超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱结合Progenesis QI分析不同品种橙的指纹图谱及其差异性代谢物

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本站小编 Free考研考试/2021-12-26

赵希娟, 赵无疾, 许华超. 超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱结合Progenesis QI分析不同品种橙的指纹图谱及其差异性代谢物[J]. 中国农业科学, 2018, 51(13): 2551-2560 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.010
ZHAO XiJuan, ZHAO WuJi, XU HuaChao. Analysis of the Fingerprints of Different Orange Varieties and Their Differential Metabolites Based on Ultra-Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry and Progenesis QI[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2018, 51(13): 2551-2560 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.010

0 引言

【研究意义】橙属于代表性的柑橘,富含多种代谢活性物质^[1],如类黄酮、香豆素和类胡萝卜素等,具有抗氧化、抗炎等生物活性^[2]。因其集药、食两用于一身,成为大众喜爱的水果之一,通常以鲜食或者果汁形式摄入。橙品种众多,每种橙的品质不同,含有的代谢成分也不同。研究表明,橙果实的营养功能成分受品种、产地、成熟度、气候和土壤等多种因素影响^[3]。市场上橙的销售容易弄虚作假,将不同品种的橙果实混合一起出售,或者将不同产地品质差异大的同一品种混合,包括用非地理标志产品代替地理标志产品,因外观非常接近,消费者不容易区分而花高价钱买到品质差的橙子;同样,橙汁的掺假也涉及不同品种或者不同产地相同品种但品质差异大的果汁混合,比如在橙汁中添加橘子汁或者其他品种的橙汁^[4]。橙果实和橙汁的产地溯源与真实性验证是一项非常复杂的工作,因此,开发一种新的有效的方法来分析判别各品种橙代谢组分的差异以此找到其代谢标志物,对于橙果实和橙汁的真伪鉴别具有重要意义。【前人研究进展】常见的果品真伪鉴别、品质分析和品种区分方法通常是基于其次生代谢产物的代谢轮廓或者定量分析,如有机酸、多酚化合物等^[5,6,7]。实际上,定性定量分析果品中的活性成分不仅对真伪鉴别具有重要作用,而且能够评估果品的品质,对人们的消费提供指导。多种技术可以用于果品次生代谢产物的分析检测,如高效液相色谱（HPLC）^[8,9]、液质联用（LC-MS）^{[10,11,12,13]}和气质联用（GC-MS）^[14]等。随着技术的不断发展,超高效液相色谱（UPLC）和高分辨质谱如四级杆飞行时间质谱（QTof-MS）由于其分离速度快、进样体积小、准确度高等优点得到广泛应用^[15,16],尤其在指纹图谱构建和差异性代谢产物的分析鉴定方面得到研究者的关注^[17]。其中,基于LC-MS指纹图谱的非靶标代谢组学可以同时分析不同产地或者不同品种的样品中上百种代谢物,并比较其相似点以及差异之处^[18,19,20]。Progenesis QI是新一代的代谢组学数据处理软件,用于代谢物鉴定和生物标志物发现,可以同时分析大样本量的多组分,从色谱数据的对齐到鉴定出具有明显差异的代谢物,处理速度快^[21,22]。【本研究切入点】目前Progenesis QI在动物和药物的代谢组学领域应用较多,而国内未见应用于水果代谢组学的研究;此外,与UPLC-QToF-MS结合分析鉴定不同品种橙的差异性代谢物尚未见报道。【拟解决的关键问题】基于UPLC-QTof-MS和Progenesis QI建立不同品种橙果实的指纹图谱并同时分析不同品种间的差异性代谢物,筛选出各品种对应的代谢标志物,并对差异性代谢物进行鉴定。

1 材料与方法

柑橘材料于2015年采自于中国农业科学院柑橘研究所国家果树种质资源（重庆）柑橘圃,试验在西南大学园艺园林学院进行。

1.1 样品信息

为了减少环境因素对试验结果的影响,所有样品（表1）保持产地相同,选取我国特有柑橘资源地方品种以及引进种植的特色品种8个,每个品种均采摘于果实成熟期,从3株长势一致、健康的果树上,于树冠中部外围随机均匀采样混匀。
Table 1
表1
表1试验材料具体信息
Table 1Specific information of the experimental materials

序号 Number	品种名称 Variety name	资源圃编号 Repository number	简称 Abbreviation
1	鹅蛋柑 Edangan	LS0429	EG
2	S26锦橙 S26 Jincheng	LS0040	S26
3	北碚447 Beibei 447	LS0306	BB
4	长叶橙 Changyecheng	LS0091	CY
5	8045甜橙 8045 Tiancheng	LS0550	8045
6	血橙 Xuecheng	LS0111	XUEC
7	先锋橙 Xianfengcheng	LS0041	XF
8	夏橙 Xiacheng	LS0085	XIAC

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1.2 试剂

乙腈（色谱纯,美国sigma公司）,甲酸（质谱级,美国sigma公司）,试验用水为Millipore超纯水,甲醇（分析纯,成都市科龙化工试剂厂）。标准品地奥司明（纯度≥98.0%）,橙皮苷（纯度≥98.0%）和5,6,7,8,3′,4′-六甲氧基黄酮（纯度≥98.0%）购买自成都克洛玛生物科技有限公司（成都,中国）。5,6,7,4′-四甲氧基黄酮（纯度≥98.0%）,5,7,8,3′,4′-无甲氧基黄酮（纯度≥98.0%）和橘皮素（纯度≥98.0%）购自成都思天德生物科技有限公司（成都,中国）。

1.3 仪器

超声波清洗仪KQ5200DE（昆山市超声仪器有限公司）;超纯水系统Milli-Q AdvantageA10（美国Millipore公司）;离心机TDL-5A（上海菲恰尔分析仪器有限公司）;UPLC-QTof-MS/MS Xevo G2-S超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间高分辨质谱仪（美国Waters公司）,配备电喷雾离子源,二元溶剂管理器,自动进样系统,柱温箱,PDA紫外检测器;ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（美国Waters公司）。

1.4 样品准备

样品采摘后,果实表面用去离子水洗净、晾干,并分为果皮和果肉两个部分,弃去果肉部分。果皮置于40℃鼓风干燥箱中,待果皮烘干,约48 h后取出,经粉碎机粉碎,过60目筛,粉末密封于密封袋中,储存于玻璃干燥器中备用。
精确称量样品粉末0.5 g,置于10 mL离心管中,加入7 mL甲醇,涡旋摇匀后,室温条件下300 W超声30 min,5 000 r/min下离心15 min,取上清液于25 mL容量瓶中。残渣再加7 mL甲醇重复提取两次,合并上清液,最后用甲醇溶液定容至刻度线。提取液用初始流动相稀释10倍,摇匀后过0.22 µm PTFE针式滤器,前3滴弃去,续滤液置于进样小瓶中以待上机检测。

1.5 液相条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18分析柱（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）;柱温：40℃;进样量2.0 μL;流速设置为0.4 mL·min^-1;流动相的组成包括A相和B相,分别试验了含0.01%甲酸的水和含0.01%甲酸的乙腈、含0.01%甲酸的水和含0.01%甲酸的甲醇、含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的乙腈、含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的甲醇,最终优化为A相：0.01%甲酸的水,B相：含0.01%甲酸的乙腈。采用梯度洗脱,保持A相和B相配比总和为10%：0—3.0 min,5%—15% B;1.0—8.0 min,15%—25% B;8.0—9.0 min,25%—35% B;9.0—13.0 min,35%—45% B;13.0—15.0 min,45%—60% B;15.0—16.0 min,60%—90% B;16.0—18.0 min,90%—90% B;18.0—20.0 min,90%—5% B。检测波长为283 nm和330 nm,波长扫描范围200—400 nm。

1.6 质谱条件

UPLC-QTof-MS系统使用ESI离子源,在正负两种离子模式下全扫描采集数据。质谱扫描范围m/z 100—1 000,扫描时间0.2 s,参数设置与文献一致^[15]。

1.7 数据分析

使用Unifi软件采集数据并对潜在标志物进行分子式匹配。使用Progenesis QI软件对采集的数据进行代谢组学部分的分析,包括峰对齐、峰提取、去卷积化、归一化、多元统计分析等过程。本研究采用LC-MS技术建立8种橙果实代谢轮廓指纹图谱,并结合主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）、变量重要性投影（VIP）等化学计量学方法寻找8个品种橙果实之间的代谢差异物,即橙类的潜在分类标志物。

2 结果

2.1 橙的指纹图谱

使用UPLC-QTof-MS/MS系统对8个品种橙果皮的甲醇提取物进行分析,优化了流动相的组成和洗脱梯度。在最优的条件下,得到了8种橙果皮的代谢轮廓指纹图谱。如图1-A所示,负离子模式下,8种橙的代谢成分存在差异,如血橙2—3 min出现的峰对应的物质种类和相对含量与其他橙明显不同;长叶橙可见两个峰分别在12.36 min和11.80 min处,而另外7种橙则没有。同样的,正离子模式下（图1-B）,8种橙的代谢指纹图谱差异明显,尤其是北碚447锦橙和血橙。北碚447锦橙在保留时间2—10 min的差异性峰最明显,血橙在5—6 min和8—9 min之间有非常明显区别于其他橙的峰出现。从图1的指纹图谱肉眼可见8种橙的代谢组分存在明显差异,为接下来QI软件分析差异性代谢物奠定了基础。

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图18种橙果皮甲醇提取物基峰离子流图
A：负离子模式;B：正离子模式。a：XUEC,血橙;b：XIAC,夏橙;c：XF,先锋橙;d：S26,S26锦橙;e：EG,鹅蛋柑;f：CY,长叶橙;g：BB,北碚447锦橙;h：8045,8045甜橙。*代表已鉴定的差异代谢物。下同
-->Fig. 1Base peak ion (BPI) chromatograms of the methanol extracts of 8 orange cultivars
A: in the negative ion mode; B: in the positive ion mode. a: XUEC, Xuecheng; b: XIAC, Xiacheng; c: XF, Xianfengcheng; d: S26, S26Jincheng; e: EG, Edangan; f: CY, Changyecheng; g: BB, Beibei 447 Jincheng; h: 8045, 8045 Tiancheng. * indicate the identified differential metabolites. The same as below
-->

2.2 Progenesis QI分析

在进行QI组学分析之前首先要考察试验数据的可靠性。试验样品一共分为9组,包括一组QC（quality control）样品和8组橙果实样品（分别对应8种橙）,每组6个样品。正离子模式下所得数据使用QI软件处理得分析变量为13 926,即所得数据矩阵为54×13926。从图2-A和图2-C可见,QC样本分布集中,且RSD<15%的变量占56.36%,RSD<30%的变量占81.32%。负离子模式下数据矩阵为54× 12015,QC样品聚集程度相对良好,且RSD<15%的化合物占64.80%,RSD<30%的化合物占88.42%（图2-B、2-D）。总体来说,本方法在整个过程中稳定,重复性良好,适合用于橙类的代谢组学分析,所得数据稳定可靠^[23,24]。

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图2数据可靠性分析
A：正离子模式下的PCA图;B：负离子模式下的PCA图;C：正离子模式下RSD值分布;D：负离子模式下RSD值分布
-->Fig. 2Reliability analysis of the data
A: PCA score plot in the positive mode; B: PCA score plot in the negative mode; C: RSD distribution in the positive mode; D: RSD distribution in the negative mode
-->

从图3-A可以看出,正离子模式下各品种各自聚集在一起,其中血橙、长叶橙和8045甜橙距离较远,说明3种橙果实的代谢差异较大,而鹅蛋柑、先锋橙与8045甜橙距离较近,说明这3种橙果实代谢相似。同样,北碚447锦橙与夏橙两种距离相近,说明二者代谢相似。从图3-B可以看出,各品种在负离子模式下更为集中,并且得出的聚类结果与正离子模式下相似：血橙、长叶橙和8045甜橙距离较远,鹅蛋柑、先锋橙与8045甜橙距离较近,北碚447锦橙与夏橙距离相近。

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图38种橙的PCA分析图
A：正离子模式下PCA得分图,其中第一主成分占46.83%,第二主成分占19.39%;B：负离子模式下PCA得分图,其中第一主成分占45.83%,第二主成分占20.31%
-->Fig. 3PCA scores of the 8 orange cultivars
A: The PCA score plot in the positive ion mode, the first principal component accounts for 46.83%, and the second principal component accounts for 19.39%; B: The PCA score plot in the negative ion mode, the first principal component accounts for 45.83%, and the second principal component accounts for 20.31%
-->

2.3 差异性代谢物的筛选

以鹅蛋柑为例分析其区别于其他7种橙的代谢物。先将UPLC-MS/MS数据导入Progenesis QI软件中,以离子强度图进行图形对齐数据,再进行峰提取,保证数据的零丢失,自动归属同一化合物产生的不同加合信号,再提取MS^E数据,软件自动辨别和浏览离子淌度分离结果,提取所有满足条件的组分信号,得到相应的变量信息,数据归一化;再将鹅蛋柑与其他品种分为两组得OPLS-DA散点图（图4-A）,鹅蛋柑在第一主成分轴上明显分开,说明鹅蛋柑有明显区别于其他7种橙的代谢成分。模型验证参数R²Y=99%,R²Q=98%,说明该模型的可靠性及预测性均良好。得到对应的Loadings图,如图4-B所示,正轴表示鹅蛋柑,负轴表示其他品种,一个点代表一个变量,离原点越远表示该变量在该组含量越高。图4-C为S-Plot图,与Loadings图类似,越是在图的两端代表该化合物在该组的含量越高,重复性越好。VIP图,是重要变量性图,通常认为VIP值大于1的变量具有统计学意义。再参照变量变化趋势图来筛选潜在代谢标志物,选择在鹅蛋柑中含量高,在其他品种中含量低或者为零的变量。如图4-D所示,该物质只在鹅蛋柑中存在,在其他橙果实中的含量为零。最后将筛选出的变量借助高分辨质谱的优势用Unifi软件匹配可得较为准确的分子式。使用同样的流程筛选找到其他橙正负离子模式下各自的代谢标志物（附表1-16）。

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图4以鹅蛋柑（EG）正离子模式的数据为例筛选品种间差异性代谢物
A：EG VS Group的偏最小二乘法判别分析图,R²Y=99%,R²Q=98%;B：载荷图;C：S-Plot图;D：变量变化趋势图
-->Fig. 4Taking EG in the positive ion mode as the example to screen the differential metabolites among varieties
A: OPLS-DA of EG VS Group, R²Y=99%, R²Q=98%; B: Loadings plot; C: S-Plot; D: Variable trend diagram
-->

Table S1
附表1
附表1鹅蛋柑正离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S1The metabolites in Edangan different from those in the other oranges in the positive ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	273.0766	5.79	C₁₅H₁₂O₅	3.23	6.5	0.0496
2	440.1079	12.81	C₂₁H₁₇N₃O₈	-2.23	6.4	-0.0491
3	433.1489	9.13	C₂₂H₂₄O₉	-0.95	6.3	0.0476
4	614.1765	9.13	C₃₂H₂₇N₃O₁₀	-0.73	6.2	0.0478
5	611.1594	3.01	C₂₇H₃₀O₁₆	-2.03	6.1	-0.0466
6	796.1487	3.86	C₃₆H₂₅N₇O₁₅	0.74	6.1	0.0467
7	827.6605	12.15	C₁₆H₇₀N₃₈O₂	-1.38	6.0	-0.0464
8	433.4505	12.81	C₂₉H₅₆N₂	-2.58	5.9	-0.0459
9	367.1507	1.88	C₁₇H₂₂N₂O₇	1.92	5.8	0.0458
11	316.285	14.6	C₁₈H₃₇NO₃	1.3	5.7	-0.0433
12	473.2174	6.24	C₂₆H₃₂O₈	0.84	5.7	-0.0435
13	419.1335	13.17	C₂₁H₂₂O₉	-0.4	5.7	-0.0435
14	403.3776	12.16	C₂₄H₅₀O₄	-1.43	5.6	-0.0432
15	419.1336	14.67	C₂₁H₂₂O₉	-0.12	5.5	-0.0418
16	600.1613	5.79	C₁₉H₂₉N₅O₁₇	-3.06	5.4	0.0418
17	668.2897	4.57	C₂₉H₃₇N₁₁O₈	-0.32	5.3	-0.0407
18	470.1083	0.85	C₂₃H₁₉NO₁₀	0.34	5.2	0.042
19	906.2072	12.15	C₃₉H₃₅N₇O₁₉	1.22	5.2	-0.0398
20	449.1439	6.55	C₂₂H₂₄O₁₀	-0.72	5.2	0.0394
21	388.1149	12.15	C₁₉H₁₃N₇O₃	-0.89	5.0	-0.0382
22	623.179	12.16	C₁₉H₁₈N₂₀O₆	-0.22	5.0	-0.0382
23	889.2199	12.14	C₃₀H₃₂N₁₆O₁₇	-0.56	4.9	-0.038
24	864.4942	10.95	C₁₀H₅₃N₃₉O₉	-2.26	4.9	0.0372
25	671.2293	8.18	C₂₉H₃₈N₂O₁₆	-0.12	4.8	-0.0365
26	859.2389	12.14	C₃₉H₄₂N₂O₂₀	-1.66	4.8	-0.0367

p[1]*小于0.05代表两组之间有统计学差异。下同p[1]*<0.05 indicated that there are statistical differences between the two groups. The same as below

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Table S2
附表2
附表2鹅蛋柑负离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S2The metabolites in Edangan different from those in the other oranges in the negative ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	609.1446	4.67	C₂₇H₃₀O₁₆	-2.42	5.82019	-0.0494
2	959.2499	9.66	C₆₂H₄₀O₁₁	0.1	5.76277	-0.0494
3	717.2327	4.49	C₄₂H₃₈O₁₁	-2.05	5.69717	-0.0484
4	977.2813	7.33	C₅₉H₄₆O₁₄	-0.14	5.6897	-0.0489
5	777.194	3.86	C₂₈H₄₂O₂₅	-0.36	5.59391	0.0477
6	629.1619	9.13	C₄₁H₂₆O₇	2.12	5.54622	0.0475
7	579.1341	4.17	C₂₆H₂₈O₁₅	-2.56	5.52214	-0.0475
8	840.1296	3.86	C₅₅H₂₃NO₉	-0.49	5.3751	0.0462
9	678.0841	5.78	C₄₃H₁₃N₅O₅	-0.42	5.36487	0.0461
10	735.2144	0.67	C₃₄H₄₀O₁₈	0.29	5.35637	-0.0453
11	461.1095	5.42	C₂₂H₂₂O₁₁	1.22	5.23974	-0.0446
12	642.1645	5.79	C₃₆H₂₁N₉O₄	0.2	4.99588	0.0428
13	960.3285	0.65	C₄₉H₅₅NO₁₉	-1.14	4.94028	0.0411
14	461.1099	5.18	C₂₂H₂₂O₁₁	2	4.744	-0.0405
15	641.1346	3.01	C₂₇H₃₀O₁₈	-2.08	4.68674	-0.0399
16	633.2525	8.09	C₃₂H₄₂O₁₃	-4.41	4.61154	0.0393
17	719.2459	6.2	C₂₄H₄₈O₂₄	-0.52	4.5986	-0.0393
18	592.207	0.61	C₂₁H₃₉NO₁₈	-4.19	4.54876	0.0382
19	649.2446	9.56	C₃₉H₃₈O₉	0.37	4.49205	-0.0384
20	839.2132	4.6	C₅₁H₃₆O₁₂	-0.26	4.43805	0.0379
21	737.2297	0.67	C₃₄H₄₂O₁₈	-0.21	4.43357	-0.0371
22	749.1682	4.5	C₄₄H₃₀O₁₂	2.29	4.42497	-0.039
23	656.1791	9.13	C₃₆H₂₇N₅O₈	0.57	4.40389	0.0378
24	813.2356	5.31	C₅₀H₃₈O₁₁	1.82	4.36065	0.0374

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Table S3
附表3
附表3血橙正离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S3The metabolites in Xuecheng different from those in the other oranges in the positive ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	595.2014	9.13	C₂₈H₃₄O₁₄	-1.25	6.37969	0.0495
2	745.2087	12.19	C₄₀H₄₀O₁₄	-2.13	6.2881	0.0493
3	465.139	6.55	C₂₂H₂₄O₁₁	-1.2	6.2134	0.0477
4	757.2524	6.55	C₃₄H₄₄O₁₉	-3.38	6.20584	0.0479
5	343.1238	0.62	C₁₂H₂₂O₁₁	0.91	6.10357	0.0467
6	609.1803	6.17	C₂₈H₃₂O₁₅	-1.79	6.08279	0.0474
7	348.0508	2.64	C₁₉H₉NO₆	1.55	5.99046	-0.0458
8	343.0814	11.23	C₁₈H₁₄O₇	0.41	5.91347	0.047
9	359.1127	12.92	C₁₉H₁₈O₇	0.48	5.88792	0.0466
10	494.2591	2.75	C₂₂H₃₉NO₁₁	-0.95	5.83723	-0.0446
11	276.1452	0.94	C₁₂H₂₁NO₆	3.66	5.81175	0.0431
12	596.2899	4.97	C₂₃H₃₇N₁₁O₈	0.01	5.74448	-0.044
13	434.2388	5.14	C₂₀H₃₅NO₉	0.7	5.70059	-0.0437
14	389.1229	12.31	C₂₀H₂₀O₈	-0.45	5.57151	0.0451
15	302.3058	14.99	C₁₈H₃₉NO₂	1.61	5.53349	0.0424
16	434.2383	4.99	C₂₀H₃₅NO₉	-0.48	5.46848	-0.0419
17	325.0765	6.59	C₁₁H₁₆O₁₁	0.01	5.45235	0.0414
18	348.051	2.45	C₂₀H₅N₅O₂	-1.67	5.30489	-0.0402
19	359.1127	9.82	C₁₉H₁₈O₇	0.42	5.26985	0.0426
20	595.1649	4.9	C₂₇H₃₀O₁₅	-1.44	5.23521	0.0407
21	706.1388	6.59	C₃₄H₂₇NO₁₆	2.13	5.18172	0.0396
22	642.1806	2.64	C₃₁H₃₁NO₁₄	-1.73	5.15193	-0.04
23	208.1192	0.59	C₉H₁₃N₅O	-0.42	5.07335	-0.039
24	434.2385	5.43	C₂₀H₃₅NO₉	0.03	5.05729	-0.0386
25	437.1939	14.6	C₂₆H₂₈O₆	-4.44	4.97425	0.0377
26	738.1494	0.65	C₃₁H₃₁NO₂₀	-2.43	4.94921	0.0374
27	580.2958	4.39	C₂₆H₄₅NO₁₃	-0.98	4.92815	-0.0379
28	628.1752	3.68	C₂₈H₃₂O₁₆	-1.86	4.90844	0.0383
29	750.255	6.52	C₃₃H₄₅NO₁₇	-4.05	4.90844	0.0376
30	434.2387	5.26	C₂₀H₃₅NO₉	0.65	4.90625	-0.0375

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Table S4
附表4
附表4血橙负离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S4The metabolites in Xuecheng different from those in the other oranges in the negative ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	563.1401	4.54	C₂₆H₂₈O₁₄	-0.99	5.77288	0.0477
2	533.1717	0.66	C₁₉H₃₄O₁₇	-1.15	5.77019	0.0483
3	677.1654	6.51	C₃₈H₃₀O₁₂	-1.62	5.76443	0.0494
4	647.1562	5.79	C₃₇H₂₈O₁₁	0.42	5.68688	0.0495
5	503.1622	0.61	C₁₈H₃₂O₁₆	0.95	5.54656	0.0465
6	251.1179	1.03	C₁₆H₁₆N₂O	-4.31	5.45523	-0.0467
7	615.1662	9.13	C₃₇H₂₈O₉	0.3	5.30345	0.0464
8	845.2691	0.62	C₄₄H₄₆O₁₇	3.43	5.28554	0.0447
9	609.2363	2.43	C₃₃H₃₈O₁₁	3.55	5.03086	-0.043
10	563.14	4.68	C₂₆H₂₈O₁₄	-1.08	4.94139	0.0409
11	593.1494	6.58	C₂₇H₃₀O₁₅	-3.04	4.89365	0.0424
12	377.0893	0.66	C₁₈H₁₈O₉	3.98	4.83528	0.0426
13	629.2044	5.23	C₃₅H₃₄O₁₁	2.55	4.81137	0.0414
14	465.1992	7.37	C₂₁H₃₀N₄O₈	0.22	4.78248	-0.0409
15	577.155	5.86	C₂₇H₃₀O₁₄	-2.25	4.75929	0.0417
16	507.2085	7.97	C₂₂H₃₆O₁₃	0.4	4.52032	-0.0385
17	633.3376	13.44	C₃₃H₅₀N₂O₁₀	-2.62	4.51162	-0.0386
18	785.222	9.87	C₄₅H₃₈O₁₃	-2.51	4.4931	0.0378
19	529.2135	4.42	C₂₁H₃₈O₁₅	-0.48	4.48159	-0.0381
20	707.1453	6.6	C₃₁H₃₂O₁₉	-1.77	4.47577	0.0385

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Table S5
附表5
附表5夏橙正离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S5The metabolites in Xiacheng different from those in the other oranges in the positive ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	274.2748	12.72	C₁₆H₃₅NO₂	2.61	6.96931	0.0458
2	318.3005	12.91	C₁₈H₃₉NO₃	0.6	6.60657	0.0443
3	757.2515	6.55	C₃₄H₄₄O₁₉	-4.57	6.50768	0.0419
4	465.1384	6.55	C₂₂H₂₄O₁₁	-1.53	6.40319	0.0428
5	488.1914	3.82	C₂₅H₂₉NO₉	-0.3	6.37004	-0.0494
6	349.022	1.43	C₁₆H₄N₄O₆	4.71	6.35074	-0.0492
7	533.0825	2.7	C₃₈H₁₂O₄	3.05	6.18916	-0.0472
8	371.1531	0.84	C₁₄H₂₆O₁₁	-4.67	6.16312	-0.0472
9	936.2007	1.43	C₁₈H₂₅N₂₉O₁₈	0.2	6.14902	-0.0484
10	409.1973	2.39	C₂₀H₂₈N₂O₇	0.92	6.09424	-0.0486
11	581.1865	5.79	C₂₇H₃₂O₁₄	-0.02	6.08735	0.0381
12	228.077	0.85	C₁₂H₉N₃O₂	1.09	6.07341	-0.048
13	470.108	0.82	C₂₃H₁₉NO₁₀	-0.37	5.92974	-0.0466
14	630.1705	6.52	C₁₄H₁₅N₂₅O₆	-0.78	5.92398	0.0408
15	675.2603	6.24	C₂₉H₄₂N₂O₁₆	-0.56	5.91328	-0.0432
16	449.1789	5.38	C₂₀H₂₀N₁₀O₃	-0.85	5.78668	0.0468
17	344.1345	0.82	C₁₅H₂₁NO₈	1.36	5.70631	0.0432
18	414.0454	0.6	C₁₉H₁₁NO₁₀	-0.46	5.68599	0.0408
19	332.1241	0.85	C₁₆H₁₇N₃O₅	0.1	5.68472	-0.0454
20	574.1982	2.24	C₂₁H₃₅NO₁₇	0.79	5.67981	-0.0443
21	268.1033	0.61	C₁₀H₁₃N₅O₄	-2.92	5.67642	-0.0451
22	741.221	3.78	C₃₃H₄₀O₁₉	-3.59	5.59691	-0.043
23	393.1032	2.7	C₁₅H₂₀O₁₂	1.14	5.59395	-0.0427
24	378.0388	2.42	C₂₃H₇NO₅	-2.41	5.5455	-0.0431
25	473.2023	4.69	C₂₂H₃₂O₁₁	1.23	5.46473	0.0433
26	373.1284	13.25	C₂₀H₂₀O₇	0.54	5.4455	-0.0294
27	490.2078	5.98	C₂₅H₃₁NO₉	1.27	5.43257	-0.0426
28	298.0632	0.61	C₆H₁₁N₅O₉	0.66	5.38635	0.0393
29	375.0923	2.7	C₁₅H₁₈O₁₁	0.25	5.34517	-0.0407

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Table S6
附表6
附表6夏橙负离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S6The metabolites in Xiacheng different from those in the other oranges in the negative ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	593.1501	4.91	C₂₇H₃₀O₁₅	-1.84	6.68502	0.0499
2	563.1404	4.54	C₂₆H₂₈O₁₄	-0.49	5.91707	0.047
3	798.2796	0.64	C₃₆H₄₉NO₁₉	-3.77	5.86195	0.0489
4	443.1942	2.47	C₂₁H₃₂O₁₀	4.32	5.86048	0.0498
5	754.2547	0.6	C₃₁H₃₇N₁₁O₁₂	-0.44	5.77027	-0.0488
6	983.3131	3.83	C₅₅H₅₂O₁₇	-0.06	5.73028	-0.0478
7	339.2035	15.04	C₁₅H₃₂O₈	3.08	5.72471	0.0473
8	627.1749	3.36	C₂₄H₃₆O₁₉	-4.68	5.70632	-0.0481
9	521.1722	0.62	C₁₈H₃₄O₁₇	-0.22	5.6773	0.0461
10	607.1657	6.41	C₂₈H₃₂O₁₅	-1.95	5.65237	0.0392
11	915.2677	5.66	C₄₂H₄₈N₂O₂₁	0	5.63751	0.0489
12	536.0466	2.67	C₃₈H₇N₃O₂	0.04	5.62954	-0.0475
13	791.2542	4.62	C₄₁H₄₄O₁₆	-1.8	5.62789	-0.048
14	669.2725	5.23	C₂₇H₄₆N₂O₁₇	0.25	5.6263	-0.0479
15	907.3113	9.15	C₅₇H₄₈O₁₁	-1.15	5.42851	-0.046
16	770.2495	0.6	C₄₇H₃₇N₃O₈	-1.67	5.40896	-0.0448
17	917.2612	7.48	C₅₇H₄₂O₁₂	0.97	5.40768	-0.0444
18	831.3204	4.45	C₄₀H₅₂N₂O₁₇	1.3	5.32064	-0.0464
19	779.1957	6.89	C₄₉H₃₂O₁₀	4.33	5.31993	-0.046
20	565.1921	5.04	C₂₇H₃₄O₁₃	-1.03	5.16505	-0.044
21	993.369	4.59	C₄₂H₅₈N₈O₂₀	-0.45	5.14148	-0.0436
22	672.1747	6.59	C₃₇H₂₃N₉O₅	-0.43	5.11458	0.0425
23	597.1808	5.2	C₂₇H₃₄O₁₅	-2.83	5.09198	0.0415
24	885.2555	9.54	C₅₃H₄₂O₁₃	0.22	5.0656	-0.0456
25	623.1599	3.68	C₂₈H₃₂O₁₆	-2.95	5.06431	0.0334
26	563.1399	4.68	C₂₆H₂₈O₁₄	-1.31	5.03243	0.0395

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Table S7
附表7
附表7先锋橙正离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S7The metabolites in Xianfengcheng different from those in the other oranges in the positive ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	310.1293	1.37	C₁₅H₁₉NO₆	2.58	6.47085	-0.0494
2	815.2223	6	C₃₆H₃₈N₄O₁₈	-3.79	6.3635	-0.0494
3	316.2852	14.6	C₁₈H₃₇NO₃	1.84	6.21688	-0.0476
4	412.1463	2.55	C₁₆H₂₁N₅O₈	-0.07	6.189	-0.0481
5	417.1755	5.17	C₁₉H₂₈O₁₀	0.04	6.11487	-0.0471
6	359.1129	12.92	C₁₉H₁₈O₇	1.01	6.02298	-0.0467
7	515.2275	7.2	C₂₈H₃₄O₉	-0.1	5.92341	0.0474
8	668.2895	4.57	C₂₉H₃₇N₁₁O₈	-0.72	5.86981	0.0461
9	630.171	6.52	C₁₆H₂₇N₁₁O₁₆	0	5.74865	-0.0449
10	302.306	14.99	C₁₈H₃₉NO₂	2.14	5.73061	-0.0451
11	475.1763	0.62	C₂₈H₂₆O₇	2.51	5.6603	-0.0429
12	565.1551	4.69	C₂₆H₂₈O₁₄	-0.18	5.58823	-0.0422
13	280.1398	0.68	C₁₁H₂₁NO₇	2.62	5.52591	-0.0428
14	704.1747	4.57	C₃₉H₂₉NO₁₂	-2.24	5.40194	0.0427
15	419.1337	14.67	C₂₁H₂₂O₉	0.03	5.33505	-0.0408
16	797.2101	4.32	C₃₁H₃₆N₆O₁₉	-0.89	5.32334	-0.0408
17	423.1629	2.9	C₂₁H₂₆O₉	-4.83	5.31733	-0.0411
18	473.2017	4.69	C₂₂H₃₂O₁₁	-0.1	5.31567	-0.0417
19	845.2338	6.13	C₃₇H₄₀N₄O₁₉	-2.55	5.25196	-0.0404
20	377.1924	1.21	C₁₆H₂₈N₂O₈	1.35	5.24788	-0.0404
21	258.1346	0.94	C₁₂H₁₉NO₅	3.97	5.15397	-0.0397
22	625.1757	3.68	C₂₈H₃₂O₁₆	-0.95	5.10405	-0.0384
23	307.1772	3.19	C₁₅H₂₂N₄O₃	2.49	4.95113	0.0379
24	419.1336	5.78	C₂₁H₂₂O₉	-0.16	4.94799	0.0371
25	388.1149	12.15	C₁₉H₁₃N₇O₃	-1.04	4.94553	-0.0376
26	313.0712	12.22	C₁₇H₁₂O₆	1.68	4.91494	-0.0387
27	314.0928	0.88	C₁₉H₁₁N₃O₂	1.2	4.8526	-0.0371

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Table S8
附表8
附表8先锋橙负离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S8The metabolites in Xianfengcheng different from those in the other oranges in the negative ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	563.1403	4.68	C₂₆H₂₈O₁₄	-0.67	5.74521	-0.0482
2	461.0987	0.83	C₂₄H₁₈N₂O₈	-0.71	5.68999	-0.0484
3	765.181	4.19	C₄₁H₃₄O₁₅	-1.94	5.57051	-0.0485
4	651.2632	6.2	C₃₂H₄₄O₁₄	-3.99	5.44348	0.041
5	947.2704	7.69	C₅₈H₄₄O₁₃	-0.55	5.24041	-0.0457
6	863.2305	0.82	C₅₇H₃₆O₉	2.13	5.15101	0.0464
7	761.2567	7.18	C₂₆H₅₀O₂₅	-0.17	5.04408	0.0436
8	282.0889	0.88	C₁₅H₁₃N₃O₃	1.64	4.93064	-0.0411
9	471.188	4.65	C₂₂H₃₂O₁₁	1.75	4.81185	-0.039
10	605.2575	4.51	C₃₁H₄₂O₁₂	-0.72	4.80082	0.0412
11	739.2762	10.48	C₄₂H₄₄O₁₂	0.22	4.72666	0.0417
12	615.1461	5.79	C₄₀H₂₄O₇	1.97	4.69626	0.0437
13	604.1719	0.66	C₃₄H₂₇N₃O₈	-1.1	4.66582	-0.0402
14	843.2101	5.73	C₅₀H₃₆O₁₃	2.1	4.58595	-0.0408
15	843.2106	5.83	C₅₀H₃₆O₁₃	2.75	4.57123	-0.0396
16	737.2302	0.67	C₃₄H₄₂O₁₈	0.53	4.5415	-0.0369
17	609.1439	3.01	C₂₇H₃₀O₁₆	-3.55	4.52018	-0.0376
18	815.2686	0.62	C₄₇H₄₄O₁₃	-2.79	4.46388	-0.0368
19	631.1615	6.51	C₃₇H₂₈O₁₀	0.87	4.45593	-0.0399
20	607.1654	6.41	C₂₈H₃₂O₁₅	-2.34	4.44172	-0.0363
21	997.3429	5.78	C₆₀H₅₄O₁₄	-1.23	4.4311	0.0404
22	513.1255	3.77	C₂₂H₂₆O₁₄	0.97	4.36806	-0.0383
23	498.082	2.9	C₃₃H₁₃N₃O₃	1.77	4.35709	-0.0364
24	647.1561	5.79	C₃₇H₂₈O₁₁	0.33	4.35006	0.038

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Table S9
附表9
附表9S26锦橙正离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S9The metabolites in S26 Jincheng different from those in the other oranges in the positive ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	449.1041	5.33	C₁₆H₂₀N₂O₁₃	-1.04	6.58198	-0.0489
2	575.2649	0.51	C₃₄H₃₈O₈	1.68	6.4651	-0.0494
3	644.3266	3.63	C₃₁H₄₉NO₁₃	-1.64	6.27628	-0.0479
4	316.2849	14.6	C₁₈H₃₇NO₃	0.76	6.27378	0.0472
5	504.2076	1.21	C₂₂H₃₃NO₁₂	0.14	6.16917	-0.0461
6	570.2178	2.16	C₂₆H₃₅NO₁₃	-0.57	6.13673	-0.0466
7	581.1852	3.86	C₂₇H₃₂O₁₄	-2.23	6.11955	-0.0448
8	345.0968	6.56	C₁₈H₁₆O₇	-0.32	6.04895	-0.0461
9	728.3965	9.72	C₃₅H₅₇N₃O₁₃	0.12	6.03694	-0.0443
10	413.1223	6.55	C₂₂H₂₀O₈	-2.05	6.01068	-0.0458
11	310.1294	1.37	C₁₅H₁₉NO₆	2.74	5.95271	0.0463
12	917.2884	5.65	C₃₃H₄₀N₁₆O₁₆	0.33	5.94233	-0.0436
13	290.0767	0.61	C₁₃H₁₁N₃O₅	-1.51	5.84237	-0.0449
14	883.2562	0.63	C₃₀H₃₈N₁₄O₁₈	0.12	5.8321	-0.0457
15	518.3249	15.63	C₂₈H₄₃N₃O₆	4.65	5.79944	-0.0449
16	474.3584	15.26	C₂₉H₄₇NO₄	1.38	5.73263	-0.0439
17	790.2738	4.6	C₃₀H₄₃N₇O₁₈	0.06	5.72193	-0.0426
18	330.1553	0.67	C₁₅H₂₃NO₇	1.86	5.71534	-0.0432
19	611.5509	6.55	C₂₅H₆₆N₁₄O₃	-0.96	5.57709	-0.0425
20	262.1294	0.68	C₁₁H₁₉NO₆	3.36	5.54104	0.0435
21	470.1087	0.85	C₂₄H₁₅N₅O₆	-1.7	5.51342	0.0434
22	298.0634	0.61	C₆H₁₁N₅O₉	1.64	5.48281	-0.0427
23	611.1964	6.54	C₂₈H₃₄O₁₅	-0.98	5.43932	-0.0422
24	406.1036	4.6	C₆H₁₁N₁₅O₇	-0.55	5.36619	-0.0394
25	396.035	0.66	C₁₉H₉NO₉	-0.04	5.31618	-0.041
26	342.14	0.58	C₁₂H₂₃NO₁₀	1.66	5.29799	-0.0405

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Table S10
附表10
附表10S26锦橙负离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S10The metabolites in S26 Jincheng different from those in the other oranges in the negative ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	807.2037	4.6	C₂₉H₄₄O₂₆	-1.38	5.90536	-0.05
2	879.2069	5.31	C₅₃H₃₆O₁₃	-1.57	5.89934	-0.0488
3	777.1942	3.86	C₂₈H₄₂O₂₅	-0.12	5.87804	-0.0488
4	661.1713	9.13	C₃₈H₃₀O₁₁	-0.42	5.65283	-0.0471
5	840.129	3.86	C₅₆H₁₉N₅O₅	-2.76	5.61629	-0.0465
6	821.263	4.32	C₄₉H₄₂O₁₂	3.25	5.6064	-0.0467
7	565.1919	5.04	C₂₇H₃₄O₁₃	-1.3	5.4034	-0.0443
8	647.1559	5.79	C₃₇H₂₈O₁₁	0.04	5.3153	-0.0439
9	871.1727	3.86	C₄₃H₃₆O₂₀	0.01	4.9828	-0.0412
10	429.1785	4.66	C₂₀H₃₀O₁₀	4.46	4.91269	-0.0422
11	443.194	2.47	C₂₁H₃₂O₁₀	3.92	4.875	-0.042
12	855.1778	4.61	C₄₃H₃₆O₁₉	0	4.84272	-0.0408
13	521.1729	0.62	C₁₈H₃₄O₁₇	1.09	4.79995	-0.0411
14	593.1499	6.58	C₂₇H₃₀O₁₅	-2.14	4.79147	-0.041
15	975.2501	3.85	C₅₅H₄₄O₁₇	-0.44	4.77005	-0.0436
16	871.2418	8.81	C₄₅H₄₄O₁₈	-4.25	4.73234	-0.0421
17	613.2108	4.27	C₂₈H₃₈O₁₅	-4.87	4.70006	-0.0385
18	739.2025	5.34	C₄₀H₃₆O₁₄	-0.93	4.69833	-0.0399
19	708.0926	6.61	C₄₄H₁₅N₅O₆	-3.27	4.69533	-0.0415
20	960.3301	0.65	C₄₉H₅₅NO₁₉	0.57	4.68043	-0.044
21	683.2872	6.48	C₄₀H₄₄O₁₀	1.49	4.62997	-0.0394
22	908.4757	10.02	C₄₅H₇₁N₃O₁₆	-0.46	4.60686	-0.0384
23	432.0015	0.82	C₂₇H₃N₃O₄	-8.38	4.56015	-0.0389
24	862.2871	0.66	C₅₁H₄₅NO₁₂	0.23	4.54462	-0.0426
25	505.135	5.31	C₂₄H₂₆O₁₂	-0.36	4.42791	-0.0365

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Table S11
附表11
附表11长叶橙正离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S11The metabolites in Changyecheng different from those in the other oranges in the positive ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	600.1619	5.79	C₁₆H₂₁N₁₅O₁₁	0.28	6.60931	-0.0498
2	676.1305	5.78	C₃₄H₂₁N₅O₁₁	-0.76	6.55517	-0.0497
3	325.0768	6.59	C₁₁H₁₆O₁₁	0.65	6.35936	-0.0494
4	343.1224	0.62	C₁₂H₂₂O₁₁	-3.24	6.26185	-0.0486
5	787.2421	9.87	C₃₈H₄₂O₁₈	-2.9	6.16386	-0.0466
6	218.2123	7.18	C₁₂H₂₇NO₂	3.66	6.12303	-0.048
7	415.2118	14.6	C₂₄H₃₀O₆	0.69	6.08933	-0.0476
8	246.2439	10.35	C₁₄H₃₁NO₂	4.67	6.03608	-0.0473
9	728.3957	9.72	C₃₃H₄₅N₁₇O₃	-1.01	6.0136	-0.0464
10	262.1289	0.68	C₁₁H₁₉NO₆	1.33	6.00632	-0.0461
11	367.1504	1.88	C₁₇H₂₂N₂O₇	1.21	5.99204	-0.0465
12	433.1493	9.13	C₂₂H₂₄O₉	-0.14	5.94617	-0.0447
13	486.1966	1.25	C₂₂H₃₁NO₁₁	-0.82	5.88105	-0.0456
14	359.1127	12.92	C₁₉H₁₈O₇	0.59	5.86614	0.0454
15	343.1186	12.22	C₁₉H₁₈O₆	3	5.82556	0.0477
16	230.2488	12.81	C₁₄H₃₁NO	4.1	5.82435	-0.0456
17	330.1548	0.67	C₁₅H₂₃NO₇	0.16	5.80685	-0.0453
18	455.2063	7.21	C₂₆H₃₀O₇	-0.37	5.76497	-0.0437
19	345.0967	6.56	C₁₈H₁₆O₇	-0.46	5.63918	-0.0439
20	413.1224	6.55	C₂₂H₂₀O₈	-1.61	5.62896	-0.0439
21	766.2122	7.43	C₃₉H₂₃N₁₅O₄	-1.02	5.61459	-0.0426
22	706.1392	6.59	C₃₁H₁₉N₁₁O₁₀	0.39	5.51103	-0.0432
23	640.3452	15.98	C₃₂H₄₅N₇O₇	-0.18	5.48047	-0.043
24	403.1395	12.15	C₂₁H₂₂O₈	1.9	5.40725	-0.0442
25	714.2641	7.19	C₁₉H₃₁N₂₁O₁₀	0.8	5.40457	-0.0409
26	730.3273	7.44	C₃₄H₅₁NO₁₆	-1.03	5.34035	-0.0405
27	518.324	15.63	C₂₉H₃₉N₇O₂	0.29	5.31737	-0.0417
28	614.1772	9.13	C₁₇H₂₃N₁₅O₁₁	-0.45	5.30624	-0.0397
29	367.1237	7.2	C₁₄H₂₂O₁₁	0.63	5.30548	-0.0403
30	533.2379	7.19	C₂₈H₃₆O₁₀	-0.44	5.28208	-0.0402
31	879.3228	10.24	C₃₈H₅₀N₆O₁₈	-3.06	5.27022	-0.0402
32	376.1297	7.43	C₉H₂₁N₅O₁₁	-3.63	5.24585	-0.0399

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Table S12
附表12
附表12长叶橙负离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S12The metabolites in Changyecheng different from those in the other oranges in the negative ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	901.325	10.23	C₃₉H₅₀N₈O₁₇	3.15	5.8668	-0.05
2	453.1937	12.36	C₂₆H₃₀O₇	4.06	5.85911	-0.05
3	671.2272	4.49	C₃₆H₃₆N₂O₁₁	3.76	5.72727	-0.0499
4	311.1723	15.93	C₁₃H₂₈O₈	3.61	5.67179	-0.0493
5	631.1616	6.61	C₃₇H₂₈O₁₀	0.93	5.65196	-0.0488
6	645.1562	6.59	C₂₄H₃₀N₄O₁₇	4.4	5.49901	-0.0477
7	663.1206	5.79	C₂₉H₂₈O₁₈	0.47	5.20666	-0.045
8	632.0813	5.78	C₃₀H₁₅N₇O₁₀	0.86	5.18437	-0.0447
9	630.2005	0.82	C₃₆H₂₅N₉O₃	-0.38	5.06974	-0.0432
10	912.3928	6.09	C₃₆H₆₇NO₂₅	-0.15	5.00598	-0.0427
11	623.1953	7.95	C₂₉H₃₆O₁₅	-4.49	4.94388	-0.0424
12	607.2738	7.4	C₃₁H₄₄O₁₂	-3.63	4.90629	-0.0418
13	977.2807	7.33	C₅₉H₄₆O₁₄	-0.76	4.85611	0.0415
14	672.1742	6.59	C₂₃H₃₅N₃O₂₀	0.1	4.81385	-0.0419
15	638.3283	15.97	C₃₁H₄₉N₃O₁₁	-1.71	4.80725	-0.0413
16	839.215	4.6	C₅₁H₃₆O₁₂	1.88	4.79883	0.0409
17	807.2024	4.6	C₅₄H₃₂O₈	-0.1	4.78879	0.0406
18	645.1848	0.84	C₃₁H₃₄O₁₅	3.55	4.71028	-0.0402
19	711.2811	7.17	C₄₁H₄₄O₁₁	-0.04	4.68576	-0.0399
20	798.2809	0.64	C₃₁H₄₉N₃O₂₁	2.88	4.65335	-0.0397
21	693.2703	10.59	C₄₁H₄₂O₁₀	-0.39	4.56582	-0.0389
22	791.2367	7.18	C₄₄H₄₀O₁₄	2.71	4.51481	-0.0385
23	629.162	9.13	C₄₁H₂₆O₇	2.18	4.49283	-0.0389
24	642.1648	5.79	C₂₃H₂₉N₇O₁₅	-0.17	4.47681	-0.0387
25	632.2013	0.68	C₃₆H₃₁N₃O₈	-4.01	4.39239	-0.0374
26	749.2427	7.41	C₃₉H₄₂O₁₅	-3.24	4.31848	-0.0367
27	937.3198	9.24	C₄₀H₅₈O₂₅	0.36	4.25437	0.0366
28	891.2104	7.19	C₅₄H₃₆O₁₃	2.29	4.20534	-0.0358

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Table S13
附表13
附表13北碚447正离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S13The metabolites in Beibei 447 different from those in the other oranges in the positive ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	295.1139	0.61	C₁₀H₁₈N₂O₈	1.01	6.69156	0.0481
2	397.1972	2.57	C₁₉H₂₈N₂O₇	0.59	6.49125	-0.0494
3	376.0385	14.47	C₁₁H₅N₉O₇	0.03	6.39979	-0.0486
4	344.1341	0.82	C₁₅H₂₁NO₈	0.4	6.37944	0.0481
5	467.1757	5.23	C₁₉H₃₀O₁₃	-0.51	6.24184	-0.0472
6	314.16	0.67	C₁₅H₂₃NO₆	0.66	6.08265	0.0449
7	630.1704	6.52	C₁₆H₂₇N₁₁O₁₆	-0.91	5.95791	0.0442
8	259.093	0.61	C₁₀H₁₄N₂O₆	2.08	5.90446	0.0418
9	280.1396	0.68	C₁₁H₂₁NO₇	1.73	5.86563	0.046
10	250.0926	0.61	C₉H₁₅NO₇	1.97	5.67316	0.0436
11	343.1181	11.37	C₁₉H₁₈O₆	1.42	5.65719	0.049
12	343.1235	0.62	C₁₂H₂₂O₁₁	0.04	5.63347	0.0412
13	625.1756	3.68	C₂₈H₃₂O₁₆	-1.14	5.56201	0.0442
14	277.1032	0.61	C₁₀H₁₆N₂O₇	0.52	5.52767	0.0393
15	246.2439	10.35	C₁₄H₃₁NO₂	4.63	5.50768	0.0437
16	467.1888	2.33	C₁₉H₂₆N₆O₈	0.73	5.4848	-0.0412
17	415.2116	14.6	C₂₄H₃₀O₆	0.11	5.47673	0.0388
18	511.2018	4.22	C₂₁H₃₄O₁₄	-0.61	5.44497	-0.041
19	326.1236	0.82	C₁₅H₁₉NO₇	0.44	5.43213	0.0406
20	503.2101	9.35	C₁₇H₁₈N₂₀	1.04	5.42297	-0.0412
21	395.2038	6.69	C₁₈H₃₄O₉	0.14	5.34499	-0.0405
22	247.1336	5.39	C₁₅H₁₈O₃	3.12	5.34028	-0.0413
23	511.2012	3.97	C₂₁H₃₄O₁₄	-1.85	5.22583	-0.0391
24	362.3272	13.07	C₂₀H₄₃NO₄	2.06	5.22364	0.0415
25	698.1709	3.72	C₃₃H₃₁NO₁₆	-0.99	5.20769	-0.0396
26	359.1818	1.5	C₁₆H₂₆N₂O₇	1.51	5.17975	0.0388
27	419.1338	5.8	C₂₁H₂₂O₉	0.39	5.12756	-0.0389
28	481.2292	8.09	C₂₁H₃₆O₁₂	2.49	5.06653	-0.0385
29	368.1919	7.8	C₁₅H₂₉NO₉	1.18	5.03442	-0.0381

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Table S14
附表14
附表14北碚447负离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S14The metabolites in Beibei 447 different from those in the other oranges in the negative ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	515.1935	11.37	C₂₇H₃₂O₁₀	2.32	5.97178	0.0423
2	403.1622	4.25	C₁₈H₂₈O₁₀	3.04	5.80393	-0.0493
3	672.1742	6.59	C₂₁H₂₃N₁₇O₁₀	0.11	5.7658	0.05
4	369.1562	7.57	C₁₈H₂₆O₈	1.78	5.4549	-0.0465
5	635.2122	0.61	C₃₄H₃₆O₁₂	-1.93	5.30297	0.0486
6	439.22	6.69	C₁₉H₃₆O₁₁	3.51	5.29236	-0.0446
7	805.3407	7.72	C₃₉H₅₄N₂O₁₆	0.76	5.28646	-0.045
8	423.1894	3.38	C₁₈H₃₂O₁₁	1.21	5.24883	-0.0435
9	777.224	0.84	C₃₆H₄₂O₁₉	-0.97	5.2282	0.038
10	677.1654	6.51	C₃₈H₃₀O₁₂	-1.52	5.18954	0.0454
11	447.1521	3.41	C₁₉H₂₈O₁₂	2.79	5.179	-0.0441
12	461.0986	0.83	C₂₄H₁₈N₂O₈	-0.86	5.13205	0.0446
13	592.2076	0.61	C₂₁H₃₉NO₁₈	-3.08	5.12133	0.045
14	423.1867	3.16	C₁₈H₃₂O₁₁	-1.14	5.1065	-0.0423
15	411.1882	4.83	C₁₇H₃₂O₁₁	2.46	5.09322	-0.0432
16	726.378	9.72	C₃₀H₅₇N₅O₁₅	0.22	5.08957	0.0445
17	293.103	0.6	C₁₅H₁₈O₆	-0.28	5.08003	0.046
18	912.3932	6.09	C₃₈H₅₉N₉O₁₇	-2.61	5.00913	0.0435
19	435.1884	6.93	C₁₉H₃₂O₁₁	2.67	4.96371	-0.0419
20	707.1447	6.6	C₃₁H₃₂O₁₉	-2.59	4.91534	0.0432
21	439.2199	7.02	C₂₀H₃₂N₄O₇	0.13	4.84335	-0.0409
22	737.2304	0.67	C₃₄H₄₂O₁₈	0.71	4.69519	0.0386
23	721.2841	7.74	C₃₉H₄₆O₁₃	-3.44	4.59857	-0.0391
24	607.1652	6.17	C₂₈H₃₂O₁₅	-2.65	4.54279	0.0356
25	591.1913	3.63	C₂₅H₃₆O₁₆	-3.02	4.49702	-0.0388
26	604.1716	0.66	C₃₄H₂₇N₃O₈	-1.62	4.46073	0.0384

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Table S15
附表15
附表158045甜橙正离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S15The metabolites in 8045 Tiancheng different from those in the other oranges in the positive ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影VIP[1]	p[1]*
1	403.139	11.01	C₂₁H₂₂O₈	0.61	6.73686	-0.0492
2	373.3069	11.23	C₂₀H₄₀N₂O₄	2.16	6.30116	-0.048
3	274.275	12.72	C₁₆H₃₅NO₂	3.35	6.28815	-0.0487
4	303.0865	6.55	C₁₆H₁₄O₆	0.55	6.27881	-0.0469
5	767.2288	12.19	C₃₇H₃₈N₂O₁₆	-0.78	6.25069	-0.0487
6	470.1079	0.85	C₂₃H₁₉NO₁₀	-0.67	6.10187	0.0474
7	230.1396	0.94	C₁₁H₁₉NO₄	3.86	6.04968	-0.0466
8	675.2606	6.24	C₂₉H₄₂N₂O₁₆	-0.22	6.00949	0.0455
9	316.2852	14.6	C₁₈H₃₇NO₃	1.68	5.93551	-0.0453
10	379.2076	1.26	C₁₆H₃₀N₂O₈	0.34	5.92258	-0.0456
11	389.1236	12.31	C₂₀H₂₀O₈	1.23	5.65466	-0.0416
12	413.2129	0.5	C₁₆H₃₂N₂O₁₀	-0.25	5.64776	0.0452
13	409.1819	0.92	C₁₆H₂₈N₂O₁₀	0.61	5.56839	-0.0429
14	478.3372	14.18	C₂₄H₄₇NO₈	-0.49	5.41434	-0.0414
15	318.3009	12.91	C₁₈H₃₉NO₃	1.86	5.40105	-0.0414
16	393.2233	2.33	C₁₇H₃₂N₂O₈	0.33	5.27559	-0.0404
17	409.1966	3.28	C₂₀H₂₈N₂O₇	-0.88	5.25364	0.0409
18	925.2572	8.07	C₃₈H₄₀N₁₀O₁₈	-2.47	5.24354	-0.0406
19	412.1464	2.55	C₁₆H₂₁N₅O₈	0.29	5.19921	-0.0411
20	351.1764	1.21	C₁₄H₂₆N₂O₈	0.45	5.18822	-0.0401
21	328.1547	9.05	C₁₉H₂₁NO₄	1.09	5.1572	-0.0395
22	373.1284	10.54	C₂₀H₂₀O₇	0.59	5.11595	-0.0389
23	212.0209	9.63	C₉HN₅O₂	2.89	5.03473	-0.0389
24	339.0865	11.23	C₁₉H₁₄O₆	0.61	4.99968	-0.0384
25	704.1753	4.57	C₃₉H₂₉NO₁₂	-1.31	4.9968	0.0399
26	381.1866	0.82	C₁₅H₂₈N₂O₉	-0.39	4.96277	-0.0382
27	373.0925	11.83	C₁₉H₁₆O₈	1.92	4.95627	-0.0371
28	704.3953	10.59	C₃₃H₅₇N₃O₁₃	-1.61	4.92936	0.0363
29	668.2904	4.57	C₃₂H₄₅NO₁₄	-1.38	4.92244	0.0392
30	609.1809	6.17	C₂₈H₃₂O₁₅	-0.85	4.80608	-0.0368

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Table S16
附表16
附表168045甜橙负离子模式下区别于其他橙的代谢物
Table S16The metabolites in 8045 Tiancheng different from those in the other oranges in the negative ion mode

编号 Num	质荷比 m/z	保留时间 Retention time (min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error(ppm)	变量重要性投影 VIP[1]	p[1]*
1	741.2186	3.86	C₄₀H₃₈O₁₄	-0.32	6.29005	-0.0473
2	633.2525	8.09	C₃₂H₄₂O₁₃	-4.36	5.71453	0.0465
3	719.2464	6.2	C₂₄H₄₈O₂₄	0.12	5.68742	0.0488
4	845.2685	0.62	C₄₄H₄₆O₁₇	0.02	5.62835	-0.0495
5	403.1625	4.25	C₁₈H₂₈O₁₀	3.76	5.43379	0.0489
6	638.1961	0.93	C₂₅H₃₇NO₁₈	3.67	5.33017	-0.0473
7	813.237	5.31	C₃₉H₃₈N₆O₁₄	-0.42	5.29398	-0.0407
8	585.286	0.93	C₃₆H₄₂O₇	0.41	5.26986	-0.0465
9	485.1526	0.85	C₁₈H₃₀O₁₅	2.85	5.23309	-0.0481
10	429.1774	5.85	C₂₀H₃₀O₁₀	1.9	5.00869	0.0435
11	631.2203	5.41	C₃₅H₃₆O₁₁	2.9	4.95879	-0.0426
12	807.2041	4.6	C₅₄H₃₂O₈	3.44	4.93239	-0.0402
13	839.2141	4.6	C₃₆H₃₂N₁₂O₁₃	0.23	4.87234	-0.0396
14	205.04	0.68	C₁₃H₆N₂O	4	4.84622	-0.0419
15	733.1985	4.52	C₃₄H₃₈O₁₈	-0.05	4.84243	0.0432
16	795.1909	8.58	C₄₂H₃₆O₁₆	-2.67	4.77309	-0.0408
17	425.1837	5.39	C₂₁H₃₀O₉	4.68	4.75446	0.0431
18	563.1765	8.94	C₂₇H₃₂O₁₃	-0.91	4.7076	-0.0393
19	311.1721	15.93	C₁₃H₂₈O₈	3.07	4.68871	-0.0408
20	645.1566	6.59	C₂₉H₃₀N₂O₁₅	-1.15	4.55511	-0.039
21	777.2229	7.18	C₃₆H₄₂O₁₉	-2.33	4.47717	0.0373

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2.4 差异性代谢物的鉴定

根据保留时间、精确分子量、二级碎片、标准品以及数据库和相关文献信息,对上述筛选出的差异性代谢物进行鉴定。表2所示的是已经鉴定出的部分代谢物分别对应于各个橙品种。化合物5（RT=13.25 min）,化合物7（RT=6.41 min）,化合物11（RT=6.54 min）,化合物14（RT=12.15 min）,化合物15（RT=11.37 min）和化合物17（RT=10.54 min）的鉴定结果经过标准品比对确认（附图1—6）。其余11种化合物包括了类黄酮-C-糖苷、类黄酮-O-糖苷、多甲氧基黄酮和其他类型的3种化合物（对应的MS和MS/MS信息见附图7—17）。
Table 2
表2
表2部分差异性代谢物的鉴定信息
Table 2Elaboration of chemical formula and identification of some significant marker compounds in both negative and positive ion modes

编号 Num	质荷比 m/z	离子 ion	保留时间 RT^a(min)	分子式 Formula	质量误差 Mass error (ppm)	鉴定 Identification	橙品种 Orange
1	359.1127	[M+H]⁺	9.82	C₁₉H₁₈O₇	0.42	3-羟基-5,7,3',4'-四甲氧基黄酮 3-Hydroxy-5,7,3',4'-tetramethoxyflavone	XUEC
2	595.1649	[M+H]⁺	4.9	C₂₇H₃₀O₁₅	-1.44	木犀草素-7-O-新橙皮糖苷 Luteolin-7-O-neohesperidoside	XUEC
3	465.13843	[M+H]⁺	6.55	C₂₂H₂₄O₁₁	-1.53	橙皮素-7-O-葡萄糖苷 Hesperetin-7-O-glucoside	XIAC
4	741.221	[M+H]⁺	3.78	C₃₃H₄₀O₁₉	-3.59	野漆树苷-4'-O-葡萄糖苷 Rhoifolin 4'-O-glucoside	XIAC
5	373.1284	[M+H]⁺	13.25	C₂₀H₂₀O₇	0.54	橘皮素 Tangeretin^b	XIAC
6	443.1942	[M-H]^-	2.47	C₂₁H₃₂O₁₀	4.32	苯噻胺 Penstemide	XIAC
7	607.1657	[M-H]^-	6.41	C₂₈H₃₂O₁₅	-1.95	地奥司明 Diosmin^b	XIAC
8	359.1129	[M+H]⁺	12.92	C₁₉H₁₈O₇	1.01	5-羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮 5-Hydroxy-6,7,3',4'-tetramethoxyflavone	XF
9	515.22751	[M+H]⁺	7.2	C₂₈H₃₄O₉	-0.1	7α-柠檬苦醇醋酸酯 7α-Limonyl acetate	XF
10	625.17572	[M+H]⁺	3.68	C₂₈H₃₂O₁₆	-0.95	香叶木素6,8-二-C-葡萄糖苷 Diosmetin 6,8-di-C-glucoside	XF
11	611.1964	[M+H]⁺	6.54	C₂₈H₃₄O₁₅	-0.98	橙皮苷 Hesperidin^b	S26
12	461.10986	[M-H]^-	5.18	C₂₂H₂₂O₁₁	2	金雀花素/荭草素-4-甲基醚 Scoparin/Orientin 4-methyl ether	EG
13	633.25247	[M-H]^-	8.09	C₃₂H₄₂O₁₃	-4.41	奥巴叩酮17-O-β-D-葡萄糖苷 Obacunone 17-O-β-D-glucoside	EG
14	403.1395	[M+H]⁺	12.15	C₂₁H₂₂O₈	1.9	川陈皮素 Nobiletin^b	CY
15	343.1181	[M+H]⁺	11.37	C₁₉H₁₈O₆	1.42	5,6,7,4'-四甲氧基黄酮 5,6,7,4'-Tetramethoxyflavone^b	BB
16	741.21864	[M-H]^-	3.86	C₄₀H₃₈O₁₄	-0.32	芸香柚皮苷-4'-葡萄糖苷 Narirutin-4'-glucoside	8045
17	373.1284	[M+H]⁺	10.54	C₂₀H₂₀O₇	0.59	异橙黄酮 Isosinensetin^b	8045

^a 保留时间;^b经过标准品确认^a Retention time;^bConfirmed by standard

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附图1正离子模式下橘皮素标准品的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S1The MS^E spectra of tangeretin standard in the postitive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图2负离子模式下地奥司明标准品的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S2The MS^E spectra of diosmin standard in the negative ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图3负离子模式下橙皮苷标准品的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S3The MS^E spectra of hesperidin standard in the negative ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图4正离子模式下川陈皮素标准品的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S4The MS^E spectra of nobiletin standard in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
-->

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附图5正离子模式下5,6,7,4'-四甲氧基黄酮标准品的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S5The MS^E spectra of 5,6,7,4'-tetramethoxyflavone standard in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
-->

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附图6正离子模式下异橙黄酮标准品的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S6The MS^E spectra of isosinensetin standard in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图7正离子模式下3-羟基-5,7,3',4'-四甲氧基黄酮的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S7The MS^E spectra of 3-hydroxy-5,7,3',4'-tetramethoxyflavone in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图8负离子模式下木犀草素-7-O-新橙皮糖苷的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S8The MS^E spectra of luteolin-7-O-neohesperidoside in the negative ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图9正离子模式下橙皮素-7-O-葡萄糖苷的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S9The MS^E spectra of hesperetin-7-O-glucoside in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图10正离子模式下野漆树苷-4'-O-葡萄糖苷的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S10The MS^E spectra of rhoifolin 4'-O-glucoside in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图11负离子模式下苯噻胺的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S11The MS^E spectra of penstemide in the negative ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图12正离子模式下5-羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S12The MS^E spectra of 5-hydroxy-6,7,3',4'-tetramethoxyflavone in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图13正离子模式下7α-柠檬苦醇醋酸酯的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S13The MS^E spectra of 7α-limonyl acetate in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图14正离子模式下香叶木素6,8-di二-C-葡萄糖苷的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S14The MS^E spectra of diosmetin 6,8-di-C-glucosiden the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图15正离子模式下金雀花素的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S15The MS^E spectra of scoparin in the positive ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图16负离子模式下奥巴叩酮17-O-β-D-葡萄糖苷的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S16The MS^E spectra of obacunone 17-O-β-D-glucoside in the negative ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
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附图17负离子模式下芸香柚皮苷-4'-葡萄糖苷的MS^E图：（A）MS（B）MS/MS
-->Fig. S17The MS^E spectra of narirutin-4'-glucoside in the negative ion mode: (A) MS, (B) MS/MS
-->

据报道,类黄酮-C-糖苷中C-糖基化仅发生在类黄酮骨架中的C-6和C-8位^[25],且黄酮-6-C-糖苷比-8-C-糖苷更容易失水产生碎片[M-H-18]^-,该碎片通常可作为鉴定糖基化位点的依据。此外,类黄酮-C-糖苷容易优先发生糖基内部的断裂,产生[M+H-nH₂O]⁺和[M+H-CH₂O-2H₂O]⁺等常见的碎片。鹅蛋柑在保留时间为5.18 min处的代谢物[M-H]^-为m/z 461.10986,特征碎片离子m/z 341.0666（[(M-H)-C₄H₈O₄]^-）说明该化合物为C-糖基-类黄酮,碎片离子m/z 299.0537（Y₀^-）说明该苷元为含有3个羟基和1个甲氧基的黄酮。C环裂解产生的碎片m/z 209.0423（[^0,4A^--C₂H₄O₂]）和167.0332（[^0,4A^--C₃H₆O₃]）证明该黄酮的A环上带有两个羟基,而B+C环上带有一个羟基和一个甲氧基。通过搜索数据库SciFinder和ChemSpider查到两个化合物符合上述裂解规律,分别为金雀花素和荭草素-4-甲基醚,因此该化合物暂定为金雀花素或荭草素-4-甲基醚,但目前的信息不能完全确定其结构,这两种化合物在柑橘中都有报道^[26]。同理,将先锋橙在3.68 min出峰的化合物鉴定为香叶木素6,8-二-C-葡萄糖苷。
与类黄酮-C-糖苷不同的是,类黄酮-O-糖苷易发生糖基的丢失,据此可判断糖基的类型,如中性丢失308 Da是典型的O-二糖苷,而中性丢失470 Da则说明该化合物是O-三糖苷。以夏橙在6.55 min处出峰的化合物为例介绍类黄酮-O-糖苷的鉴定。该化合物在正离子模式下的准分子离子[M+H]⁺为m/z 465.1384,产生的碎片离子如下：303.0862（Y₀⁺）、153.0186（^1,3A₀⁺）、177.0548（[^0,4B⁺-H₂O]）、345.0964（^0,2X⁺）和369.0966（[^0,4X⁺-H₂O]）。其中苷元离子m/z 303.0862是丢失一个己糖162 Da产生的,说明该化合物是O-糖基黄烷酮,带有3个羟基和1个甲氧基。C环裂解产生的碎片153.0186和177.0548证明A环上有两个羟基取代,B环上有1个羟基1个甲氧基。据此,该化合物被鉴定为橙皮素-7-O-葡萄糖苷,在Citrus unshiu Marc.果实染病的果皮中也有检出^[27]。同理,化合物2、4、16被鉴定为类黄酮-O-糖苷,如表2所示。
多甲氧基黄酮通常会优先发生中性丢失,如nCH₃,然后是C环的断裂,取代基的分布可从C环裂解得到的碎片来判断。正离子模式下,先锋橙中保留时间为12.92 min出现的化合物,准分子离子峰[M+H]⁺为m/z 359.1129,产生一系列的碎片包括326.07742（[M+ H-CH₃-H₂O]⁺）、344.08696（[M+H-CH₃]⁺）、211.05952（^1,2A⁺）和163.07469（^1,3B⁺）。通过UNIFI软件匹配出最接近的分子式为C₁₉H₁₈O₇,减去黄酮的基本骨架结构C₁₅H₁₀O₂得到差值C₄H₈O₅,说明该化合物为多甲氧基黄酮,其中甲氧基的个数等于差值中C的个数4,而羟基的个数为差值中O的个数减去C的个数,即为1。然后通过C环裂解得到的碎片来判断甲氧基和羟基的取代位点,再通过搜索数据库SciFinder和ChemSpider,将该化合物暂定为5-羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮。与之类似,将血橙保留时间为9.82 min处出峰的化合物鉴定为3-羟基-5,7,3',4'-四甲氧基黄酮。
此外,夏橙在2.47 min出峰的化合物被鉴定为苯噻胺,其特征碎片为m/z 101.0250;先锋橙在7.2 min出峰的化合物是诺米林的同分异构体,正离子模式下特征碎片为161.0597、303.0857、487.2322和469.2217,鉴定为7α-柠檬苦醇醋酸酯;鹅蛋柑在8.09 min出峰的化合物也是一种类柠檬苦素,易发生中性丢失葡萄糖和CO₂,鉴定为奥巴叩酮17-O-β-D-葡萄糖苷,之前在柑橘种子中有检出^[28]。

3 讨论

WANG等^[29]基于LC-MS的非靶标代谢组学对62份柑橘资源不同组织部位的类黄酮多样性进行了系统的研究,但是该研究只分析检测了类黄酮这一类物质。STANDER等^[30]基于一种新的亲水作用液相色谱-质谱联用（LC-MS）方法对南非果汁进行了研究,其中包括了混合果汁和100%橙汁,研究表明柚皮苷和橙皮苷可以作为稳定的标志化合物用于果汁的掺假识别。JANDRIĆ等^[3]基于UPLC-QToF-MS和化学计量学对柑橘果实（橙、柚、葡萄柚和宽皮柑橘）、不同来源的橙以及不同类型的果汁进行了区分比较,该研究分析得到的化合物不限于类黄酮,初步鉴定出了对差异性有贡献的8种标志性化合物,例如柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷、诺米林-17-β-D- 吡喃葡糖苷、芸香柚皮苷和橙皮苷等,可以用于柑橘果实/果汁的真伪鉴别;同时,该课题组使用靶向和非靶向代谢组学对印度柑橘（宽皮柑橘、橙、葡萄柚）进行了真伪鉴别,并对特征的标志化合物进行了鉴定,最具影响的标志化合物有香风草甙、野漆树苷、异野漆树苷、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、柠檬苦素葡萄糖苷和维采宁-2^[20]。然而目前国内外的文献并没有基于LC-MS的非靶标代谢组学对我国特色橙品种在相同产地条件下进行差异性代谢产物的分析鉴定。橙品种繁多,风味品质和营养价值各不相同。与果肉和种子相比,果皮含有更丰富的次生代谢产物,因此,本文选择了相同产地的8个品种的橙果皮为研究对象。
从本研究结果可以看出,血橙、长叶橙和8045甜橙的代谢物差异性较大,而北碚447锦橙与夏橙的代谢产物接近。利用本文建立的方法筛选出每种橙区别于其他7种橙的特征代谢物共几百种（附表1—16）,因柑橘代谢产物数据库尚不完善,差异性代谢物的结构尚不能完全确定。目前,本文已完成了17种差异性代谢物的鉴定。其中通过标准品比对,确定了6种,分别是夏橙在保留时间为6.41 min出峰的地奥司明和13.25 min出峰的橘皮素,S26锦橙在6.54 min出峰的橙皮苷,长叶橙在12.15 min出峰的川陈皮素,北碚447锦橙在11.37 min出峰的5,6,7,4'-四甲氧基黄酮,8045甜橙在10.54 min出峰的异橙黄酮。另外的11种差异性代谢物根据保留时间、精确分子量、二级碎片以及数据库和相关文献信息进行了鉴定。与已有文献对柑橘种间果实/果汁的分析相比,本研究针对橙种内代谢的差异物进行了分析鉴定,对差异性有贡献的特征代谢标志物除了常规的类黄酮、柠檬苦素如橙皮苷、香叶木素6,8-二-C-葡萄糖苷和奥巴叩酮17-O-β-D-葡萄糖苷、7α-柠檬苦醇醋酸酯,还有6种多甲氧基类黄酮,包括3-羟基-5,7,3',4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、异橙黄酮、5-羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮、5,6,7,4'-四甲氧基黄酮和橘皮素。本文从代谢水平提供了鉴别橙果实及橙汁的依据。比如,8045甜橙和S26锦橙全果所榨橙汁的鉴别,可通过检测二者的次生代谢产物中有无异橙黄酮和橙皮苷,以及这两种差异性代谢物的相对含量来确定该橙汁是否掺假以及掺假的程度。若检出异橙黄酮,没检出橙皮苷,或者二者相对含量的比值大于1,说明该橙汁是8045甜橙的果汁;反之,则证明该橙汁来自S26锦橙。

4 结论

本文通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-QToF-MS）得到8种橙果皮的代谢产物指纹图谱,使用Progenesis QI软件结合主成分分析、偏最小二乘判别分析和变量变化趋势图等手段分析筛选出各品种对应的差异性代谢物,据此得到了区分/鉴别不同品种橙的代谢依据。目前仅鉴定出17种代谢标志物。其中木犀草素-7-O-新橙皮糖苷和3-羟基-5,7,3',4'-四甲氧基黄酮是血橙区别于其他7种橙的特征代谢物,橙皮苷是S26锦橙的代谢标志物,芸香柚皮苷-4'-葡萄糖苷和异橙黄酮可以作为8045甜橙的特征代谢物,而夏橙中鉴定出5种区别于其他橙的化合物,分别为橙皮素-7-O-葡萄糖苷、野漆树苷-4'-O-葡萄糖苷、橘皮素、苯噻胺和地奥司明。该研究方法和技术路线具有通用性,可拓展至不同水果、不同产地、不同成熟度等因素引起的代谢物差异分析,为柑橘及其他水果的代谢组学研究提供一定的借鉴。
The authors have declared that no competing interests exist.