0 引言
【研究意义】小麦的芒作为变态叶,具有一定的光合作用,是植物进化和适应自然环境的结果,也可以作为区分不同小麦品种和基因定位的重要形态标记[1]。在小麦灌浆后期,当旗叶已经开始衰老且其光合能力下降时,芒仍能保持较高的光合速率,其光合产物成为小麦籽粒同化物来源的重要补充[2-5]。芒的表层加厚、厚壁组织和疏导组织发达具有明显的抗旱性结构特征[2]。芒具有表皮坚硬倒钩状硅质毛,不利于害虫的飞落, 降低害虫在麦穗上产卵的机会, 具有一定的抗虫性。小麦芒对增产也具有重要意义,有芒的小麦品种通常可比无芒品种增产10%以上[6-7]。因此,对芒长性状进行定位分析,获取与性状紧密连锁或共分离的分子标记,可为分子育种提供依据。【前人研究进展】研究表明,芒性状属于数量性状,有4个主要的抑制基因（B1、B2、B3、Hd）和1个促芒基因A以及部分微效基因共同决定芒的发育,芒的抑制作用B1>B2>B3>Hd,Hd是引起勾芒产生的原因[5,8]。B1被定位在5AL的末端,与分子标记Xgwm291紧密连锁[5,9];LI等[10]利用硬粒小麦的双端体材料将B2定位于6BL-5和6BL-6缺失片段末端之间,与分子标记Xwmc539、Xgpw5130和Xwmc748邻近;SOURDILLE等[8]把Hd定位在4AS的Xfba78标记附近。近期,宫希等[11]研究发现,抑芒基因B1与5AL上的分子标记wpt-1038 紧密连锁,勾芒基因Hd与4AS上的标记Xgpw4448紧密连锁,且2个基因对芒长的抑制作用具有累加效应。SNP标记的密度远远高于传统分子标记的密度,对于数量性状的QTL定位更为高效、便捷[12-14]。另一方面,目前QTL定位多以双亲的衍生群体为材料来进行,此种方法难以将双亲中无多态性的关键基因位点检测出来[15-16];相比之下巢式关联作图群体（NAM）包含更多的亲本,基因位点的多态性更为丰富,因而具有更大的QTL检测功效,其结果更为可靠[16-18]。【本研究切入点】然而,目前尚未见到小麦芒性相关基因紧密连锁的SNP标记。【拟解决的关键问题】利用90K标记构建高密度连锁图谱和包含1个共同亲本的2个RIL群体对其芒长QTL进行定位分析,挖掘控制芒性状能够在多环境下检测到的主效QTL,为相关基因克隆和分子育种打下基础。1 材料与方法
1.1 材料以及田间种植
用3个优良品种（系）小偃81、周8425B和西农1376（简称XY81、Z8425B和XN1376）构建了小偃81/周8425B（简称XZ）、小偃81/西农1376（简称XX）的2个组合的F9﹕10代RIL群体,分别由102个和120个家系构成。3个亲本中,小偃81属于短芒材料,8425B和西农1376属于中长芒材料。将3个亲本及2个RIL群体于2016年10月至2017年6月在陕西杨凌（简称YL）、河南南阳（简称NY）和河南驻马店（简称ZMD）三地分别种植。完全随机区组设计,设2次重复,每株系种植2行,行长为2.0 m,行间距为0.25 m,株距6.7 cm,单粒播种。田间管理按照常规标准进行,生长期间无病虫害暴发。1.2 分子标记的检测
90K标记利用Illumina SNP Genotyping技术测试平台（北京博奥生物有限公司）,使用微珠芯片技术（Bead Array）进行检测,利用Genomestudio v1.0软件进行多态性分析。1.3 表型性状的测定及数据处理
小麦蜡熟期每个株系选4株,每株随机取3穗,每穗随机取2个侧芒,用游标卡尺测量长度,取平均值用于表型及遗传力分析。利用IciMapping的ANOVA功能进行田间数据分析及遗传力的估算。用基于完备区间作图模型IciMapping[19]的BIP功能对陕西杨凌、河南南阳和河南驻马店试验点3种环境下芒长的表型值分别进行QTL定位,并利用此软件的MET功能进行3种环境的联合分析以及QTL与环境互作分析[17,20-21]。在a=0.05显著水平下进行1 000次排列检验,确定芒长性状QTL的LOD阀值,采用正向-反向逐步回归法控制背景,步长设为1 cM。并依据STUBER等[22]提出的判别标准确定QTL作用方式。QTL的命名方法为群体大写缩写,加Q加性状缩写,加QTL所在的染色体,同一染色体上多个QTL用-1、-2、-3……来表示。例如Qal5A-1代表5A染色体上检测出来的第一个控制芒长的QTL。将在联合分析和单环境下都能够检测到,且单环境下表型贡献率>10%的QTL定义为“主效QTL”;将在3个环境中都检测到的QTL定义为“环境钝感QTL”[23]。
2 结果
2.1 表型数据分析
从表1和图1可以看出,2个群体的共同亲本XY81与另外2个亲本Z8425B、XN1376在芒的长度上存在较大差异。不同株系的目标性状差异大且2个群体的偏度绝对值<1,峰度绝对值>1,符合QTL作图条件,可用于QTL定位研究[24]。2个群体均出现了不同程度的超亲分离现象,且群体的遗传力较大,可以初步判断至少存在一个效应较强的控制位点。Table 1
表1
表1亲本及RIL家系的芒长表型统计分析
Table 1Statistic analysis of parent and RIL family for plant awn length
| 环境 Environment | 亲本Parent | 最小值 Min | 最大值 Max | 均值 Mean | 标准误 SE | 偏度 Skewness | 峰度 Kurtosis | 遗传力 Heritability | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| XY81 | Z8425B | ||||||||
| XZ群体 XZ population | |||||||||
| YL | 0.62 | 6.68 | 0 | 7.76 | 6.13 | 2.55 | 0.25 | -1.73 | 0.8703 |
| NY | 0.68 | 6.73 | 0 | 6.48 | 7.18 | 2.09 | 0.05 | -1.65 | |
| ZMD | 0.68 | 6.83 | 0 | 8.23 | 7.95 | 2.88 | 0.18 | -1.82 | |
| 环境 Environment | 亲本Parent | 最小值 Min | 最大值 Max | 均值 Mean | 标准误 SE | 偏度 Skewness | 峰度 Kurtosis | 遗传力 Heritability | |
| XY81 | XN1376 | ||||||||
| XX群体 XX population | |||||||||
| YL | 0.62 | 5.22 | 0 | 7.60 | 3.42 | 2.62 | 0.05 | -1.75 | 0.8519 |
| NY | 0.68 | 5.21 | 0 | 7.53 | 3.33 | 2.29 | 0 | -1.54 | |
| ZMD | 0.68 | 5.10 | 0 | 8.67 | 3.74 | 2.88 | -0.05 | -1.65 | |
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1周8425B、西农1376和小偃81的穗芒形态
-->Fig. 1Awn feature of Z8425B, XN1376 and XY81
-->
2.2 遗传图谱的构建
利用90K基因芯片81 587个标记对ZX和XX群体基因型进行多态性分析。小偃81和周8425B组配的XZ群体中亲本之间共筛选出11 037个多态性标记,利用IciMapping的bin功能对其进行冗余标记的删除,最终1 663个标记被连锁到图谱上,基因组全长为4 412.14 cM,平均图距2.65 cM,覆盖了小麦21条染色体组。分布于小麦A、B和D染色体组的标记数分别为735、790和138个,连锁长度分别为2 059.51、1 908.44和444.19 cM,平均图距最长的是2D染色体3.99 cM,平均图距最短的是4D染色体0.99 cM。小偃81和西农1376组配的XX群体中亲本之间共筛选出9 728个多态性标记,删除冗余后1 855个标记被连锁到图谱上,基因组全长为4 281.67 cM,平均图距2.31 cM,覆盖小麦21条染色体组。分布于小麦A、B和D染色体组的标记数分别为761、939和155个,连锁长度分别为1 836.14、1 961.39和484.14 cM,平均图距分别为2.41、2.09和3.12 cM。其中连锁图谱中5B染色体标记数目最多180个,4D染色体标记数目最少4个;5A染色体图距最长337.92 cM,2D染色体图距最短23.52 cM。平均图距最长的是3D染色体4.25 cM,平均图距最短的是3B染色体1.78 cM。2个图谱的比较分析可以看出（附表1）,90K的连锁标记数在小麦基因组A、B和D间分布不均衡,但均表现为B基因组的标记数>A基因组的标记数>D基因组的标记数。就2个连锁群之间公共标记而言,其中A染色体组公共标记最多,D染色体组公共标记最少。对于单条染色来说,3B染色体上公共标记最多86个;1B、2D、3D和4D染色体上没有共同标记。各个染色体上的标记数分布详情见附表1。
Table S1
附表1
附表1两个连锁图谱上SNP标记分布情况
Table S1Distributions of SNP in two linkage maps
| 染色体 Chromosome | XZ群体 XZ population | 公共标记 Common marker | XX群体 XX population | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 连锁群个数 Number of groups | 标记数目 Number of markers | 长度 Length (cM) | 平均间距 Average interval | 连锁群个数 Number of groups | 标记数目 Number of markers | 长度 Length (cM) | 平均间距 Average interval | ||
| 1A | 2 | 83 | 185.94 | 2.24 | 4 | 3 | 73 | 195.84 | 2.68 |
| 1B | 1 | 65 | 161.37 | 2.48 | 0 | 2 | 148 | 329.13 | 2.22 |
| 1D | 1 | 23 | 80.00 | 3.48 | 4 | 3 | 21 | 67.48 | 3.21 |
| 2A | 2 | 79 | 233.96 | 2.96 | 6 | 4 | 90 | 227.20 | 2.52 |
| 2B | 2 | 171 | 417.33 | 2.44 | 14 | 4 | 135 | 288.74 | 2.14 |
| 2D | 2 | 23 | 91.75 | 3.99 | 0 | 3 | 37 | 89.41 | 2.42 |
| 3A | 3 | 111 | 416.07 | 3.75 | 87 | 1 | 152 | 334.00 | 2.2 |
| 3B | 1 | 121 | 126.25 | 1.04 | 20 | 2 | 152 | 270.01 | 1.78 |
| 3D | 1 | 5 | 5.82 | 1.16 | 0 | 2 | 16 | 68.07 | 4.25 |
| 4A | 2 | 99 | 248.16 | 2.51 | 19 | 2 | 78 | 241.54 | 3.10 |
| 4B | 2 | 99 | 236.00 | 2.38 | 11 | 1 | 107 | 203.69 | 1.90 |
| 4D | 1 | 4 | 3.59 | 0.90 | 0 | 1 | 10 | 23.54 | 2.35 |
| 5A | 3 | 112 | 320.62 | 2.86 | 8 | 3 | 129 | 337.92 | 2.62 |
| 5B | 3 | 119 | 299.68 | 2.52 | 5 | 3 | 180 | 318.84 | 1.77 |
| 5D | 1 | 11 | 38.02 | 3.46 | 1 | 2 | 31 | 86.58 | 2.79 |
| 6A | 2 | 96 | 287.49 | 2.99 | 4 | 4 | 69 | 183.84 | 2.66 |
| 6B | 2 | 102 | 335.34 | 3.29 | 16 | 1 | 124 | 267.88 | 2.16 |
| 6D | 4 | 42 | 126.41 | 3.01 | 3 | 3 | 29 | 100.95 | 3.48 |
| 7A | 4 | 155 | 367.27 | 2.37 | 36 | 3 | 170 | 315.80 | 1.86 |
| 7B | 3 | 113 | 332.47 | 2.94 | 19 | 2 | 93 | 283.10 | 3.04 |
| 7D | 3 | 30 | 98.60 | 3.29 | 3 | 1 | 11 | 48.11 | 4.37 |
| A | 18 | 735 | 2059.51 | 2.80 | 164 | 20 | 761 | 1836.14 | 2.41 |
| B | 14 | 790 | 1908.44 | 2.42 | 85 | 15 | 939 | 1961.39 | 2.09 |
| D | 13 | 138 | 444.19 | 3.22 | 11 | 15 | 155 | 484.14 | 3.12 |
| 总计Total | 45 | 1663 | 4412.14 | 2.65 | 260 | 50 | 1855 | 4281.67 | 2.31 |
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2.3 芒长QTL定位结果分析
2.3.1 芒长QTL定位 2个群体共检测到6个控制芒长的QTL,位于5A、1B、3B、6B和2D染色体上（表2）。其中1个主效的QTL位点Qal5A-1,在2个群体3种环境下都能被检测到,属于环境钝感QTL,加性效应来源于父本小偃81,对芒长具有非常强的抑制作用,此位点被定位在5A染色体的末端,且在置信区间内有一个共同的分子标记RAC875_c8121_1147,ZX群体定位的Qal5A-1与分子标记RAC875_ c8121_1147的遗传距离仅为1.28 cM,表型变异的贡献率为78.52%,可降低芒长效应值2.2 cm。XX群体定位的Qal5A-1与分子标记RAC875_ c8121_1147的遗传距离仅为0.13 cM,表型变异的贡献率为48.99%,可降低芒长效应值1.8 cm,详情见表2和图2。1个微效的QTL位点Qal6B-1（MET）加性效应来源于母本周8425B,表型变异的贡献率为1.39%,单个QTL可以增加芒长效应值0.27 cm;4个微效的QTL位点Qal1B-1（MET）、Qal3B-1（MET）、Qal2D-1（ZMD）和Qal2D-2（NY和MET）加性效应来源于母本周西农1376,分别可解释表型变异的3.66%、3.93%、5.53%和3.51%,可增加芒长效应值0.45—0.72 cm。XZ群体检测的2个QTL位点,其中1个主效位点Qal5A-1,1个微效QTL位点Qal6B-1,2个QTL表型变异的贡献率总和为79.91%,略小于该群体芒长的遗传力87.03%。XX群体检测出5个QTL位点,1个主效位点Qal5A-1和4个微效位点Qal1B-1、Qal3B-1、Qal2D-1、Qal2D-2,5个QTL位点表型变异的贡献率总和为63.96%,小于该群体芒长的遗传力85.19%。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2两个群体不同环境下小麦芒长的QTL分布 a：XZ群体XZ population;b：XX群体XX population。黑色、红色、绿色和蓝色分别代表杨凌、南阳、驻马店和多环境Black, red, green and blue represent Yangling, Nanyang, Zhumadian and multi-environment, respectively
-->Fig. 2QTL distribution of wheat awn length detected in two populations in different environments
-->
Table 2
表2
表2不同环境下定位到影响小麦芒长的QTL
Table 2Location of QTL affecting wheat awn length in different environments
| 环境 Environment | 位点 QTL | 位置 Position | 标记区间 Marker interval | 范围 Range | LOD | 表型贡献率 Phenotypic variance explained (PVE, %) | 加性效应 ADD |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| XZ群体 XZ population | |||||||
| YL | Qal5A-1 | 77 | RAC875_c8121_1147- Excalibur_c27357_146 | 76.5-77.5 | 42.36 | 75.49 | -2.49 |
| NY | Qal5A-1 | 76 | RAC875_c8121_1147- Excalibur_c27357_146 | 74.5-77.5 | 40.26 | 78.64 | -1.84 |
| ZMD | Qal5A-1 | 77 | RAC875_c8121_1147- Excalibur_c27357_146 | 76.6-77.5 | 48.63 | 79.82 | -2.71 |
| MET | Qal6B-1 | 82 | Tdurum_contig14046_364- wsnp_Ex_c1267_2431315 | 80.5-82.5 | 6.05 | 1.39 | 1.14 |
| Qal5A-1 | 77 | RAC875_c8121_1147- Excalibur_c27357_146 | 76.6-77.5 | 112.16 | 80.14 | 78.56 | |
| XX群体 XX population | |||||||
| YL | Qal5A-1 | 75 | BS00011816_51- BobWhite_c8266_227 | 73.2-76.2 | 18.76 | 50.70 | -1.91 |
| NY | Qal5A-1 | 74 | BobWhite_c8266_227- RAC875_c8121_1147 | 73.7-76.2 | 18.11 | 46.01 | -1.58 |
| Qal2D-2 | 23 | JD_c63957_1176- BS00068139_51 | 17.5-28.5 | 4.10 | 9.63 | 0.72 | |
| ZMD | Qal5A-1 | 74 | BobWhite_c8266_227- RAC875_c8121_1147 | 73.7-76.2 | 20.29 | 47.41 | -2.07 |
| Qal2D-1 | 15 | GENE-0641_239- BobWhite_rep_c63957_1472 | 8.5-15.5 | 3.18 | 5.53 | 0.71 | |
| MET | Qal1B-1 | 46 | BobWhite_rep_c54139_273- IACX4411 | 44.5-48.5 | 6.31 | 3.66 | 0.50 |
| Qal5A-1 | 74 | BobWhite_c8266_227- RAC875_c8121_1147 | 73.7-76.2 | 56.85 | 51.71 | -1.84 | |
| Qal3B-1 | 6 | BobWhite_c2069_1096- Tdurum_contig11192_373 | 4.5-7.5 | 6.72 | 3.93 | 0.51 | |
| Qal2D-2 | 23 | JD_c63957_1176- BS00068139_5 | 18.5-27.5 | 5.79 | 3.51 | 0.45 | |
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2.3.2 芒长QTL与环境互作分析 从表2的第2、3列来看,单个环境检测出来的QTL,除环境ZMD中Qal2D-1外,其余的都能在联合分析中被鉴定出来,有3个（即Qal6B-1、Qal1B-1和Qal3B-1）未在单环境中检测出。此外,由于随机误差的存在,同一个QTL在单环境的位置估计也不尽相同,XX群体的Qal5A-1位点利用杨凌的表型数据被定位在5A染色体的75 cM处,置信区间为73.2—76.2 cM,其他3种情况（NY、ZMD和MET）被定位在5A染色体的74 cM处,置信区间为73.7—76.2 cM,联合分析利用了更多的表型数据,得到的74 cM可能更接近于真实的位置。从表3的加性遗传效应来看,联合分析得到的6个QTL,加性遗传效应值的大小近似相同,说明这些QTL在3个环境间有着稳定的遗传效应。从表3的最后3列给出的加性与环境的互作效应来看,互作效应都远低于平均加性效应,说明QTL与环境间的互作不是影响芒长性状的主要因素。
Table 3
表3
表3QTL与环境互作分析检测到芒性状QTL的位置和遗传效应
Table 3Analysis of interaction between QTL and environment detected the awn character QTL location and genetic effect
| 位点 QTL | 位置 Position | LOD | 加性遗传效应 Additive genetic effect | 平均加性效应 Average additive effect | 加性与环境互作效应 Addition and environment interaction effect | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| YL | NY | ZMD | YL | NY | ZMD | |||||||
| XZ群体 XZ population | ||||||||||||
| Qal6B-1 | 82 | 6.05 | 0.27 | 0.27 | 0.27 | 0.27 | 0.03 | 0.14 | -0.17 | |||
| Qal5A-1 | 77 | 112.16 | -2.19 | -2.21 | -2.21 | -2.20 | -0.10 | 0.42 | -0.32 | |||
| XX群体 XX population | ||||||||||||
| Qal1B-1 | 90 | 6.31 | 0.48 | 0.5 | 0.47 | 0.49 | 0.04 | -0.08 | 0.04 | |||
| Qal5A-2 | 5 | 56.85 | -1.82 | -1.84 | -1.83 | -1.83 | -0.03 | 0.26 | -0.23 | |||
| Qal3B-1 | 6 | 6.72 | 0.49 | 0.51 | 0.52 | 0.50 | 0.03 | -0.07 | 0.05 | |||
| Qal2D-2 | 23 | 5.79 | 0.43 | 0.43 | 0.44 | 0.43 | 0.05 | 0.18 | -0.23 | |||
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3 讨论
3.1 连锁图谱对QTL定位的影响
本研究从XZ和XX 2个RIL群体中得到的连锁图谱,分别含有1 663和1 885个多态性SNP标记,标记间的平均图距分别为2.65和2.31 cM。同传统的RFLP、SSR标记构建的连锁图谱相比,本研究中用90K标记所构建的标记数目远高于其他研究。通过增加标记数目,提高连锁图谱的标记密度,缩小平均图距,增加了QTL检测精度,使在其他标记图谱的大间隔区段检测QTL成为可能。2个连锁图谱存在的共同问题是染色体组间标记数目分布不均衡,可能有以下2种原因,一是由于小麦基因组非常庞大且具有80%以上DNA重复序列[25-26],构建图谱误差较大,存在大量间隙;二是因为小麦的进化过程中,并没有形成含有D染色体组的四倍体小麦,减少D染色体组之间的基因交流,致使D染色体组相对其他染色体组具有较高的保守性[26-28]。3.2 群体类型对芒长QTL定位影响
QTL定位过程中,所构建的定位群体的类型及大小对定位的结果及QTL的作用方式都有较大的影响。目前用于QTL定位研究的群体主要有DH群体、F2群体、BC群体、RIL群体等。RIL群体通过多代自交,染色体间的重组概率显著提高,连锁基因的交换更为充分,染色体上相邻的不同QTL位点更容易分解开,有利于基因型与环境互作和QTL定位分析研究[23]。BUCKLER等[17]用25个自交系与B73构建了巢式关联作图群体（NAM）,进行开花期QTL分析,认为NAM群体比单个的作图群体有更大的检测QTL功效,检测结果更可靠。受研究规模制约,本研究使用1个共同的父本小偃81与另外2个不同来源的母本周8425B和西农1376构建RIL群体用于芒长QTL检测。在2个群体共同检测到的1个主效的QTL,即Qal5A-1在不同的环境下都能被识别出,属于环境钝感QTL,具有非常高的遗传稳定性。遗憾的是Qal5A-1对于不同群体的表型变异的贡献率不同,可能是因为2个群体的遗传背景不同导致的。另外这一主效位点被定位在5A染色体长臂上的末端,对芒长具有非常强的抑制作用,该位点的效应极有可能源于强抑芒基因B1。与前人的定位结果相比较,ZX群体定位的Qal5A-1与分子标记RAC875_c8121_1147的遗传距离仅为1.28 cM,XX群体定位的Qal5A-1与分子标记RAC875_c8121_1147的遗传距离仅为0.13 cM,远远高于杜斌等定位的精确度[5,9,11]。LI等[10]把抑芒基因B2定位在6B染色体上,本研究的Qal6B-1位点对芒长的效应值具有促进作用,两位点不属于同一位点。另外5个微效的QTL位点,即Qal6B-1、Qal1B-1、Qal3B-1、Qal2D-1和Qal2D-2,它们的表型变异的贡献率分别为1.39%、3.66%、3.93%、5.53%和3.51%,推测可能是新的QTL位点。2个群体的家系都出现了不同程度的超亲分离,对于极短芒或无芒家系形成原因,可能为基因互作引起的,导致极短芒或无芒家系形成。4 结论
2个群体检测到1个主效位点Qal5A-1,此位点被定位在5A染色体末端,与分子标记RAC875_ c8121_1147紧密连锁,对芒长具有强烈的抑制作用,表型变异的解释率高,遗传稳定性强,属于环境钝感QTL,可以针对芒长性状构建近等基因系和精细定位。（责任编辑 岳梅）
The authors have declared that no competing interests exist.
