞬时转化体系。结果表明, 以2.0%纤维素酶+0.3%离析酶组合, 在0.4 mol·L^-1甘露醇溶液中, 酶解4小时, 酶解温度为25°C, 得到产量高达2.2×10⁷个·g^-1 FW及活力较高的原生质体, 可直接用于植物蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用实验, 转化效率达80%。该研究建立了非洲菊原生质体制备和瞬时转化体系, 为非洲菊基因功能研究奠定重要的技术基础。
关键词: 非洲菊, ; 原生质体制备, ; 瞬时表达, ; 蛋白互作

Abstract: Gerbera hybrida has been used as model plant to study the evolution and development of composite inflorescences. To establish an efficient protoplast isolation and transient transformation system in G. hybrida, leaves of cultivar ‘Shenzhen No. 5’ in vitro seedlings were used as materials and the effects of different concentrations of cellulase R10 and macerozyme were tested to screen a suitable preparation method. The best enzyme solution concentration consisted of cellulase R10 2.0% (w/v), macerozyme 0.3% (w/v), and 0.4 mol·L^-1 mannitol and more than 2.2×10⁷∙g^-1 FW protoplasts with high activity were obtained after 4 h treatment under 25°C condition. Subcellular localization and protein-protein interaction assays were performed using these protoplasts and revealed 80% transformation rate. Collectively, this study established an efficient protoplast isolation and transient assay system that can provide an important platform to facilitate gene function studies in G. hybrida.

Key words:Gerbera hybrida, ; protoplasts preparation, ; transient expression, ; protein-protein interaction


植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009)。细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014)。原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014)。在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用。而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道。

在进化上有明显优势的菊科植物是23 000多种开花植物中最大的分支(Broholm et al., 2008)。非洲菊(Gerbera hybrida)为菊科大丁草属多年生常绿草本植物, 可作为研究菊科植物器官生长发育调控的模式植物(Teeri et al., 2006; Laitinen et al., 2007; Broholm et al., 2008; Li et al., 2015)。与其它模式植物(如拟南芥或烟草)相比, 非洲菊遗传背景较为复杂、基因数量多、遗传转化困难, 其分子机制研究更难, 而原生质体提取及瞬时转化则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径(舒小娟等, 2015)。近年来, 随着对非洲菊的深入研究, 许多基因功能的揭示需要回到植株器官或细胞中, 其中包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用。目前, 非洲菊原生质体研究进展缓慢, 大多处于分离阶段, 且效率非常低, 也并未用于遗传转化研究(李丹等, 2009)。因此, 建立高效的非洲菊原生质体提取及瞬时转化体系十分必要。本研究借鉴前人经验, 以非洲菊组培苗叶片为材料, 利用不同浓度纤维素酶和离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响进行了探索, 并在此基础上建立瞬时转化体系。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料和试剂
取生长2个月的深圳5号(Shenzhen No.5, S5)非洲菊(Gerbera hybrida L.)无菌小苗, 在温度为(24±1)°C、相对湿度为60%-80%、16小时光照/8小时黑暗条件下培养。纤维素酶R10与离析酶购自日本Yakult Honsha公司, 其它常规试剂购自广州威佳生物科技有限公司。
1.1.2 载体
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)载体pSAT6-cYFP-IBH1和pSAT6- nYFP-HBI1及绿色荧光蛋白GFP与黄色荧光蛋白YFP蛋白定位空载体均由本实验室保存。将GFP空载体直接连接到PcanG表达载体上, 由35S强启动子驱动, 大小约为13 kb。YFP空载体由pBluescript II Pha- gemid载体改造而来, 在35S强启动子和MCS之间插入YFP片段, 大小约为3 kb。

1.2 方法1.2.1 植物材料的选取
选取继代次数3代以内的S5非洲菊组培苗, 经扩繁培养2个月, 其叶片已完全展开。剪取0.5-1 g新鲜幼嫩的叶片用于原生质体提取。
1.2.2 酶液配制
每组处理分别配制10 mL酶反应液。反应液中含有以下组分: 5 mL 0.8 mol·L^-1甘露醇(终浓度0.4 mol·L^-1), 1 mL 0.2 mol·L^-1 KCl (终浓度20 mmol·L^-1), 2 mL 0.1 mol·L^-1 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES) (pH5.7, 终浓度20 mmol·L^-1), 不同浓度的纤维素酶R10与离析酶。纤维素酶R10浓度梯度为1.0%、1.5%、2.0%和2.5%; 离析酶浓度梯度为0.1%、0.3%、0.5%及0.7%。酶液最后用0.22 μm或0.45 μm无菌过滤器过滤以去除杂质。将配制好的酶液置于55°C水浴锅中恒温保温10分钟, 再冷却至室温备用。
1.2.3 原生质体分离
将挑选好的叶片10片, 用新拆封的锋利刀片切成0.5-1 mm宽的小条, 然后迅速置于10 mL酶液中, 在25°C暗处反应4小时后取出。取反应液并轻轻摇晃, 使原生质体充分释放。
1.2.4 原生质体纯化
原生质体纯化参考Yoo等(2007)的方法进行, 并略有改动。在原生质体分离反应液中加入等体积(10 mL)的W5溶液(其成分为5 mmol·L^-1葡萄糖、1.5 mmol·L^-1 pH5.7 MES、154 mmol·L^-1 NaCl、125 mmol·L^-1 CaCl₂及5 mmol·L^-1 KCl); 用剪去头部的1 mL枪头吸取反应液, 用75 μm的尼龙滤网收集原生质体; 用圆底离心管收集原生质体, 4°C下60 ×g离心10分钟; 去除上清, 用等体积的W5溶液轻轻重悬(注意最好剪去枪头的头部, 加入W5时一定要缓慢并沿管壁加入, 然后用手指轻弹管壁), 4°C下60 ×g继续离心10分钟; 重复此步骤1次。将原生质体转移到2 mL离心管中, 最后加入1 mL MMg溶液(其成分为0.4 mol·L^-1甘露醇、15 mmol·L^-1 MgCl₂及4 mmol·L^-1 pH5.7 MES)重悬。
1.2.5 原生质体浓度测定
用剪去头部的枪头吸取收集得到的原生质体, 滴加到血球计数板(规格为16×25)上, 在光学显微镜下观察计数, 统计4个角上大格内的原生质体含量。每个样品计数至少3个重复, 最后计算原生质体的产量。实验设3次生物学重复。计数原生质体的方法如下: 先用乙醇轻轻擦洗血球计数板, 然后用蒸馏水冲洗干净, 再用吸水纸吸干; 将盖玻片盖到计数室上; 用移液器吸取悬浮混匀后的原生质体滴到盖玻片一侧边缘, 让其沿着盖玻片和计数板之间的缝隙渗入计数室, 直至充满计数室为止; 计数时使显微镜载物台保持水平, 依次逐个计数4个角大方格内25个中方格内的原生质体。根据以下公式计算出每毫升中原生质体的数目: 原生质体含量(个∙mL^-1)=4个大格内原生质体总数×4× 10 000×稀释倍数。原生质体产量, 即每克鲜重材料所得的原生质体个数(个·g^-1 FW)=(原生质体含量(个∙mL^-1)×稀释后体积(mL))/用于原生质体提取的叶片总鲜重(g)
1.2.6 原生质体质量检测
吸取悬浮后的原生质体置于架空的玻片上, 在光学显微镜下观察其完整性, 并在培养24小时后用激光共聚焦扫描显微镜检测其完整性、叶绿体分布状况及空载体GFP或YFP的转化效率, 以此综合评价原生质体质量。其中转化效率统计结果为3次生物学重复的平均值, 每次重复至少统计4个具有代表性视野中转化成功的原生质体数和原生质体总数。按以下公式计算转化效率: 转化效率(%)=(转化成功的原生质体数/原生质体总数)×100%。
1.2.7 外源基因在原生质体中的瞬时转化及表达
瞬时转化采用聚乙二醇-钙(PEG-Ca²⁺)介导转化法进行。将重悬于MMg溶液中的非洲菊原生质体按每管100 μL分装在2 mL的离心管中, 加入10 μg BiFC质粒(5 μg n-YFP+5 μg c-YFP)轻轻混匀; 缓慢加入等体积(110 μL)的PEG-Ca²⁺溶液(其成分为40% PEG4000、0.2 mol·L^-1甘露醇及0.1 mol·L^-1 CaCl₂), 用手指轻弹混匀, 室温放置6分钟; 加入等体积(220 μL)的W5溶液, 用手指轻弹混匀, 冰上放置1分钟; 重复此步骤4次; 4°C下100 ×g离心10分钟, 弃上清; 用大约100 μL的W5溶液轻轻重悬原生质体, 将转化后的离心管平放在培养皿中, 23°C黑暗下孵育24小时。
将培养后的共转化原生质体在激光共聚焦扫描显微镜(20倍物镜)下观察转化成功的原生质体中YFP荧光。扫描参数设置为: 激发波长(ex) 512 nm, 释放波长(em) 527-532 nm。当2个蛋白发生相互作用并在活细胞内表达形成融合蛋白时, 能观察到清晰的黄色荧光。

2 结果与讨论2.1 酶解液组合对原生质体产量、活力及转化效率的影响本研究以S5无菌苗的叶片为材料(图1A), 探索非洲菊原生质体的最适提取方法。通过设计不同浓度纤维素酶及离析酶组合, 检测其对非洲菊原生质体提取效率的影响。结果显示, 在离析酶浓度(0.3%)一定的条件下, 随着纤维素酶浓度的升高, 原生质体提取的产量逐渐提高, 在浓度为2.0%时达到峰值, 产量达2.2× 10⁷个·g^-1 FW, 但随着浓度进一步提高, 原生质体的产量反而降低(图1B); 在纤维素酶浓度设定为2.0%时, 不同浓度离析酶对原生质体产量的影响也出现随着浓度的增加先升高后降低的趋势, 在离析酶浓度为0.3%时提取效果最佳(图1C)。光学显微镜下显示分离获得的非洲菊原生质体形态完整, 呈规则的圆形, 大部分原生质体为绿色, 少部分由于缺少叶绿体的缘故, 呈现出透明状(图1D)。
图1https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-4-511/img_1.png
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图1
非洲菊原生质体提取效果^(A) 扩繁培养2个月的S5非洲菊组培苗叶片(Bar=1 cm); (B) 在离析酶浓度为0.3%时, 不同浓度纤维素酶对非洲菊原生质体提取产量的影响; (C) 在纤维素酶浓度为2.0%时, 不同浓度离析酶对原生质体提取产量的影响; (D) 光学显微镜下原生质体形态观察, 原生质体来自2.0%纤维素酶+0.3%离析酶的提取结果(Bar=200 μm)
Figure 1
Isolation efficiency of protoplast in Gerbera hybrid^(A) Leaves isolated from two-month-old in vitro seedlings (Bar=1 cm); (B) Protoplast yields under different cellulase R10 concentrations with 0.3% macerozyme; (C) Protoplast yields under different macerozyme concentrations with 2.0% cellulase R10; (D) Morphological characteristics of protoplasts, isolated from 2.0% cellulase R10 +0.3% macerozyme, observed by optical microscope (Bar=200 μm)


为了检测原生质体是否具有足够的活力, 将其经过处理制备成感受态后转化GFP空载体质粒。培养36小时, 在激光共聚焦扫描显微镜下观察。结果显示, 原生质体形态规则, 基本没有出现破裂的情况, 并且大部分原生质体均成功转化了GFP, 原生质体中表达GFP的区域呈现绿色荧光, 而未表达GFP的区域则不发光, 转化效率达80% (图2)。为了检测非洲菊叶肉原生质体进行亚细胞定位的情况, 将GFP和YFP空载体质粒分别转化原生质体, 经上述步骤培养和观察, 结果显示, 转化成功后, 分别在细胞质、质膜及细胞核等部位表达出GFP和YFP蛋白(图3A, B)。由此可见, 在2.0%纤维素酶+0.3%离析酶的酶组合下提取非洲菊叶片原生质体适用于蛋白的亚细胞定位研究。
图2https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-4-511/img_2.png
Figure 2https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-4-511/img_2.png

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图2
非洲菊原生质体转化效率^图示激光共聚焦扫描显微镜下观察原生质体转化效率。从左到右分别为GFP荧光、叶绿体自发荧光及两者叠加图。箭头示未转化成功的原生质体。Bar=100 μm
Figure 2
Transformation efficiency of protoplast in Gerbera hybrid^Transformation efficiency of protoplast observed by laser confocal scanning microscope. From left to right are GFP fluorescence, chloroplast autofluorescence, and a merge of above. Arrows indicate the protoplasts with unsuccessful transformation. Bar=100 μm


图3https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-4-511/img_3.png
Figure 3https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-4-511/img_3.png

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图3
GFP和YFP在非洲菊原生质体中的亚细胞定位^(A) 激光共聚焦扫描显微镜下转GFP空载体的原生质体, 从左到右分别为GFP荧光、叶绿体自发荧光、白光及叠加图; (B) 激光共聚焦扫描显微镜下转YFP空载体的原生质体, 从左到右分别为YFP荧光、叶绿体自发荧光、白光及叠加图。Bar=10 μm
Figure 3
Subcellular localization of GFP and YFP in protoplasts from Gerbera hybrid^(A) Subcellular localization of GFP by laser confocal scanning microscope, from left to right are GFP fluorescence, chloroplast autofluorescence, bright, and a merge of above; (B) Subcellular localization of YFP by laser confocal scanning microscope, from left to right are YFP fluorescence, chloroplast autofluorescence, bright, and a merge of above. Bar=10 μm



2.2 非洲菊叶片原生质体的共转化利用原生质体进行蛋白相互作用研究是常见的策略。为了验证非洲菊原生质体具有该潜力, 选取拟南芥中能够相互作用的2个转录因子IBH1和HBI1 (Bai et al., 2012; Fan et al., 2014; Malinovsky et al., 2014)探究上述原生质体提取体系能否应用于遗传共转化实验。利用IBH1-nYFP和HBI1-cYFP共转化非洲菊原生质体, 通过原生质体荧光定位, 能直接观察到IBH1和HBI1互作所形成的复合体在原生质体中的定位情况。结果显示, 与IBH1-nYFP+cYFP和HBI1-cYFP+nYFP阴性对照相比, 在共转化IBH1-nYFP和HBI1-cYFP质粒的细胞核中能观察到强烈的YFP荧光信号(图4)。
图4https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-4-511/img_4.png
Figure 4https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-4-511/img_4.png

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图4
用双分子荧光互补技术(BiFC)分析IBH1和HBI1蛋白互作^IBH1-nYFP与HBI1-cYFP分别代表IBH1和HBI1连接在YFP的N端片段和C端片段上, IBH1-nYFP+cYFP和HBI1-cYFP+nYFP为阴性对照。Bar=10 μm
Figure 4
Analysis of interaction of IBH1 and HBI1 by bimolecular fluorescence complementation (BiFC)^IBH1-nYFP and HBI1-cYFP represent IBH1 and HBI1 connected to the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of YFP, respectively. IBH1-nYFP+cYFP and HBI1-cYFP+nYFP were used as negative control. Bar=10 μm



2.3 讨论据文献报道, 原生质体可来源于愈伤组织(王欢等, 2014)、幼嫩的叶片(Yoo et al., 2007; 赵苏州等, 2014; 李妮娜等, 2014)、茎和下胚轴(马占强等, 2005)等, 但最普遍且方便的来源应是生长在温室中或无菌苗的叶片。陈名红等(2005)发现, 如果采用无菌苗的叶片来制备叶肉原生质体既能免去表面消毒的操作环节又能减少感菌的可能。在条件允许的情况下, 应优先考虑使用无菌苗。因此, 本研究利用生长2个月且状态良好的非洲菊无菌小苗叶片作为外植体制备原生质体, 取得了较好的结果。目前提取原生质体所用的酶主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶, 其中使用最广泛的是纤维素酶与离析酶。纤维素酶一般使用浓度为1.25%-3%, 离析酶浓度为0.15%-0.75%。酶液组合和配比是影响原生质体产量和活性的关键因素。在原生质体制备实验中, 纤维素酶和离析酶是最常见的组合, 所以本研究也选择该酶液组合。但制备不同原生质体的材料的细胞壁组成和结构有差异, 酶浓度也有所不同, 如葡萄叶片原生质体分离的最佳酶浓度为3.0%纤维素酶+0.75%离析酶(舒小娟等, 2015); 而苦荞(Fagopyrum tataricum)叶肉细胞原生质体分离的最优酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%离析酶(张钟仁和陈鹏, 2016)。比较不同物种间原生质体提取效果及转化效果表明, 拟南芥原生质体提取及转化系统建立相对完善。Sheen实验室以4周大小的拟南芥植株的第5、6、7片莲座叶为材料, 利用1.5%纤维素酶+0.4%离析酶提取获得的原生质体活力极佳, 通过PEG-Ca²⁺介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007)。完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%。在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C)。纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力。研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性。
目前原生质体在基因工程及分子生物学研究中都已得到普遍应用(Sheen, 2001)。采用GFP和YFP荧光标记, 通过激光共聚焦显微镜检测, 可以简单方便地确定目标蛋白在细胞中的定位(周波等, 2008)。Cao等(2011)采用目的基因融合GFP的方法, 可清晰地观察到单糖转运蛋白OsGMST1位于高尔基体上。Tang等(2012)利用原生质体技术定位水稻(Oryza sativa)硝酸盐转运蛋白OsNRT2.3a, 发现其主要位于细胞膜上。现有的原生质体转化方法主要有PEG-Ca²⁺介导转化、电转化及显微注射3种(Yoo et al., 2007)。我们利用PEG-Ca²⁺介导转化法将提取得到的原生质体进行GFP和YFP空载体转化, 转化效率高达80% (图2), 且瞬时表达出蛋白(图3)。一般认为, 转化效率在50%以上可以用于常规的分子机理研究(Yoo et al., 2007), 因此, 本实验建立的提取及转化系统可用于研究蛋白质的亚细胞定位。
BiFC是一种可快速、直观判断2个蛋白是否互作以及确定互作定位的新技术。该技术是将黄色荧光蛋白分子(YFP)在特定的位点切开, 分为N端和C端, 然后分别与目标蛋白融合表达, 如果荧光蛋白活性恢复, 则表明目标蛋白之间发生相互作用(崔喜艳等, 2013)。本实验运用的BiFC质粒pSAT6-cYFP-IBH1和pSAT6- nYFP-HBI1共转化原生质体后在细胞核中检测到黄色荧光信号(图4), 说明IBH1和HBI1在非洲菊细胞内相互结合。目前通过合适的方法均可以顺利分离得到不少物种的原生质体, 而对非洲菊的原生质体提取及遗传转化的相关报道较少。近年来, 随着对非洲菊研究的不断深入, 越来越多的机理需要回到器官或细胞中揭示, 如蛋白之间的互作关系。Elomma等(2003)对GMYB10的功能进行解析, 发现超表达该转录因子可以激活营养器官中的花色素苷合成。酵母双杂交实验证明, 该蛋白发挥功能需要与另一转录因子GMYC1发生互作才能完成。但在实际情况下, 非洲菊中超表达GMYC1后并没有促进花色素苷的积累, 因此非洲菊体内这2个蛋白是否互作还需验证。同样地, 该课题组对CYC-like (CYCLOIDEA-like)家族成员的进化关系进行研究, 由于没有很好的实验系统, 只能用酵母双杂交技术对它们之间是否形成同源二聚体或异源二聚体进行解析(Tahtiharju et al., 2012)。后续该课题组利用烟草瞬时转化及BiFC实验进行验证, 部分蛋白间互作并没有得到很好的结果。因此本实验建立的高效非洲菊原生质体提取方法及转化体系能满足后续的实验需求, 将为非洲菊及其它植物发育的分子机理研究提供技术支持。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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被引期刊影响因子

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[14]	An Cl, Sawada A, Kawaguchi Y, Fukusaki E, Kobayashi A (2005). Transient RNAi induction against endogenous genes in Arabidopsis protoplasts using in vitro prepared double-stranded RNA. Biosci Biotechnol Biochem 69, 415-418. [本文引用: 1]
[15]	Bai MY, Fan M, Oh E, Wang ZY (2012). A triple helix-loop- helix/basic helix-loop-helix cascade controls cell elonga- tion downstream of multiple hormonal and environmental signaling pathways in Arabidopsis.Plant Cell 24, 4917-4929. [本文引用: 1]
[16]	Broholm SK, Tahtiharju S, Laitinen RA, Albert VA, Teeri TH, Elomaa P (2008). A TCP domain transcription factor controls flower type specification along the radial axis of theGerbera(Asteraceae) inflorescence. Proc Natl Acad Sci USA 105, 9117-9122. [本文引用: 2]
[17]	Cao H, Guo S, Xu Y, Jiang K, Jones AM, Chong K (2011). Reduced expression of a gene encoding a golgi localized monosaccharide transporter (OsGMST1) confers hypersensitivity to salt in rice (Oryza sativa). J Exp Bot 62, 4595-4604.
[18]	David H, Laigneau C, David A (1989). Growth and soluble proteins of cell cultures derived from explants and protoplasts ofPinus pinaster cotyledons. Tree Physiol 5, 497-506. [本文引用: 1]
[19]	Elomaa P, Uimari A, Mehto M, Albert VA, Laitinen RA, Teeri TH (2003). Activation of anthocyanin biosynthesis in Gerbera hybrida(Asteraceae) suggests conserved protein-protein and protein-promoter interactions between the anciently diverged monocots and eudicots. Plant Physiol 133, 1831-1842.
[20]	Fan M, Bai MY, Kim JG, Wang T, Oh E, Chen L, Park CH, Son SH, Kim SK, Mudgett MB, Wang ZY (2014). The bHLH transcription factor HBI1 mediates the trade-off between growth and pathogen-associated molecular pat- tern-triggered immunity in Arabidopsis.Plant Cell 26, 828-841. [本文引用: 1]
[21]	Fontes N, Silva R, Vignault C, Lecourieux F, Gerós H, Delrot S (2010). Purification and functional characterization of protoplasts and intact vacuoles from grape cells.BMC Res Notes 3, 19. [本文引用: 1]
[22]	Guo J, Morrell-Falvey JL, Labbé JL, Muchero W, Kalluri UC, Tuskan GA, Chen JG (2012). Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays. PLoS One 7, e44908. [本文引用: 1]
[23]	Jones AM, Chattopadhyay A, Shukla M, Zoń J, Saxena PK (2012). Inhibition of phenylpropanoid biosynthesis increases cell wall digestibility, protoplast isolation, and facilitates sustained cell division in American elm (Ulmus americana). BMC Plant Biol 12, 1-11. [本文引用: 1]
[24]	Laitinen RA, Pollanen E, Teeri TH, Elomaa P, Kotilainen M (2007). Transcriptional analysis of petal organogenesis in Gerbera hybrida. Planta 226, 347-360. [本文引用: 1]
[25]	Li LF, Zhang WB, Zhang LL, Li N, Peng JZ, Wang YQ, Zhong CM, Yang YP, Sun SL, Liang S, Wang XJ (2015). Transcriptomic insights into antagonistic effects of gibbe- rellin and abscisic acid on petal growth in Gerbera hybrida. Front Plant Sci 6, 168. [本文引用: 1]
[26]	Liqing Z, Bochu W, Jing Z, Lingxi C, Chuanyun D, Chu- anren D (2005). Protoplast isolation of callus inEchinacea augustifolia. Colloids Surf B Biointerfaces 44, 1-5. [本文引用: 1]
[27]	Lung SC, Smith MD, Chuong SD (2015). Isolation of chloroplasts from plant protoplasts.Cold Spring Harb Pro- toc 2015, 895-899. [本文引用: 1]
[28]	Malinovsky FG, Batoux M, Schwessinger B, Youn JH, Stransfeld L, Win J, Kim SK, Zipfel C (2014). Antago- nistic regulation of growth and immunity by the Arabidopsis basic helix-loop-helix transcription factor HOMOLOG OF BRA- SSINOSTEROID ENHANCED EXPRESSION2 INTERACTING WITH INCREASED LEAF INCLINATION1 BINDING bHLH1.Plant Physiol 164, 1443-1455. [本文引用: 1]
[29]	Mazarei M, Al-Ahmad H, Rudis MR, Jr Stewart CN (2008). Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass,Panicum virgatum L. Biotech J 3, 354-359. [本文引用: 1]
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[31]	Tahtiharju S, Rijpkema AS, Vetterli A, Albert VA, Teeri TH, Elomaa P (2012). Evolution and diversification of the CYC/TB1 gene family in Asteraceae—a comparative study in Gerbera(Mutisieae) and sunflower (Heliantheae). Mol Biol Evol 29, 1155-1166. [本文引用: 1]
[32]	Tang Z, Fan X, Li Q, Feng H, Miller AJ, Shen Q, Xu G (2012). Knockdown of a rice stelar nitrate transporter alters long-distance translocation but not root influx.Plant Phy- siol 160, 2052-2063.
[33]	Teeri TH, Elomaa P, Kotilainen M, Albert VA (2006). Mining plant diversity:Gerbera as a model system for plant developmental and biosynthetic research. Bioessays 28, 756-767. [本文引用: 1]
[34]	Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Protoc 2, 1565-1572. [本文引用: 5]

烟草叶肉原生质体分离和纯化研究
2005

双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSI与PPKD1之间的蛋白互作
1
2013

... BiFC是一种可快速、直观判断2个蛋白是否互作以及确定互作定位的新技术.该技术是将黄色荧光蛋白分子(YFP)在特定的位点切开, 分为N端和C端, 然后分别与目标蛋白融合表达, 如果荧光蛋白活性恢复, 则表明目标蛋白之间发生相互作用(崔喜艳等, 2013).本实验运用的BiFC质粒pSAT6-cYFP-IBH1和pSAT6- nYFP-HBI1共转化原生质体后在细胞核中检测到黄色荧光信号(图4), 说明IBH1和HBI1在非洲菊细胞内相互结合.目前通过合适的方法均可以顺利分离得到不少物种的原生质体, 而对非洲菊的原生质体提取及遗传转化的相关报道较少.近年来, 随着对非洲菊研究的不断深入, 越来越多的机理需要回到器官或细胞中揭示, 如蛋白之间的互作关系.Elomma等(2003)对GMYB10的功能进行解析, 发现超表达该转录因子可以激活营养器官中的花色素苷合成.酵母双杂交实验证明, 该蛋白发挥功能需要与另一转录因子GMYC1发生互作才能完成.但在实际情况下, 非洲菊中超表达GMYC1后并没有促进花色素苷的积累, 因此非洲菊体内这2个蛋白是否互作还需验证.同样地, 该课题组对CYC-like (CYCLOIDEA-like)家族成员的进化关系进行研究, 由于没有很好的实验系统, 只能用酵母双杂交技术对它们之间是否形成同源二聚体或异源二聚体进行解析(Tahtiharju et al., 2012).后续该课题组利用烟草瞬时转化及BiFC实验进行验证, 部分蛋白间互作并没有得到很好的结果.因此本实验建立的高效非洲菊原生质体提取方法及转化体系能满足后续的实验需求, 将为非洲菊及其它植物发育的分子机理研究提供技术支持. ...

正交实验优选非洲菊叶片原生质体分离条件研究
1
2009

... 在进化上有明显优势的菊科植物是23 000多种开花植物中最大的分支(Broholm et al., 2008).非洲菊(Gerbera hybrida)为菊科大丁草属多年生常绿草本植物, 可作为研究菊科植物器官生长发育调控的模式植物(Teeri et al., 2006; Laitinen et al., 2007; Broholm et al., 2008; Li et al., 2015).与其它模式植物(如拟南芥或烟草)相比, 非洲菊遗传背景较为复杂、基因数量多、遗传转化困难, 其分子机制研究更难, 而原生质体提取及瞬时转化则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径(舒小娟等, 2015).近年来, 随着对非洲菊的深入研究, 许多基因功能的揭示需要回到植株器官或细胞中, 其中包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用.目前, 非洲菊原生质体研究进展缓慢, 大多处于分离阶段, 且效率非常低, 也并未用于遗传转化研究(李丹等, 2009).因此, 建立高效的非洲菊原生质体提取及瞬时转化体系十分必要.本研究借鉴前人经验, 以非洲菊组培苗叶片为材料, 利用不同浓度纤维素酶和离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响进行了探索, 并在此基础上建立瞬时转化体系. ...

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立
1
2014

... 据文献报道, 原生质体可来源于愈伤组织(王欢等, 2014)、幼嫩的叶片(Yoo et al., 2007; 赵苏州等, 2014; 李妮娜等, 2014)、茎和下胚轴(马占强等, 2005)等, 但最普遍且方便的来源应是生长在温室中或无菌苗的叶片.陈名红等(2005)发现, 如果采用无菌苗的叶片来制备叶肉原生质体既能免去表面消毒的操作环节又能减少感菌的可能.在条件允许的情况下, 应优先考虑使用无菌苗.因此, 本研究利用生长2个月且状态良好的非洲菊无菌小苗叶片作为外植体制备原生质体, 取得了较好的结果.目前提取原生质体所用的酶主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶, 其中使用最广泛的是纤维素酶与离析酶.纤维素酶一般使用浓度为1.25%-3%, 离析酶浓度为0.15%-0.75%.酶液组合和配比是影响原生质体产量和活性的关键因素.在原生质体制备实验中, 纤维素酶和离析酶是最常见的组合, 所以本研究也选择该酶液组合.但制备不同原生质体的材料的细胞壁组成和结构有差异, 酶浓度也有所不同, 如葡萄叶片原生质体分离的最佳酶浓度为3.0%纤维素酶+0.75%离析酶(舒小娟等, 2015); 而苦荞(Fagopyrum tataricum)叶肉细胞原生质体分离的最优酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%离析酶(张钟仁和陈鹏, 2016).比较不同物种间原生质体提取效果及转化效果表明, 拟南芥原生质体提取及转化系统建立相对完善.Sheen实验室以4周大小的拟南芥植株的第5、6、7片莲座叶为材料, 利用1.5%纤维素酶+0.4%离析酶提取获得的原生质体活力极佳, 通过PEG-Ca²⁺介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007).完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%.在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C).纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力.研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性. ...

烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用
2
2014

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...
... ), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

紫罗兰下胚轴原生质体分离条件的研究
1
2005

... 据文献报道, 原生质体可来源于愈伤组织(王欢等, 2014)、幼嫩的叶片(Yoo et al., 2007; 赵苏州等, 2014; 李妮娜等, 2014)、茎和下胚轴(马占强等, 2005)等, 但最普遍且方便的来源应是生长在温室中或无菌苗的叶片.陈名红等(2005)发现, 如果采用无菌苗的叶片来制备叶肉原生质体既能免去表面消毒的操作环节又能减少感菌的可能.在条件允许的情况下, 应优先考虑使用无菌苗.因此, 本研究利用生长2个月且状态良好的非洲菊无菌小苗叶片作为外植体制备原生质体, 取得了较好的结果.目前提取原生质体所用的酶主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶, 其中使用最广泛的是纤维素酶与离析酶.纤维素酶一般使用浓度为1.25%-3%, 离析酶浓度为0.15%-0.75%.酶液组合和配比是影响原生质体产量和活性的关键因素.在原生质体制备实验中, 纤维素酶和离析酶是最常见的组合, 所以本研究也选择该酶液组合.但制备不同原生质体的材料的细胞壁组成和结构有差异, 酶浓度也有所不同, 如葡萄叶片原生质体分离的最佳酶浓度为3.0%纤维素酶+0.75%离析酶(舒小娟等, 2015); 而苦荞(Fagopyrum tataricum)叶肉细胞原生质体分离的最优酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%离析酶(张钟仁和陈鹏, 2016).比较不同物种间原生质体提取效果及转化效果表明, 拟南芥原生质体提取及转化系统建立相对完善.Sheen实验室以4周大小的拟南芥植株的第5、6、7片莲座叶为材料, 利用1.5%纤维素酶+0.4%离析酶提取获得的原生质体活力极佳, 通过PEG-Ca²⁺介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007).完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%.在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C).纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力.研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性. ...

葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立
3
2015

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...
... 在进化上有明显优势的菊科植物是23 000多种开花植物中最大的分支(Broholm et al., 2008).非洲菊(Gerbera hybrida)为菊科大丁草属多年生常绿草本植物, 可作为研究菊科植物器官生长发育调控的模式植物(Teeri et al., 2006; Laitinen et al., 2007; Broholm et al., 2008; Li et al., 2015).与其它模式植物(如拟南芥或烟草)相比, 非洲菊遗传背景较为复杂、基因数量多、遗传转化困难, 其分子机制研究更难, 而原生质体提取及瞬时转化则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径(舒小娟等, 2015).近年来, 随着对非洲菊的深入研究, 许多基因功能的揭示需要回到植株器官或细胞中, 其中包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用.目前, 非洲菊原生质体研究进展缓慢, 大多处于分离阶段, 且效率非常低, 也并未用于遗传转化研究(李丹等, 2009).因此, 建立高效的非洲菊原生质体提取及瞬时转化体系十分必要.本研究借鉴前人经验, 以非洲菊组培苗叶片为材料, 利用不同浓度纤维素酶和离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响进行了探索, 并在此基础上建立瞬时转化体系. ...
... 据文献报道, 原生质体可来源于愈伤组织(王欢等, 2014)、幼嫩的叶片(Yoo et al., 2007; 赵苏州等, 2014; 李妮娜等, 2014)、茎和下胚轴(马占强等, 2005)等, 但最普遍且方便的来源应是生长在温室中或无菌苗的叶片.陈名红等(2005)发现, 如果采用无菌苗的叶片来制备叶肉原生质体既能免去表面消毒的操作环节又能减少感菌的可能.在条件允许的情况下, 应优先考虑使用无菌苗.因此, 本研究利用生长2个月且状态良好的非洲菊无菌小苗叶片作为外植体制备原生质体, 取得了较好的结果.目前提取原生质体所用的酶主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶, 其中使用最广泛的是纤维素酶与离析酶.纤维素酶一般使用浓度为1.25%-3%, 离析酶浓度为0.15%-0.75%.酶液组合和配比是影响原生质体产量和活性的关键因素.在原生质体制备实验中, 纤维素酶和离析酶是最常见的组合, 所以本研究也选择该酶液组合.但制备不同原生质体的材料的细胞壁组成和结构有差异, 酶浓度也有所不同, 如葡萄叶片原生质体分离的最佳酶浓度为3.0%纤维素酶+0.75%离析酶(舒小娟等, 2015); 而苦荞(Fagopyrum tataricum)叶肉细胞原生质体分离的最优酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%离析酶(张钟仁和陈鹏, 2016).比较不同物种间原生质体提取效果及转化效果表明, 拟南芥原生质体提取及转化系统建立相对完善.Sheen实验室以4周大小的拟南芥植株的第5、6、7片莲座叶为材料, 利用1.5%纤维素酶+0.4%离析酶提取获得的原生质体活力极佳, 通过PEG-Ca²⁺介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007).完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%.在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C).纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力.研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性. ...

刺槐愈伤组织原生质体的分离和PEG融合
1
2014

... 据文献报道, 原生质体可来源于愈伤组织(王欢等, 2014)、幼嫩的叶片(Yoo et al., 2007; 赵苏州等, 2014; 李妮娜等, 2014)、茎和下胚轴(马占强等, 2005)等, 但最普遍且方便的来源应是生长在温室中或无菌苗的叶片.陈名红等(2005)发现, 如果采用无菌苗的叶片来制备叶肉原生质体既能免去表面消毒的操作环节又能减少感菌的可能.在条件允许的情况下, 应优先考虑使用无菌苗.因此, 本研究利用生长2个月且状态良好的非洲菊无菌小苗叶片作为外植体制备原生质体, 取得了较好的结果.目前提取原生质体所用的酶主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶, 其中使用最广泛的是纤维素酶与离析酶.纤维素酶一般使用浓度为1.25%-3%, 离析酶浓度为0.15%-0.75%.酶液组合和配比是影响原生质体产量和活性的关键因素.在原生质体制备实验中, 纤维素酶和离析酶是最常见的组合, 所以本研究也选择该酶液组合.但制备不同原生质体的材料的细胞壁组成和结构有差异, 酶浓度也有所不同, 如葡萄叶片原生质体分离的最佳酶浓度为3.0%纤维素酶+0.75%离析酶(舒小娟等, 2015); 而苦荞(Fagopyrum tataricum)叶肉细胞原生质体分离的最优酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%离析酶(张钟仁和陈鹏, 2016).比较不同物种间原生质体提取效果及转化效果表明, 拟南芥原生质体提取及转化系统建立相对完善.Sheen实验室以4周大小的拟南芥植株的第5、6、7片莲座叶为材料, 利用1.5%纤维素酶+0.4%离析酶提取获得的原生质体活力极佳, 通过PEG-Ca²⁺介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007).完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%.在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C).纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力.研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性. ...

植物原生质体技术及其应用
1
2009

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化
1
2016

... 据文献报道, 原生质体可来源于愈伤组织(王欢等, 2014)、幼嫩的叶片(Yoo et al., 2007; 赵苏州等, 2014; 李妮娜等, 2014)、茎和下胚轴(马占强等, 2005)等, 但最普遍且方便的来源应是生长在温室中或无菌苗的叶片.陈名红等(2005)发现, 如果采用无菌苗的叶片来制备叶肉原生质体既能免去表面消毒的操作环节又能减少感菌的可能.在条件允许的情况下, 应优先考虑使用无菌苗.因此, 本研究利用生长2个月且状态良好的非洲菊无菌小苗叶片作为外植体制备原生质体, 取得了较好的结果.目前提取原生质体所用的酶主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶, 其中使用最广泛的是纤维素酶与离析酶.纤维素酶一般使用浓度为1.25%-3%, 离析酶浓度为0.15%-0.75%.酶液组合和配比是影响原生质体产量和活性的关键因素.在原生质体制备实验中, 纤维素酶和离析酶是最常见的组合, 所以本研究也选择该酶液组合.但制备不同原生质体的材料的细胞壁组成和结构有差异, 酶浓度也有所不同, 如葡萄叶片原生质体分离的最佳酶浓度为3.0%纤维素酶+0.75%离析酶(舒小娟等, 2015); 而苦荞(Fagopyrum tataricum)叶肉细胞原生质体分离的最优酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%离析酶(张钟仁和陈鹏, 2016).比较不同物种间原生质体提取效果及转化效果表明, 拟南芥原生质体提取及转化系统建立相对完善.Sheen实验室以4周大小的拟南芥植株的第5、6、7片莲座叶为材料, 利用1.5%纤维素酶+0.4%离析酶提取获得的原生质体活力极佳, 通过PEG-Ca²⁺介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007).完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%.在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C).纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力.研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性. ...

玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究
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2014

... 据文献报道, 原生质体可来源于愈伤组织(王欢等, 2014)、幼嫩的叶片(Yoo et al., 2007; 赵苏州等, 2014; 李妮娜等, 2014)、茎和下胚轴(马占强等, 2005)等, 但最普遍且方便的来源应是生长在温室中或无菌苗的叶片.陈名红等(2005)发现, 如果采用无菌苗的叶片来制备叶肉原生质体既能免去表面消毒的操作环节又能减少感菌的可能.在条件允许的情况下, 应优先考虑使用无菌苗.因此, 本研究利用生长2个月且状态良好的非洲菊无菌小苗叶片作为外植体制备原生质体, 取得了较好的结果.目前提取原生质体所用的酶主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶, 其中使用最广泛的是纤维素酶与离析酶.纤维素酶一般使用浓度为1.25%-3%, 离析酶浓度为0.15%-0.75%.酶液组合和配比是影响原生质体产量和活性的关键因素.在原生质体制备实验中, 纤维素酶和离析酶是最常见的组合, 所以本研究也选择该酶液组合.但制备不同原生质体的材料的细胞壁组成和结构有差异, 酶浓度也有所不同, 如葡萄叶片原生质体分离的最佳酶浓度为3.0%纤维素酶+0.75%离析酶(舒小娟等, 2015); 而苦荞(Fagopyrum tataricum)叶肉细胞原生质体分离的最优酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%离析酶(张钟仁和陈鹏, 2016).比较不同物种间原生质体提取效果及转化效果表明, 拟南芥原生质体提取及转化系统建立相对完善.Sheen实验室以4周大小的拟南芥植株的第5、6、7片莲座叶为材料, 利用1.5%纤维素酶+0.4%离析酶提取获得的原生质体活力极佳, 通过PEG-Ca²⁺介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007).完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%.在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C).纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力.研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性. ...

芜菁原生质体的分离及绿色荧光蛋白的瞬时表达
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2008

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...
... 目前原生质体在基因工程及分子生物学研究中都已得到普遍应用(Sheen, 2001).采用GFP和YFP荧光标记, 通过激光共聚焦显微镜检测, 可以简单方便地确定目标蛋白在细胞中的定位(周波等, 2008).Cao等(2011)采用目的基因融合GFP的方法, 可清晰地观察到单糖转运蛋白OsGMST1位于高尔基体上.Tang等(2012)利用原生质体技术定位水稻(Oryza sativa)硝酸盐转运蛋白OsNRT2.3a, 发现其主要位于细胞膜上.现有的原生质体转化方法主要有PEG-Ca²⁺介导转化、电转化及显微注射3种(Yoo et al., 2007).我们利用PEG-Ca²⁺介导转化法将提取得到的原生质体进行GFP和YFP空载体转化, 转化效率高达80% (图2), 且瞬时表达出蛋白(图3).一般认为, 转化效率在50%以上可以用于常规的分子机理研究(Yoo et al., 2007), 因此, 本实验建立的提取及转化系统可用于研究蛋白质的亚细胞定位. ...

紫锥菊愈伤组织原生质体分离方法初探
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2005

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

1
2005

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

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2012

... 利用原生质体进行蛋白相互作用研究是常见的策略.为了验证非洲菊原生质体具有该潜力, 选取拟南芥中能够相互作用的2个转录因子IBH1和HBI1 (Bai et al., 2012; Fan et al., 2014; Malinovsky et al., 2014)探究上述原生质体提取体系能否应用于遗传共转化实验.利用IBH1-nYFP和HBI1-cYFP共转化非洲菊原生质体, 通过原生质体荧光定位, 能直接观察到IBH1和HBI1互作所形成的复合体在原生质体中的定位情况.结果显示, 与IBH1-nYFP+cYFP和HBI1-cYFP+nYFP阴性对照相比, 在共转化IBH1-nYFP和HBI1-cYFP质粒的细胞核中能观察到强烈的YFP荧光信号(图4). ...

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2008

... 在进化上有明显优势的菊科植物是23 000多种开花植物中最大的分支(Broholm et al., 2008).非洲菊(Gerbera hybrida)为菊科大丁草属多年生常绿草本植物, 可作为研究菊科植物器官生长发育调控的模式植物(Teeri et al., 2006; Laitinen et al., 2007; Broholm et al., 2008; Li et al., 2015).与其它模式植物(如拟南芥或烟草)相比, 非洲菊遗传背景较为复杂、基因数量多、遗传转化困难, 其分子机制研究更难, 而原生质体提取及瞬时转化则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径(舒小娟等, 2015).近年来, 随着对非洲菊的深入研究, 许多基因功能的揭示需要回到植株器官或细胞中, 其中包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用.目前, 非洲菊原生质体研究进展缓慢, 大多处于分离阶段, 且效率非常低, 也并未用于遗传转化研究(李丹等, 2009).因此, 建立高效的非洲菊原生质体提取及瞬时转化体系十分必要.本研究借鉴前人经验, 以非洲菊组培苗叶片为材料, 利用不同浓度纤维素酶和离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响进行了探索, 并在此基础上建立瞬时转化体系. ...
... ; Broholm et al., 2008; Li et al., 2015).与其它模式植物(如拟南芥或烟草)相比, 非洲菊遗传背景较为复杂、基因数量多、遗传转化困难, 其分子机制研究更难, 而原生质体提取及瞬时转化则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径(舒小娟等, 2015).近年来, 随着对非洲菊的深入研究, 许多基因功能的揭示需要回到植株器官或细胞中, 其中包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用.目前, 非洲菊原生质体研究进展缓慢, 大多处于分离阶段, 且效率非常低, 也并未用于遗传转化研究(李丹等, 2009).因此, 建立高效的非洲菊原生质体提取及瞬时转化体系十分必要.本研究借鉴前人经验, 以非洲菊组培苗叶片为材料, 利用不同浓度纤维素酶和离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响进行了探索, 并在此基础上建立瞬时转化体系. ...


2011


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1989

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...


2003


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2014

... 利用原生质体进行蛋白相互作用研究是常见的策略.为了验证非洲菊原生质体具有该潜力, 选取拟南芥中能够相互作用的2个转录因子IBH1和HBI1 (Bai et al., 2012; Fan et al., 2014; Malinovsky et al., 2014)探究上述原生质体提取体系能否应用于遗传共转化实验.利用IBH1-nYFP和HBI1-cYFP共转化非洲菊原生质体, 通过原生质体荧光定位, 能直接观察到IBH1和HBI1互作所形成的复合体在原生质体中的定位情况.结果显示, 与IBH1-nYFP+cYFP和HBI1-cYFP+nYFP阴性对照相比, 在共转化IBH1-nYFP和HBI1-cYFP质粒的细胞核中能观察到强烈的YFP荧光信号(图4). ...

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2010

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

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2012

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

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2012

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

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2007

... 在进化上有明显优势的菊科植物是23 000多种开花植物中最大的分支(Broholm et al., 2008).非洲菊(Gerbera hybrida)为菊科大丁草属多年生常绿草本植物, 可作为研究菊科植物器官生长发育调控的模式植物(Teeri et al., 2006; Laitinen et al., 2007; Broholm et al., 2008; Li et al., 2015).与其它模式植物(如拟南芥或烟草)相比, 非洲菊遗传背景较为复杂、基因数量多、遗传转化困难, 其分子机制研究更难, 而原生质体提取及瞬时转化则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径(舒小娟等, 2015).近年来, 随着对非洲菊的深入研究, 许多基因功能的揭示需要回到植株器官或细胞中, 其中包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用.目前, 非洲菊原生质体研究进展缓慢, 大多处于分离阶段, 且效率非常低, 也并未用于遗传转化研究(李丹等, 2009).因此, 建立高效的非洲菊原生质体提取及瞬时转化体系十分必要.本研究借鉴前人经验, 以非洲菊组培苗叶片为材料, 利用不同浓度纤维素酶和离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响进行了探索, 并在此基础上建立瞬时转化体系. ...

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2015

... 在进化上有明显优势的菊科植物是23 000多种开花植物中最大的分支(Broholm et al., 2008).非洲菊(Gerbera hybrida)为菊科大丁草属多年生常绿草本植物, 可作为研究菊科植物器官生长发育调控的模式植物(Teeri et al., 2006; Laitinen et al., 2007; Broholm et al., 2008; Li et al., 2015).与其它模式植物(如拟南芥或烟草)相比, 非洲菊遗传背景较为复杂、基因数量多、遗传转化困难, 其分子机制研究更难, 而原生质体提取及瞬时转化则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径(舒小娟等, 2015).近年来, 随着对非洲菊的深入研究, 许多基因功能的揭示需要回到植株器官或细胞中, 其中包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用.目前, 非洲菊原生质体研究进展缓慢, 大多处于分离阶段, 且效率非常低, 也并未用于遗传转化研究(李丹等, 2009).因此, 建立高效的非洲菊原生质体提取及瞬时转化体系十分必要.本研究借鉴前人经验, 以非洲菊组培苗叶片为材料, 利用不同浓度纤维素酶和离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响进行了探索, 并在此基础上建立瞬时转化体系. ...

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2005

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

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2015

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

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2014

... 利用原生质体进行蛋白相互作用研究是常见的策略.为了验证非洲菊原生质体具有该潜力, 选取拟南芥中能够相互作用的2个转录因子IBH1和HBI1 (Bai et al., 2012; Fan et al., 2014; Malinovsky et al., 2014)探究上述原生质体提取体系能否应用于遗传共转化实验.利用IBH1-nYFP和HBI1-cYFP共转化非洲菊原生质体, 通过原生质体荧光定位, 能直接观察到IBH1和HBI1互作所形成的复合体在原生质体中的定位情况.结果显示, 与IBH1-nYFP+cYFP和HBI1-cYFP+nYFP阴性对照相比, 在共转化IBH1-nYFP和HBI1-cYFP质粒的细胞核中能观察到强烈的YFP荧光信号(图4). ...

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2008

... 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分仅由细胞膜包围的具有活力的细胞物质(周波等, 2008; 于晓玲等, 2009).细胞壁对植物细胞具有支撑和保护作用, 其主要成分是果胶质、纤维素、半纤维素与少量蛋白质(刘敏和顾志敏, 2014).原生质体能摄入DNA、质粒、病毒、细胞器等外源物质(An et al., 2005), 又可用于研究蛋白定位, 还可以验证蛋白之间的互作, 检测其互作强弱, 定位互作蛋白的位点, 从而为推断蛋白质的生物学功能研究提供必要的基础信息, 因此在细胞工程和基因工程中应用广泛(刘敏和顾志敏, 2014).在模式植物拟南芥(Arab- idopsis thaliana) (Lung et al., 2015)及烟草(Nicotia- na tobacum) (Jones et al., 2012)中, 原生质提取及转化效果较好, 并得到广泛应用.而在非模式植物如葡萄(Vitis vinifera) (Fontes et al., 2010; 舒小娟等, 2015)、柳枝黍(Panicum virgatum) (Mazarei et al., 2008)、杨树(Populus tremula × alba) (Guo et al., 2012)、松树(Pinus pinaster) (David et al., 1989)及紫锥菊(Echinacea augustifolia) (Liqing et al., 2005; 朱蠡庆等, 2005)中也有相关报道. ...

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2001

... 目前原生质体在基因工程及分子生物学研究中都已得到普遍应用(Sheen, 2001).采用GFP和YFP荧光标记, 通过激光共聚焦显微镜检测, 可以简单方便地确定目标蛋白在细胞中的定位(周波等, 2008).Cao等(2011)采用目的基因融合GFP的方法, 可清晰地观察到单糖转运蛋白OsGMST1位于高尔基体上.Tang等(2012)利用原生质体技术定位水稻(Oryza sativa)硝酸盐转运蛋白OsNRT2.3a, 发现其主要位于细胞膜上.现有的原生质体转化方法主要有PEG-Ca²⁺介导转化、电转化及显微注射3种(Yoo et al., 2007).我们利用PEG-Ca²⁺介导转化法将提取得到的原生质体进行GFP和YFP空载体转化, 转化效率高达80% (图2), 且瞬时表达出蛋白(图3).一般认为, 转化效率在50%以上可以用于常规的分子机理研究(Yoo et al., 2007), 因此, 本实验建立的提取及转化系统可用于研究蛋白质的亚细胞定位. ...

1
2012

... BiFC是一种可快速、直观判断2个蛋白是否互作以及确定互作定位的新技术.该技术是将黄色荧光蛋白分子(YFP)在特定的位点切开, 分为N端和C端, 然后分别与目标蛋白融合表达, 如果荧光蛋白活性恢复, 则表明目标蛋白之间发生相互作用(崔喜艳等, 2013).本实验运用的BiFC质粒pSAT6-cYFP-IBH1和pSAT6- nYFP-HBI1共转化原生质体后在细胞核中检测到黄色荧光信号(图4), 说明IBH1和HBI1在非洲菊细胞内相互结合.目前通过合适的方法均可以顺利分离得到不少物种的原生质体, 而对非洲菊的原生质体提取及遗传转化的相关报道较少.近年来, 随着对非洲菊研究的不断深入, 越来越多的机理需要回到器官或细胞中揭示, 如蛋白之间的互作关系.Elomma等(2003)对GMYB10的功能进行解析, 发现超表达该转录因子可以激活营养器官中的花色素苷合成.酵母双杂交实验证明, 该蛋白发挥功能需要与另一转录因子GMYC1发生互作才能完成.但在实际情况下, 非洲菊中超表达GMYC1后并没有促进花色素苷的积累, 因此非洲菊体内这2个蛋白是否互作还需验证.同样地, 该课题组对CYC-like (CYCLOIDEA-like)家族成员的进化关系进行研究, 由于没有很好的实验系统, 只能用酵母双杂交技术对它们之间是否形成同源二聚体或异源二聚体进行解析(Tahtiharju et al., 2012).后续该课题组利用烟草瞬时转化及BiFC实验进行验证, 部分蛋白间互作并没有得到很好的结果.因此本实验建立的高效非洲菊原生质体提取方法及转化体系能满足后续的实验需求, 将为非洲菊及其它植物发育的分子机理研究提供技术支持. ...


2012


1
2006

... 在进化上有明显优势的菊科植物是23 000多种开花植物中最大的分支(Broholm et al., 2008).非洲菊(Gerbera hybrida)为菊科大丁草属多年生常绿草本植物, 可作为研究菊科植物器官生长发育调控的模式植物(Teeri et al., 2006; Laitinen et al., 2007; Broholm et al., 2008; Li et al., 2015).与其它模式植物(如拟南芥或烟草)相比, 非洲菊遗传背景较为复杂、基因数量多、遗传转化困难, 其分子机制研究更难, 而原生质体提取及瞬时转化则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径(舒小娟等, 2015).近年来, 随着对非洲菊的深入研究, 许多基因功能的揭示需要回到植株器官或细胞中, 其中包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用.目前, 非洲菊原生质体研究进展缓慢, 大多处于分离阶段, 且效率非常低, 也并未用于遗传转化研究(李丹等, 2009).因此, 建立高效的非洲菊原生质体提取及瞬时转化体系十分必要.本研究借鉴前人经验, 以非洲菊组培苗叶片为材料, 利用不同浓度纤维素酶和离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响进行了探索, 并在此基础上建立瞬时转化体系. ...

5
2007

... 原生质体纯化参考Yoo等(2007)的方法进行, 并略有改动.在原生质体分离反应液中加入等体积(10 mL)的W5溶液(其成分为5 mmol·L^-1葡萄糖、1.5 mmol·L^-1 pH5.7 MES、154 mmol·L^-1 NaCl、125 mmol·L^-1 CaCl₂及5 mmol·L^-1 KCl); 用剪去头部的1 mL枪头吸取反应液, 用75 μm的尼龙滤网收集原生质体; 用圆底离心管收集原生质体, 4°C下60 ×g离心10分钟; 去除上清, 用等体积的W5溶液轻轻重悬(注意最好剪去枪头的头部, 加入W5时一定要缓慢并沿管壁加入, 然后用手指轻弹管壁), 4°C下60 ×g继续离心10分钟; 重复此步骤1次.将原生质体转移到2 mL离心管中, 最后加入1 mL MMg溶液(其成分为0.4 mol·L^-1甘露醇、15 mmol·L^-1 MgCl₂及4 mmol·L^-1 pH5.7 MES)重悬. ...
... 据文献报道, 原生质体可来源于愈伤组织(王欢等, 2014)、幼嫩的叶片(Yoo et al., 2007; 赵苏州等, 2014; 李妮娜等, 2014)、茎和下胚轴(马占强等, 2005)等, 但最普遍且方便的来源应是生长在温室中或无菌苗的叶片.陈名红等(2005)发现, 如果采用无菌苗的叶片来制备叶肉原生质体既能免去表面消毒的操作环节又能减少感菌的可能.在条件允许的情况下, 应优先考虑使用无菌苗.因此, 本研究利用生长2个月且状态良好的非洲菊无菌小苗叶片作为外植体制备原生质体, 取得了较好的结果.目前提取原生质体所用的酶主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶, 其中使用最广泛的是纤维素酶与离析酶.纤维素酶一般使用浓度为1.25%-3%, 离析酶浓度为0.15%-0.75%.酶液组合和配比是影响原生质体产量和活性的关键因素.在原生质体制备实验中, 纤维素酶和离析酶是最常见的组合, 所以本研究也选择该酶液组合.但制备不同原生质体的材料的细胞壁组成和结构有差异, 酶浓度也有所不同, 如葡萄叶片原生质体分离的最佳酶浓度为3.0%纤维素酶+0.75%离析酶(舒小娟等, 2015); 而苦荞(Fagopyrum tataricum)叶肉细胞原生质体分离的最优酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%离析酶(张钟仁和陈鹏, 2016).比较不同物种间原生质体提取效果及转化效果表明, 拟南芥原生质体提取及转化系统建立相对完善.Sheen实验室以4周大小的拟南芥植株的第5、6、7片莲座叶为材料, 利用1.5%纤维素酶+0.4%离析酶提取获得的原生质体活力极佳, 通过PEG-Ca²⁺介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007).完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%.在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C).纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力.研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性. ...
... 介导转化, 转化效率高达90% (Yoo et al., 2007).完全参考拟南芥的提取方法, Guo等(2012)也从杨树中提取到高质量的原生质体, 产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上, 转化效率也超过70%.在已有研究的基础上, 选用纤维素酶与离析酶进行非洲菊原生质体提取条件的摸索, 通过浓度筛选确定了非洲菊组培苗叶片最优提取浓度为2%纤维素酶+0.3%离析酶, 原生质体提取产量在1×10⁷个·g^-1 FW以上(图1B, C).纤维素酶和离析酶浓度过高或过低均影响非洲菊叶片原生质体的产量和活力.研究表明, 非洲菊的原生质体状态与拟南芥及杨树具有一定的相似性. ...
... 目前原生质体在基因工程及分子生物学研究中都已得到普遍应用(Sheen, 2001).采用GFP和YFP荧光标记, 通过激光共聚焦显微镜检测, 可以简单方便地确定目标蛋白在细胞中的定位(周波等, 2008).Cao等(2011)采用目的基因融合GFP的方法, 可清晰地观察到单糖转运蛋白OsGMST1位于高尔基体上.Tang等(2012)利用原生质体技术定位水稻(Oryza sativa)硝酸盐转运蛋白OsNRT2.3a, 发现其主要位于细胞膜上.现有的原生质体转化方法主要有PEG-Ca²⁺介导转化、电转化及显微注射3种(Yoo et al., 2007).我们利用PEG-Ca²⁺介导转化法将提取得到的原生质体进行GFP和YFP空载体转化, 转化效率高达80% (图2), 且瞬时表达出蛋白(图3).一般认为, 转化效率在50%以上可以用于常规的分子机理研究(Yoo et al., 2007), 因此, 本实验建立的提取及转化系统可用于研究蛋白质的亚细胞定位. ...
... ).一般认为, 转化效率在50%以上可以用于常规的分子机理研究(Yoo et al., 2007), 因此, 本实验建立的提取及转化系统可用于研究蛋白质的亚细胞定位. ...