0 引言
【研究意义】柑橘是多年生木本植物,可跨种属杂交,种属间杂种多,遗传背景复杂。柑橘的主栽品种多起源于芽变,如甜橙、温州蜜柑等,品种间遗传背景高度一致,增加了品种鉴定工作的难度。中国作为柑橘的原生国之一,柑橘种质资源丰富,近年通过引种和育种,中国柑橘品种的类型及结构更加多样化,国内各柑橘产区也培育了不少优良品种[1]。《中华人民共和国种子法》最新修改版规定品种需进行DUS（Distinctness, Uniformity, Stability）测试才能登记、审定及保护,因此,柑橘品种的鉴定工作不断推进。尽管柑橘可根据枝叶形态等鉴别其属种,但柑橘的形态学标记较少,种内品种间的差异不明显。随着分子生物学的发展,DNA分子标记鉴定因快速准确、不受环境影响等优点逐渐发挥重要作用,满足品种快速准确鉴定和标准指纹图谱构建的要求[2]。【前人研究进展】DNA分子标记技术广泛应用于植物的遗传多样性研究、遗传图谱构建和种质鉴定等,其中SSR标记和SNP标记均为共显性遗传,染色体定位清楚且具有高通量自动化的潜力,因此,国际新品种保护联盟（UPOV）的生物化学和分子生物学技术工作组（BMT）将其作为构建DNA指纹数据库的首选标记;而SSR标记在单个位点上的多态性高于SNP标记,技术研究更加成熟,且SNP的仪器设备成本高,不利于推广应用,因此,SSR标记因其各种优势在品种鉴定和数据库构建领域发挥越来越重要的作用[3]。近年来,主要农作物的DNA指纹检测技术已经成熟,基于SSR分子标记的玉米、水稻、大豆、小麦等主要农作物的指纹图谱库已构建完成[3,4,5,6,7,8,9,10]。SSR分子标记已广泛应用于柑橘的研究[11,12],韩国辉[13]建立了基于EST-SSR、Genomic-SSR、SCoT的柑橘连锁图谱及杂种和多倍体遗传分析;郭雁君等[14]利用SSR标记评价了广东省肇庆地区地方柑橘品种与其他部分柑橘属和近缘属植物的亲缘关系,为其分类和育种提供理论依据;曾涛[15]利用SSR分子标记构建了南丰蜜桔的指纹图谱并分析了各南丰蜜桔的遗传多样性;雷天刚等[16]以聚丙烯酰胺凝胶电泳为平台,用12对SSR引物和2个ISSR引物构建柑橘栽培品种（系）的DNA指纹图谱库,并赋予70个柑橘品种特征指纹代码。【本研究切入点】目前,国内柑橘品种DNA指纹库的构建大多基于琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳,但是琼脂糖凝胶电泳分辨率低,聚丙烯酰胺凝胶电泳制胶难度较大、步骤多且操作繁琐,都不适合大量样品的指纹采集。随着优良品种的不断选育、品种权保护的推广及育种家对品种保护意识的提高等,这两个平台已无法满足大量品种的DNA指纹鉴定。柑橘的指纹图谱虽有报道,但不够完善。【拟解决的关键问题】本研究从一系列基因组SSR和EST-SSR引物中筛选出一套多态性高、PCR扩增稳定、荧光峰型易识别的SSR引物组合,建立更加丰富的柑橘品种指纹图谱库,为柑橘种苗认证和DUS测试过程中近似品种的鉴定提供参考。1 材料与方法
1.1 供试材料
用于引物筛选和DNA指纹图谱库构建的种质共503份,其中456份来自中国农业科学院柑桔研究所国家资源圃,47份来自国家柑橘改良中心长沙分中心,包括9份大翼橙亚属种质、16份枳、10份金柑、9份属间杂种、20份枸橼种质、162份宽皮柑橘、2份来檬、51份柠檬、12份葡萄柚、12份酸橙、19份甜橙、8份香橙、121份柚、52份柑橘属内杂种。1.2 DNA提取
每份种质取5片同龄幼嫩叶片等量混合,液氮研磨,采用改良的CTAB法[17]提取基因组总DNA。1.3 SSR引物的选择
依据参考文献[17,18,19,20,21,22,23,24,25]报道的序列共合成362对SSR引物。在经琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选后的SSR引物上游5’端随机标记6-FAM、HEX、ROX和TAMRA 4种荧光染料。普通引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,荧光引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。1.4 PCR扩增
PCR反应体系为dNTP 0.20 mmol·L-1、上下游引物各0.25 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.05 U·μL-1、1×buffer（含Mg2+ 2.5 mmol·L-1）和样品DNA 2.5 ng·μL-1。PCR程序为94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃—60℃ 30 s,72℃ 40 s,共35个循环;72℃ 10 min。PCR扩增产物经4%琼脂糖凝胶电泳40—50 min（恒压120 V）,凝胶成像系统下拍照记录。变性后的PCR扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离1—1.5 h（80 W恒定功率）,银染检测[26]。将6-FAM、HEX荧光标记的PCR产物稀释30倍,TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释15倍,取等量稀释后的产物混合并变性,上样至3130XL基因分析仪进行片段分析,使用SSR指纹分析器读取数据[7]。
1.5 引物多态性评价
利用PIC（Polymorphism Information Content）评价引物多态性,PIC计算公式：PICi=1-∑Pij2,其中Pij表示标记i的第j个等位基因在群体中的频率[27]。2 结果
2.1 引物筛选和标记开发
2.1.1 引物初选 以柑橘属8个种的代表品种（太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大红甜橙、邓肯葡萄柚、枸橼、费米耐劳柠檬、墨西哥来檬）为材料,对362对SSR引物进行PCR扩增及4%琼脂糖凝胶电泳检测,其中340对SSR引物扩增出目的片段,评价每对引物的多态性、扩增稳定性,初步筛选出80对种间多态性高、扩增稳定的SSR引物。2.1.2 引物复选 从柑橘属8个种中选择不同类型的64份品种作为材料,对上述80对SSR引物进行PCR扩增及6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,评价每对引物的多态性、扩增稳定性和条带清晰度等,筛选出60对多态性高、扩增稳定、带型较清晰的SSR引物（图1）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1引物P8在64份柑橘品种间表现出丰富的多态性 M：25 bp DNA Step ladder,1：福橘;2：兴义大红袍;3：南橘;4：黄果柑;5：早熟;6：阳山橘;7：本地早;8：瓯柑;9：早熟克里曼丁;10：贡柑;11：永春椪柑;12：黄岩椪柑;13：太田椪柑;14：日南1号;15：大分4号;16：伊予柑;17：温岭高橙;18：秋辉;19：诺瓦;20：清见;21：维诺拉;22：世界蜜柚;23：默科特;24：凯旋柑;25：早香;26：阳香;27：桂平朱砂橘;28：满头红;29：印度酸橘;30：枸头橙;31：代代;32：朱栾; 33：无核雪柑;34：莫洛;35：大红甜橙;36：夏沙蜜柚;37：北碚柚;38：金兰柚;39：五布红心柚;40：强德勒柚;41：勐伦早柚;42：橘湘红;43：沙田柚;44：马家柚;45：玉环柚;46：四季抛;47：曼赛龙柚;48：奥罗布兰克;49：邓肯葡萄柚;50：马叙葡萄柚;51：鸡尾葡萄柚;52：木里香橼;53：小香橼;54：长果香橼;55：美国枸橼;56：枸橼;57：野生香橼;58：大香橼;59：墨西哥来檬;60：印特多纳多;61：尤力克柠檬;62：橙花;63：白黎檬;64：北京柠檬
-->Fig. 1High polymorphism among 64 citrus cultivars with primer P8 M: 25 bp DNA Step ladder; 1: Fuju; 2: Xingyidahongpao; 3: Nanju; 4: Huangguogan; 5: Zaoshu; 6: Yangshanju; 7: Bendizao; 8: Ougan; 9: Precocious clementine; 10: Gonggan; 11: Yongchun ponkan; 12: Huangyan ponkan; 13: Ota ponkan; 14: Nichinan No.1; 15: Oita wase No. 4 unshu; 16: iyokan; 17: Wenling Gaocheng; 18: Fallglo; 19: Nova; 20: Kiyomi; 21: Winola; 22: Shijie sweet pummelo; 23: Murcott; 24: Kaixuangan; 25: Hayaka; 26: Youkou; 27: Guipingzhushaju; 28: Mantouhong tangerine; 29: Cleopatra mandarin; 30: Goutoucheng; 31: Daidai; 32: Zhuluan; 33: Xuegan seedless; 34: Moro; 35: Dahong sweet orange; 36: Xiasha sweet pummelo; 37: Beibei pummelo; 38: Jinlan pummelo; 39: Wubuhongxin pummelo; 40: Chandler pummelo; 41: Menglunzao pummelo; 42: Juxianghong; 43: Shatian pummelo; 44: Majia pummelo; 45: Yuhuan pummelo; 46: Sijipao; 47: Mansailong pummelo; 48: Aoluobulanke pummelo; 49: Duncan grapefruit; 50: Marsh grapefruit; 51: Cockatiel grapefruit; 52: Muli citron; 53: Small citron; 54: Changguo citron; 55: America citron; 56: Citron; 57: Wild citron; 58: Big citron; 59: Mexico lime; 60: Interdonato; 61: Eureka lemon; 62: Chenghua; 63: White limonia; 64: Beijing lemon
-->
2.1.3 引物精选 对上述筛出的60对SSR引物标记荧光染料,从柑橘属8个种中的选择不同类型的168份柑橘品种为材料进行PCR扩增,扩增产物经毛细管电泳检测,根据各引物的PIC值、等位基因数目、峰图读取的难易程度及染色体位置等,最终筛选出21对多态性高、扩增稳定、毛细管电泳峰型易读取且在染色体上分布均匀的SSR引物作为指纹图谱库构建的核心引物[28]。21个位点的多态信息量（PIC）变幅为0.550—0.871,平均为0.733（图2、表1和表2）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2引物P8在4个柑橘品种中检测到的等位变异
-->Fig. 2Polymorphism detected among four citrus cultivars with SSR primer P8
-->
Table 1
表1
表1引物编号及序列
Table 1The number and sequence of primer
| 引物编号 No. | 引物序列 Primer sequences (5′-3′) | 引物编号 No. | 引物序列 Primer sequences (5′-3′) | |
|---|---|---|---|---|
| P4 | F:TAAAAACCAACGTCCCCTCA | P141 | F:CAGGCAGTAACCTCCCAGAC | |
| R:CGGGCGAGGTAGAAGTAATG | R:AGCGAAAGCTAATGATGGTG | |||
| P7 | F:GTTGCGCAGTTATTCTCAAA | P168 | F:TCTTCCCAGTTCCCACCCA | |
| R:CCGACCACTTTTACCCACTG | R:GCACCAGACGATCCAACGA | |||
| P8 | F:TTGCCAAGAGATTAAACGAACA | P190 | F:AACACCCCTTGGAGGGAG | |
| R:GACGAGAGGTCCAGAAATCG | R:GCTGTTCACACACACAACCC | |||
| P13 | F:AGTGAACTGTCCATTGGATTTTCG | P235 | F:CACGCAGCTTGAGTTTGAAG | |
| R:GTGTTGAATCCCGACCTTCTACC | R:GTGCCGTTTAGGGTTTTCCT | |||
| P22 | F:GCCTTCTTGATTTACCGGAC | P238 | F:CGGGCTAGGCTGAGAGATA | |
| R:TGCTCCGAACTTCATCATTG | R:TTCTTTGGAGCCGAACAACT | |||
| P28 | F:AGGTCTACATTGGCATTGTC | P268 | F:CGCAAATGACTTCCCAGAAT | |
| R:ACATGCAGTGCTATAATGAATG | R:GCTCCCTCCGATTCTCTCTC | |||
| P35 | F:CATCAGAAACGAGATGCCAA | P285 | F:GATACAAATTAGCATTTGATTGAATGGA | |
| R:AAGGGCTAGAAGATTCCCCC | R:ATCGGGACTCGCATTAGGGT | |||
| P47 | F:GCAGCGCAACAACATAACTA | P289 | F:ATTTGTCCCAATGACTGCTG | |
| R:GGCCAATAGCTTCCATTCA | R:TGAGCTGAGTTTCCAGCTTT | |||
| P69 | F:GTGTGGTCCAGACTCCGTTT | P294 | F:GTGAGGCAAAACGGAAAGAG | |
| R:AAGATTCTTTAACAAATCCAAGGC | R:GGGCCCATACAACGTAGAAG | |||
| P100 | F:CTTGTGTGTTGCAGCTCGAT | P358 | F:GACAACATCAACAACAGCAAGAGC | |
| R:ATTCATTAAACCGACTGCC | R:AGAAGAAGAGCCCCCATTAGC | |||
| P129 | F:TTCGTCATCCTCATCCATC | P362 | F:CTTCCTCTTGCGGAGTGTTC | |
| R:TCATCAAATCACCCAAACGA | R:GAGGGAAAGCCCTAATCTCA | |||
| P114 | F:TCTCACGTCAAAAGACGACG | JD7 | F:TCCACAAGGAGAAGAAACGG | |
| R:TCGGCCATAAACCGATACAT | R:GCGTCTTTACTGTTACCGGG |
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Table 2
表2
表2用于柑橘属（品）种DNA指纹鉴定的21个标记
Table 2Details of 21 SSR molecular markers for DNA profiling in citrus varieties
| 引物编号 No. | 染色体 Chromosome | PIC | 参照品种（等位变异大小,bp） Reference variety(size of allele, bp) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| P7 | 1 | 0.597 | 胡柚 Huyou（221）,公孙橘61-1 Gongsunju 61-1（224）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（226）,墨西哥枳橙 Mexico citrange（227）,白?檬White limonia（232）,资阳香橙Ziyang xiangcheng（234）,胡柚 Huyou（236）,沃柑 Wogan（240）,沃柑Wogan（244）,年橘Nianju（246） | ||||
| P35 | 1 | 0.813 | 资阳香橙 Ziyang xiangcheng（272）,白?檬 White limonia（276）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（279）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（285）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（298）,墨西哥来檬 Mexico lime（301）,北碚柚 Beibei pummelo（313）,北碚柚 Beibei pummelo（316）,墨西哥来檬 Mexico lime（322）,红河大翼橙 Honghe papeda（328）,马叙 Marsh grapefruit（355） | ||||
| P129 | 1 | 0.55 | 砂糖橘 Shatang ju（196）,北碚柚 Beibei pummelo（198）,联合酸橙 Lianhe soar orange（199）,大种橙 Macrsperma（200）,枸头橙 Goutou soar orange（202）,胡柚 Huyou（203）,通贤柚 Tongxian pummelo（206）,77-1枳柚 77-1 citrumelo（216）,77-1枳柚 77-1 citrumelo（227）,米尔斯威特甜柠檬 Mills Witt sweet lemon（236）,米尔斯威特甜柠檬 Mills Witt sweet lemon（240）,小香橼 Small citron（242）,小香橼 Small citron（250）,大香橼 Big citron（252） | ||||
| JD7 | 1 | 0.669 | 77-1枳柚 77-1 citrumelo（252）,墨西哥来檬 Mexico lime（258）,墨西哥来檬 Mexico lime（261）,米尔斯威特甜柠檬 Mills Witt sweet lemon（263）,北碚柚 Beibei pummelo（265）,南橘 Nanju（267）,砂糖橘 Shatang ju（269）,胡柚 Huyou（271）,北碚柚 Beibei pummelo（272）,胡柚 Huyou（273）,南橘 Nanju（275）,联合酸橙 Lianhe soar orange（277）,马叙 Marsh grapefruit（279）,梁平柚 Liangping pummelo（281） | ||||
| P8 | 2 | 0.832 | 北碚柚 Beibei pummelo（167）,墨西哥来檬 Mexico lime（172）,安江香柚 Anjiang sweet pummelo（173）,北碚柚 Beibei pummelo（176）,砂糖橘 Shatang ju（177）,小香橼 Small citron（179）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（180）,联合酸橙 Lianhe soar orange（182）,胡柚 Huyou（185）,米尔斯威特甜柠檬 Mills Witt sweet lemon（192）,巴西酸橙 Brazil soar orange（194）,马叙 Marsh grapefruit（195）,南橘 Nanju（197）,红河大翼橙 Honghe papeda（198）,砂糖橘 Shatang ju（200）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（201）,大香橼 Big citron（204） | ||||
| P28 | 2 | 0.871 | 北碚柚 Beibei pummelo（124）,通贤柚 Tongxian pummelo（125）,墨西哥来檬 Mexico lime（129）,小香橼 Small citron（133）,北碚柚 Beibei pummelo（134）,纽荷尔脐橙 Newhall navel orange（135）,华蓥山香柚 Huayingshan sweet pummelo（137）,砂糖橘 Shatang ju（139）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（143）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（145）,圆香橼 Yuan citron（148）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（152）,年橘 Nianju（155）资阳香橙 Ziyang xiangcheng（158）,红皮酸橘 Hongpi suanju（161）,白?檬 White limonia（164）,墨西哥来檬 Mexico lime（168）,公孙橘61-1 Gongsunju 61-1（180）,77-1枳柚 77-1 citrumelo（190）,77-1枳柚 77-1 citrumelo（193） | ||||
| P100 | 2 | 0.638 | 大分4号 Oita wase No. 4 unshu（186）,77-1枳柚 77-1 citrumelo（190）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（194）,脐柚 Navel pummelo（197）,马叙 Marsh grapefruit（198）,北碚柚 Beibei pummelo（202）,龙安柚 Longan pummelo（206） | ||||
| P362 | 2 | 0.755 | 黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（122）,大种橙 Macrsperma（124）,小香橼 Small citron（126）,墨西哥来檬 Mexico lime（128）,大种橙 Macrsperma（130）,小香橼 Small citron（134）,胡柚 Huyou（138）,墨西哥枳橙 Mexico citrange（141）,太田椪柑 Ota ponkan（145）,砂糖橘 Shatang ju（152）,联合酸橙 Lianhe soar orange（154）,砂糖橘 Shatang ju（158）,北碚柚 Beibei pummelo（160）,梁平柚 Liangping pummelo（162）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（164）,龙安柚 Longan pummelo（166）,龙安柚 Longan pummelo（168）,华蓥山香柚 Huayingshan sweet pummelo（170）,通贤柚 Tongxian pummelo（172） | ||||
| P4 | 3 | 0.748 | 沃柑 Wogan（197）,北碚柚 Beibei pummelo（198）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（200）,砂糖橘 Shatang ju（203）,安江香柚 Anjiang sweet pummelo（204）,长果香橼 Changguo citron（206）,砂糖橘 Shatang ju（208）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（212）,纽荷尔脐橙 Newhall navel orange（214） | ||||
| P190 | 3 | 0.825 | 通贤柚 Tongxian pummelo（146）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（148）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（149）,砂糖橘 Shatang ju（150）,安江香柚 Anjiang sweet pummelo（152）,纽荷尔脐橙 Newhall navel orange（154）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（156）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（158）,马叙 Marsh grapefruit（159）,江北无核柚 Jiangbei seedless pummelo（165）,南橘 Nanju（168）,南橘 Nanju（172） | ||||
| P268 | 3 | 0.704 | 胡柚 Huyou（200）,龙安柚 Longan pummelo（202）,77-1枳柚 77-1 citrumelo（204）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（206）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（209）,圆香橼 Yuan citron（211）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（213）,砂糖橘 Shatang ju（215）,白?檬 White limonia（219）,枸头橙 Goutou soar orange（221）,南橘 Nanju（223）,圆香橼 Yuan citron（225）,大种橙 Macrsperma（227） | ||||
| 引物编号 No. | 染色体 Chromosome | PIC | 参照品种（等位变异大小,bp） Reference variety(size of allele, bp) | ||||
| P294 | 4 | 0.826 | 纽荷尔脐橙 Newhall navel orange（209）,砂糖橘 Shatang ju（210）,安江香柚 Anjiang sweet pummelo（215）,龙安柚 Longan pummelo（218）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（221）,马叙 Marsh grapefruit（224）,砂糖橘 Shatang ju（225）,胡柚 Huyou（227）,墨西哥来檬 Mexico lime（230）,小香橼 Small citron（233）,墨西哥枳橙 Mexico citrange（239）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（245） | ||||
| P141 | 5 | 0.576 | 黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（213）,公孙橘61-1 Gongsunju 61-1（216）,公孙橘61-1 Gongsunju 61-1（219）,南橘 Nanju（222）,南橘 Nanju（225）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（228）,梁平柚 Liangping pummelo（231）,玉环柚 Yuhuan pummelo（234） | ||||
| P235 | 5 | 0.861 | 墨西哥枳橙 Mexico citrange（140）,红河大翼橙 Honghe papeda（150）,马叙 Marsh grapefruit（152）,南橘 Nanju（154）,年橘 Nianju（155）,公孙橘61-1 Gongsunju 61-1（156）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（158）,砂糖橘 Shatang ju（159）,白?檬 White limonia（161）,砂糖橘 Shatang ju（162）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（164）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（166）,红皮酸橘 Hongpi suanju（167）,小香橼 Small citron（170）,北碚柚 Beibei pummelo（172）,梁平柚 Liangping pummelo（174）,胡柚 Huyou（180）,小香橼 Small citron（187） | ||||
| P69 | 6 | 0.615 | 纽荷尔脐橙 Newhall navel orange（197）,脐柚 Navel pummelo（203）,纽荷尔脐橙 Newhall navel orange（206）,联合酸橙 Lianhe soar orange（209）,墨西哥来檬 Mexico lime（211）,白?檬 White limonia（213）,白?檬 White limonia（214）,圆香橼 Yuan citron（216）,圆香橼 Yuan citron（217） | ||||
| P238 | 6 | 0.867 | 墨西哥枳橙 Mexico citrange（142）,年橘 Nianju（144）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（146）,年橘 Nianju（148）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（150）,安江香柚 Anjiang sweet pummelo（152）,北碚柚 Beibei pummelo（154）,马叙 Marsh grapefruit（156）,砂糖橘 Shatang ju（158）,安江香柚 Anjiang sweet pummelo（160）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（162）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（176）,砂糖橘 Shatang ju（178） | ||||
| P285 | 6 | 0.773 | 安江香柚 Anjiang sweet pummelo（104）,圆香橼 Yuan citron（110）,圆香橼 Yuan citron（113）,北碚柚 Beibei pummelo（115）,砂糖橘 Shatang ju（118）,砂糖橘 Shatang ju（121）,南橘 Nanju（127）,马叙 Marsh grapefruit（130）,胡柚 Huyou（138） | ||||
| P114 | 7 | 0.814 | 枸头橙 Goutou soar orange（233）,安江香柚 Anjiang sweet pummelo（237）,马叙 Marsh grapefruit（239）,梁平柚 Liangping pummelo（241）,胡柚 Huyou（243）,马叙 Marsh grapefruit（245）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（247）,砂糖橘 Shatang ju（251）,黄花尤力克 Yellow flower Eureka lemon（255）,沃柑 Wogan（256）,北碚柚 Beibei pummelo（257）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（258）,沃柑 Wogan（261）,77-1枳柚 77-1 citrumelo（274）,77-1枳柚 77-1 citrumelo（281） | ||||
| P13 | 8 | 0.63 | 北碚柚 Beibei pummelo（137）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（144）,大分4号 Oita wase No. 4 unshu（150）,纽荷尔脐橙 Newhall navel orange（156） | ||||
| P22 | 8 | 0.753 | 砂糖橘 Shatang ju（151）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（153）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（157）,红河大翼橙 Honghe papeda（160）,枸头橙 Goutou soar orange（169）,砂糖橘 Shatang ju（170）,联合酸橙 Lianhe soar orange（171）,北碚柚 Beibei pummelo（172）,墨西哥枳橙 Mexico citrange（174）,巴西酸橙 Brazil soar orange（176）,马叙 Marsh grapefruit（178）,马叙 Marsh grapefruit（183）,墨西哥来檬 Mexico lime（189） | ||||
| P47 | 9 | 0.683 | 枸头橙 Goutou soar orange（103）,砂糖橘 Shatang ju（106）,资阳香橙 Ziyang xiangcheng（110）,马叙 Marsh grapefruit（111）,砂糖橘 Shatang ju（114）,马叙 Marsh grapefruit（117） | ||||
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The reference variety is a set of samples representing the main alleles of the core site. Being used to assist in determining the size of an extended segment of the size of alleles at a certain site, correcting of system error of instrument and equipment2.1.4 标记的校正统一与参照品种的选择 统计各柑橘（品）种在21个SSR位点上的扩增片段大小并取整,用取整后的片段大小命名各等位变异。为消除不同仪器型号、不同试验批次等造成的系统误差并保证不同电泳平台数据的一致性,为每对SSR引物的各等位变异选择相应的参照品种（代表核心位点主要等位变异的一组样品,辅助确定待测样品在某个位点上的等位变异大小）（表2）。
2.2 柑橘（品）种DNA指纹图谱库的构建
根据引物标记的荧光颜色及等位变异的大小范围进行组合,21对SSR引物可分成5组（表3）,每组3—6对引物,同一组引物的PCR扩增产物混合后进行多重电泳,可提高试验效率、降低成本。提取各柑橘样品的DNA并进行PCR扩增,扩增产物依据引物分组进行毛细管多重电泳,采集各柑橘种质在21个SSR位点上的指纹数据,建立了包含500份柑橘种质的DNA指纹图谱库。在21个位点中共检测到253个等位变异,每个位点的等位变异数为4—19个,平均约12个（表3）。
Table 3
表3
表321个荧光标记引物的分组
Table 3Grouping of 21 primers labeled by fluorescence
| 分组 Group | FAM标记引物 FAM molecular marker | HEX标记引物 HEX molecular marker | TAMRA标记引物 TAMRA molecular marker | ROX标记引物 ROX molecular marker |
|---|---|---|---|---|
| G1 | P22(151-189) | P238(142-178) | P141(213-234) | |
| G2 | P362(122-172) | P7(221-246)、P100(186-206) | ||
| G3 | P235(140-187) | P129(196-252) | P268(198-227)、P285(104-138)、 | P35(272-369) |
| G4 | P28(124-193) | JD7(252-281) | P13(137-161)、P294(209-245) | P8(167-204) |
| G5 | P4(197-214)、P190(146-172) | P114(233-281) | P47(103-117) |
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2.3 特异标记的筛选和种质鉴定
筛选了部分柑橘属种的特异标记（属、种内品种间条带一致,同时区别于其他属、种的品种）,为跨属种杂交后代的鉴定及柑橘品种的属种鉴别提供参考（表4）。Table 4
表4
表4柑橘属种的特异标记
Table 4The specific markers of citrus species
| 属种 Genus-species | 属种特异标记 Specific molecular of genus-species | 种质总数 The number of germplasm | 独立标记鉴别种质数 The number of germplasm by independent marker | 2对引物组合鉴别种质数 The number of germplasm by 2 primers combination | 3对引物组合鉴别种质数 The number of germplasm by 3 primers combination | 鉴别不开种质 （组数） Similar germplasm (groups) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 枳属Poncitrus | JD7（252/265 ） | 16 | 2 | 0 | 3 | 11(4) |
| 金柑属Fortunella | / | 10 | 4 | 0 | 0 | 6(3) |
| 大翼橙亚属Papeda | / | 9 | 9 | 0 | 0 | 0 |
| 枸橼Citron | P358(177/177 ) | 20 | 12 | 4 | 2 | 2(1) |
| 来檬Lime | P358(165/177 ) | 2 | 0 | 0 | 0 | 2(1) |
| 葡萄柚Grapefruit | P114(239/245) | 12 | 2 | 1 | 0 | 9(1) |
| 柠檬Lemon | P168(193/219) | 51 | 14 | 2 | 1 | 34(8) |
| 甜橙Sweet orange | P69(197/206) | 19 | 1 | 1 | 0 | 17(1) |
| 酸橙Soar orange | / | 12 | 4 | 2 | 1 | 5(1) |
| 香橙Yuzu | / | 8 | 1 | 3 | 0 | 4(2) |
| 柚Pummelo | / | 121 | 31 | 28 | 5 | 57(22) |
| 宽皮柑橘Mandarin | P289（缺失） | 159 | 16 | 30 | 9 | 104(29) |
| 杂柑Hybrid citrus | / | 51 | 12 | 14 | 3 | 22(11) |
| 属间杂种 Intergeneric hybrid | / | 9 | 2 | 1 | 0 | 6(3) |
| 立花橘Tachibana | P362（145/160） | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 总计Total | 500 | 111 | 86 | 24 | 279(87) |
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分析500份柑橘种质在21个位点上的指纹数据,221份柑橘种质可准确鉴别：独立标记可鉴别111份种质,2对引物组合可鉴别86份种质,3对引物组合可鉴别24份种质,大翼橙亚属、枸橼、杂柑、柚类等易鉴别;279份种质暂时无法鉴别,但可分成87组,每组包含2—17份种质,同组的种质暂时无法区分,但组间种质易鉴别;不能鉴别的种质主要为芽变品种或同物异名,如温州蜜柑、椪柑、葡萄柚、柠檬、甜橙等种质难以鉴别。
3 讨论
良种是现代农业发展的基础,优良品种的选育工作受到越来越多的重视,本研究的植物材料“柑橘”为木本果树,开花结果需要经历“童期”这一特殊植物生理阶段,因此果树新品种的选育需投入大量的时间、精力和财力,如果选育的新品种不能得到有效保护,会打击育种者的积极性,不利于品种的持续创新[29]。植物新品种保护是国家知识产权战略的重要组成部分,中国越来越重视植物品种权的保护,育种者的保护意识不断提高,柑橘新品种保护的申请量和DUS测试量逐年增加;但是由于柑橘具有：（1）不同属、种或品种间可相互授粉杂交,杂种类型繁多;（2）柑橘栽培品种主要通过嫁接等无性繁殖方式繁育,易通过自我繁殖窃取新品种权益;（3）同一品种在不同种植区域往往存在不同名称的现象,导致柑橘品种的监管难度大。近年来,柑橘产业受黄龙病、溃疡病等病害的影响,产量和质量都大大降低,优良苗木需求旺盛[30,31],各柑橘主产省份已建成或正在新建无病毒苗圃,且部分研究机构已开展柑橘的种苗认证工作,明确柑橘苗木的真实身份。UPOV将DUS测试作为新品种登记和保护的基本条件[32],本研究筛选的柑橘SSR引物及建立的DNA指纹图谱库可用于柑橘新品种DUS测试中近似品种的筛选以及种苗市场监管的身份快速鉴定,有利于柑橘育种和品种资源保护。目前,柑橘品种鉴定和指纹图谱库构建取得了较好的进展。吴鑫[33]筛选出34对SSR引物和3个ISSR引物对126份柑橘材料进行鉴定,SSR标记可鉴定66份品种,ISSR标记可鉴定27份品种;雷天刚等[16]筛选出12对SSR引物和2个ISSR引物对102份柑橘材料进行鉴定,SSR标记可鉴定42份品种,ISSR标记可鉴定28份品种。本研究用21对SSR引物鉴定500份柑橘种质,其中221份材料可准确鉴别,SSR标记在宽皮柑橘、杂柑、柚类等品种间多态性高,与前人的结果一致;将暂时区分不开的材料归为一类,剩余的279份材料分为87类,不同类的品种易鉴别。由于SSR标记在甜橙、温州蜜柑、红橘等芽变品种中的多态性较低,前人利用ISSR标记能够鉴别部分芽变品种,考虑到ISSR标记重复性差、非特异性片段多、数据间难以整合,不适于毛细管电泳平台,因此,本研究未选用ISSR标记。本研究选用的品种覆盖了柑橘属各主栽品种、枸橼、酸橙及枳属和金柑属的部分（品）种,具有较好的代表性。筛选的21对SSR引物在染色体上分布较均匀、多态性高,通过特异标记及其组合可以有效鉴别目前大多数广泛栽培的品种。另外,本研究利用毛细管电泳平台构建DNA指纹图谱库,克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳操作繁琐、费时费力、自动化程度低的缺点,能够高通量地采集数据,提高品种鉴定的效率[34]。柑橘是多年生木本植物,具有童期长、遗传背景复杂、部分栽培品种为芽变品种等特点,而芽变属体细胞变异,与芽变母本的遗传背景一致,SSR引物难以覆盖到变异位点,因此,SSR标记用于柑橘品种的鉴定存在一定的局限性[35]。随着基因组测序技术的发展,可结合SNP或简化基因组测序用于进一步鉴定芽变品种[36,37,38]。
4 结论
筛选出21对SSR核心引物,建立了基于毛细管电泳平台的柑橘品种SSR分子标记鉴定体系,构建了包含500份柑橘种质的DNA指纹图谱库,可用于柑橘品种的鉴别。（责任编辑 李莉）
The authors have declared that no competing interests exist.
