苹果矮化密植栽培是世界苹果生产先进国家普遍采用的栽培模式,也是中国现代苹果生产的发展趋势。生产上主要通过矮化砧木和矮化品种来实现果树的矮化密植栽培。部分发达国家矮化苹果面积已占苹果栽培总面积的90%以上。而中国矮化栽培尚处于起步阶段,矮化栽培占苹果栽培面积的比例不足5%,中国矮化密植栽培模式推广缓慢的原因是核心技术掌握不够,生产条件尚不具备及缺乏优良的矮化种质资源等。
树形是果树重要的农艺性状,对于果园的定植密度、机械采收、优质高产以及果树修剪都有至关重要的作用。柱型苹果是一种特殊的矮生突变体,其特异的树形特别适于高度密植栽培模式,是实现矮化密植栽培的重要资源,也是选育苹果矮化新品种的优良种质资源。自柱型苹果产生以来,其独特树形生长特性一直是育种者研究的热点和难点,各国研究者试图从遗传、生理、细胞和分子等方面揭示其独特树形生长特性的机理,为将来筛选培育优异柱型苹果新品种提供重要的理论依据和技术保障。
1 柱型苹果的来源及其生物学特性
1.1 柱型苹果的来源及遗传育种
柱型苹果是1961年加拿大种植者在‘旭’苹果品种上发现的芽变突变体,是自发的体细胞突变 [1-3],为了纪念发现者,这个突变体后来被命名为‘威赛克旭’。由于该突变体生长特别紧凑,主干直立粗壮,节间短,分枝少,萌芽率高,产生短果枝,因其树形类似直立的支柱,而称为柱型苹果（Columnar apple）。因其树姿紧凑挺立,犹如跳芭蕾舞的美女,又称芭蕾苹果（Ballerina apple）。自1970年以来,英国东茂林国际园艺研究所用‘威赛克旭’与普通栽培品种进行杂交,育出 ‘Telamon’‘Tuscan’‘Trajan’‘Maypole’‘Charlotte’等一系列柱型苹果品种。之后,塞尔维亚、俄罗斯、德国等也相继开展柱型苹果育种工作[4-5]。德国获得了5个柱型品种‘Pomgold’‘Pompink’‘Pomforyou’‘Pomfit’和‘Pomfital’,罗马尼亚获得了2个抗黑星病的柱型苹果品种‘Nicol’和‘Colmar’。中国柱型苹果的引种和育种研究始于20世纪90年代[6-7]。青岛农业大学已成功选育出‘鲁加’系列柱型苹果新品种[8-9]。中国农业大学已选育出‘金蕾1号’和‘金蕾2号’两个柱型苹果新品种[10]。
经典遗传学研究证明,苹果的柱形性状是由显性基因Co控制的质量性状。柱型苹果与普通型苹果品种杂交,杂交后代通常小于50%的植株表现柱型特征[11-15],这可能是由于修饰基因的影响。商业上选择利用的柱型苹果为Co的杂合体[16],两个柱型苹果杂交产生的子代中柱型苹果最多为75%[17-18]。杂交子代中柱型苹果数量的不足可能是由Co或与花粉活力、种子和实生苗萌发相联系的基因的负面影响[18]。采用嫁接措施会减少F1子代群体中柱型苹果的数量[19],柱型植株数量的减少是嫁接过程中或嫁接后短时间内造成的缺失,当用矮化砧木M9时,这种现象更突出。
控制苹果柱形生长的Co基因位点与枝干高度、生长速率、节间长度、分枝数目、分枝长度等QTL连锁成簇[20]。与树形相关的QTL连锁群定位在第10号染色体的Co区域。1—3年树龄苹果的节间数量、茎基部直径的生长量、枝条数量、节间长度都与Co有关[21]。苹果的表型特征比如总生长量的增量,总枝量、枝的长度、节间长度,主干生长速率和主干高度增产量相关的QTL连锁群均定位在第10号染色体上[13]。相对于枝条的数量,Co对枝条长度的影响更强些,这可能是单一基因多效性的作用。另外,Co位点与叶片的单叶重、叶片厚度、叶片形状、叶柄长度等QTL也连锁[22]。
苹果的树形特征位点和果实品质性状（果肉重、果肉维生素C含量、可溶性糖、硬度和酸度）连锁群定位在第10号染色体的Co区域[23-24]。第10号染色体上特定区域可能控制苹果生长和发育的许多方面,同时具有多效性,影响着果实的品质。Co可能与果实品质差紧密连锁[25],试图通过常规育种打破这种连锁获得高品质的柱型苹果不太可能,只有通过分子育种手段才能获得品质优良的柱型苹果。
1.2 柱型苹果生长与结果特性
柱型苹果生长特性为自然单干型,主干粗壮直立,不需要支撑物,可通过修剪控制其植株高度。主干上着生大量的短枝,节间短,开花早,定植后2—3年开花,生命周期一般20年,是实施矮化密植栽培的优良资源,也是观赏园林的优良树种[12,26]。苹果种子萌发后2周到2个月,其柱型生长特性就能被识别[18,27],但是早期的鉴定往往不准确。真正可靠的表型鉴定一般需要2—3年后[19,28]。苹果表型的分类比较困难,主要原因是缺乏一个清晰明了的分类标准,并且存在不同的生长类型和中间类型[4,19,25,29-30]。
柱型苹果花期多在4月中下旬,花量很大,花冠白色或浅粉红色,花期20 d左右,开花的物候期与生产上的主栽品种‘红富士’‘嘎拉’等相近,因此,生产上可以互为授粉树[7]。另外,柱型苹果树之间也可相互授粉。嫁接时使用的砧木也能影响柱型苹果的成花率,一般而言,砧木的矮化势越强,柱型苹果的成花率越高[31]。柱型苹果为短果枝结果,坐果率高,平均每个花序坐果数最少2—3个,果实成熟期较早,为中熟品种。由于树体较小,单株产量低,但果园总体产量很高,这主要靠所有植株的整体产量。
柱型苹果的生长发育状况受砧木影响。不同的砧木能影响其高度、干径和枝量。矮化砧木M9能有效的控制柱型苹果的高度和枝量[32]。当使用西府海棠或M7为砧木时,柱型苹果的新梢与中干的夹角较小,围绕中干直立生长。当使用M26或M9矮化中间砧时,柱型苹果很少产生侧生新梢[31]。生产上一般用M26和M9中间砧控制侧生新梢的产生和树体高度,促进成花和提早结果。
柱型苹果的抗寒性和抗旱性较强,这可能与其起源加拿大有关[33],也可能和其叶片上表皮细胞表面褶皱、气孔密度高、叶片背面富含大量的表皮毛有关[34]。
柱型苹果根茎叶的解剖结构与普通型苹果存在差异。柱型苹果叶片颜色深绿,叶片厚、边缘有锯齿[11,35-36],叶片的解剖结构与树体的生长势密切相关[6,37]。柱型苹果的总叶面积高于普通型苹果[38],叶片总厚度、栅栏组织厚度显著高于普通型苹果,每一层内的栅栏组织细胞大小不等,细胞排列相对杂乱,各层细胞之间相互交错,层与层之间分界线不明显[34,38-40]。柱型苹果上表皮细胞表面的褶皱明显多于普通型苹果,表皮细胞隆起的高度较高,气孔密度显著高于普通型[34]。柱型苹果根和茎的木质部导管直径和导管数量均高于普通型苹果。另外,柱型苹果叶片、根、茎微观结构的特征导致其具有较高的净光合速率和蒸腾速率,产生大量的糖化合物,这也可能是其具有高产特性的主要原因[38]。
1.3 柱型苹果内源激素特性
1.3.1 生长素 与普通型苹果相比,柱型苹果具有很强的顶端优势,因而生长素IAA的含量是重点研究对象。柱型苹果春梢、夏梢和秋梢中总的IAA含量与普通型苹果的无明显差异[40]。而王茂兴[41]发现柱型苹果早春梢尖内具有较高的IAA。植物中IAA存在形式有自由态和结合态两种。枝条顶端自由态IAA的含量与果树树体的紧凑程度呈正相关。柱型苹果腋芽中自由态IAA/总IAA明显高于普通型苹果,这是因为其结合态IAA的含量低[42]。WATANABE等[43-45]发现柱型苹果和普通型苹果侧枝（前一年修剪口下形成的枝条）中总的IAA含量没有明显差异,但柱型苹果中心枝IAA含量明显高于侧枝,并且柱型苹果侧枝中总的IAA含量明显高于普通型苹果1—2年生侧枝中的IAA含量。由于不同的树龄、取样样本数的多少、取样时期的不同等因素均能导致IAA含量存在严重差异,因此,在今后的研究中,加大取样样本量、同一树龄、取样时期的一致性等都是研究者应该关注的问题。另外,IAA的绝对含量可能并非影响其生长的主要因素,其在树体内的移动也应该是今后的研究方向。1.3.2 细胞分裂素 细胞分裂素（CTK）的浓度与苹果芽的萌发密切相关。整个年生长周期,柱型苹果顶芽和侧芽中的玉米素类物质明显高于普通型苹果[42-44],这也是柱型苹果多发短枝的原因。柱型苹果中异戊烯腺苷与总细胞分裂素的比值在11月达到最高值,而普通型苹果却是在7月,这可能与冬季休眠启动时间早晚有关[45]。柱型和普通型苹果组培苗经6-BA处理后,CTK含量均上升,但柱型苹果CTK含量上升幅度最小。普通型苹果CTK含量上升后依旧低于柱型苹果,由此推断高CTK含量是柱型苹果特殊生长习性的原因之一[46]。大田和离体培养条件下,侧芽的诱导伸长、数量和培养物重量的增加与外源细胞分裂素浓度呈正相关[47]。离体培养条件下,柱型苹果叶片在高浓度的细胞分裂素上生长良好,而普通型苹果叶片在低浓度的细胞分裂素上生长良好[36,47],柱型苹果芽的分化再生需要更高的细胞分裂素[48],这可能是柱型苹果能代谢过量的细胞分裂素或者通过调节其他生长因子抵消[47]。
1.3.3 赤霉素 柱型苹果生长矮小,叶片深绿的特征类似于GA缺陷型突变体的生长特点[49-52]。目前,人们已经从玉米、豌豆、番茄、拟南芥等植物中发现了50多种不同的GA缺陷型突变体[53],研究发现均是赤霉素合成受阻造成其含量下降。柱型苹果内源赤霉素水平的确低于普通型苹果[41-42]。大田和组培条件下,外源喷施GA3均能促进柱型苹果新梢的伸长生长,且与普通型和短枝型苹果相比,柱型苹果的GAs含量上升幅度最大[40,46],进一步验证了柱型品种内源激素组成的特殊性,即GA3含量很低。通过外源喷施GA3能促进柱型苹果的生长增加,但是达不到普通型苹果的高度[42]。柱型苹果实生苗的茎尖提取物能促进矮化豌豆的生长,但促进生长的程度不及普通型苹果茎尖提取物的影响,这表明柱型苹果含有较低水平的活性GA。柱型苹果矮化生长的特性与其说是可能与低水平的GA含量相关,倒不如说柱型苹果的紧凑矮化生长只是一种表型特征。
GA信号传导途径的抑制因子DELLA蛋白因其N端有高度保守的结构域DELLA而被命名[54]。模式植物拟南芥中DELLA蛋白是多基因家族,有GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3,其中GAI和RGA是茎伸长的主要负调控因子[55-57]。拟南芥、葡萄、水稻等植物中编码DELLA结构域的GAI发生缺失、突变或超量表达均能导致植物表型发生改变,表现矮化特征[58-61]。DELLA蛋白可能参与多种激素的信号途径,同时DELLA蛋白的量又受到赤霉素、生长素、乙烯和脱落酸等多种激素的共同调节[62-67]。柱型苹果中,赤霉素合成途径中贝壳杉烯氧化酶基因的表达量低于普通型苹果,柱型苹果茎尖中的MdGAI相对表达量均高于3个普通型苹果。柱型苹果GAI的表达量高可能抑制了植株的生长,也可能是对外界环境更加适应的表现[68]。植物体内的DELLA蛋白含量越多,对逆境的适应性越强,高盐环境下,植物通过增加DELLA蛋白的含量,进而增强DELLA蛋白对植物生长的抑制作用[65]。
1.3.4 脱落酸 树体内高ABA含量与树体矮化有很大的相关性,矮化的苹果树比乔化树中ABA含量高。与普通型苹果相比,柱型苹果的果台芽相对更大,虽然其总ABA含量更高,但每单位鲜重中含有较少自由态和结合态的ABA[42]。通常,每单位鲜重中ABA含量越高越能加速芽的伸长生长[69],因此,较低水平的ABA可能是减缓短果枝生长的结果,而不是原因[42]。在柱型苹果与非柱型苹果杂交获得的种子和早期实生苗子代中,不同品种中ABA和GA的含量是相似的,这暗示后期发育过程中,激素的差异导致实生苗形成紧凑生长的特征[70]。
综合考虑上述原因,柱型苹果在激素水平上存在的差异是很微妙的,它们和表型的相关性仅仅被当作一种假设。一、由于芽中IAA含量高和IAA/CTK比率低,柱型苹果的顶端优势比普通型强,因而它们不能产生长的侧枝。二、由于CTK含量高,结合ABA含量低,产生结果短枝,这有助于芽的萌发,但是阻碍了伸长生长,只是少量短枝在有时候（比如中央领导干被破坏）能克服顶端优势而生长。三、低水平的GA可能阻碍伸长生长,这和许多柱型苹果具有矮化作用相关。
目前测定植物激素浓度的方法均比较繁琐和困难,而植物的年龄、季节和环境因子等均能影响其内源激素的含量,因此,样品本身的差异和外界环境因素均可能影响其内源激素水平的差异。另外,到底是因为植物内源激素水平含量的变化导致树体生长特性改变,还是因为树体生长特性的改变而导致植物激素水平的含量差异,关于二者之间的直接关联报道还很少见。
2 苹果柱型性状基因Co定位和候选基因挖掘
2.1 Co定位
苹果柱型性状为显性单基因（Co）控制的质量性状[71]。在苹果基因组序列公布之前[72],各国研究者用分子标记的方法将Co定位于第10号染色体17.0—19.5 cM[13-14,16,29-30,73-74]。最早进行柱型苹果分子标记研究的是美国康奈尔大学[75]。随后,各国****用RAPD、SSR、AFLP和SCAR等方法对柱型性状进行标记,或将AFLP转换成SCAR或将RAPD转换成SCAR对柱型性状进行标记[13,21,30,76-77]。由于使用的苹果品种和个体数量存在差异,Co标记的重组频率和遗传距离不同[14,16,73,78-79]。虽然Co的遗传距离不同,但它们的序列排列大体相同[14,16,30,74]。但是,通过苹果基因组的BLAST发现,CH02a10和SCB82670序列图谱定位在第3号染色体上,约30 Mb。KIM等[30]用柱型苹果的父本（非柱型苹果）扩增获得SCB82670片段,因此它不可能与Co连锁[14,16,78]。而CH02a10共分离的原因仍不清楚,暗示着对柱型苹果发育发挥重要作用的关键基因被选择性清除,或者基因序列可能错误的安排在第3号染色体上[30]。2010年金冠苹果基因组序列公布以来,加速了Co的精细作图。目前已经将其定位在第10号染色体上18.52—19.09 Mb（表1）。BAI等[15]界定的Co区域包含20个已经注释的16基因和7个预测基因,其中3个编码拟南芥侧枝器官边界的转录因子同源序列[83],被认为是最有可能的Co候选基因[15]。MORIYA等[14]通过SSR将Co界定的大小与BAI等[15]描述的大小相似[15]。BALDI等[19]认为Co区域有36个潜在的基因,若干基因（basic helix-loop-helix andAP2/ERF classes,MYB）编码转录因子,它们在树形调节方面发挥作用。目标区域和MORIYA等[14]认定的区域有重叠,但是不覆盖BAI等[15]预测的染色体位置。OKADA[82]参考苹果基因组序列,Co的精细图缩小在101 kb区域,研究结果与BALDI[19]报道的相一致,与BAI等[15]报道的结果不同。Co区域边界位置不同的原因可能是：不同研究小组采用了不同的苹果基因型,这可能产生完全不同的重组频率。标记界定的右边界[15]来源于基因组中未锚定的一个序列,因此它的精准定位不容易建立,这可能是个体单株表型分类存在某些困难。
Table 1
表1
表1苹果基因组序列公布以来Co的精细作图
Table 1Fine mapping of Co gene after the publication of the apple genome sequence
| 文献来源 Reference | 标记 Sign | 物理位置 Physical position (Mb) | Co基因区域大小 Co gene region size (kb) |
|---|---|---|---|
| BAI[15] | C1753—3520、C7629—22009 | 18.9—19.0 | 193 |
| MORIYA[14] | Mdo.Chr 10.11、Mdo.Chr 10.15 | 18.76—18.96 | 196 |
| BALDI[19] | Co04R10、Co04R13 | 18.52—18.90 | 193 |
| OTTO[80] | I2_3_M1、1C3_M2 | 18.73—18.92 | — |
| MORIMOTO and BANNO [81] | LG10-Co-N、C7629—12936 | 18.56—19.09 | 530 |
| OKADA[82] | Mdo.chr10.11—2、Mdo.chr10.13—2 | 18.76—18.9 | 101 |
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2.2 候选基因挖掘
2.2.1 转录组学分析 近5年来,各国****以柱型苹果的茎尖或胚根作为试材,利用高通量组学的方法试图从转录组学层面揭示柱型苹果与非柱型苹果基因的表达差异[84-87]。ZHANG等[84]以‘富士’ב特拉蒙’杂交后代柱型以及非柱型分离群体的新梢为试材,发现24%的差异表达基因在GA、IAA和BR生物合成中发挥重要作用。287个基因序列参与树形调控,其中25个基因序列是在调控柱型苹果树形过程中发挥重大作用的转录因子。KROST等[85-86]研究发现,柱型苹果中参与DNA合成、RNA加工和蛋白质合成的基因表达发生下调,而参与运输和蛋白质修饰的基因表达发生了上调,这些都与减少柱型苹果的生长有关。Co明显影响柱型苹果内源激素的动态平衡。在Co附近存在大量调控基因,其中的4个基因是和植物激素调控相关。生长促进因子（IAA、CTK和GA）和抑制因子（茉莉酸JA和木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶XTH）之间的相互影响都是上调表达,这和植株的高度相关。柱型苹果的细胞周期在G2期被抑制,这导致细胞数量减少,因此其生长受阻。PETERSEN等[87]以柱型苹果（杂合型和纯合型两种）和普通型苹果的胚根为试验材料,发现柱型苹果胚根中的基因表达发生上调,这些基因主要参与纤维素和苯丙素的生物合成,细胞壁修饰、转录和翻译,乙烯和茉莉酸的生物合成。杂合型柱型苹果中Gypsy-44插入位点下游方向的dmr6-like表达发生下调,但在枝条顶端组织中出现严重上调表达。由此推测,不同调控的第一步有可能发生在反转录插入区域内,组织的特异性表明一个或多个组织特异调控因子参与其中。2.2.2 关键候选基因挖掘 关于Co,若干相关的候选基因已经被报道[82-83,87-89]。MORIMOTO等[81]预测在估计的Co区域,有55个基因,包括AP2/ERF,2OG-Fe（II）氧化酶、非顶端分生组织、水解酶和侧生器官转录因子等。LBD转录因子被当做Co的候选基因,主要原因是在拟南芥和其他物种中已证明LBD蛋白在调控侧生器官的发育中发挥着重要作用。OKADA等[82]以柱型苹果‘威赛克旭’和普通型苹果‘旭’茎尖为试材,为了确定Co的候选基因,用RNA序列分析不同的表达基因,共发现6个候选基因表达水平明显不同。4个候选基因在柱型苹果‘威赛克旭’中上调表达,91071仅仅在柱型苹果‘威赛克旭’中表达,而在非柱型苹果中不表达。而且在离体培养的柱型苹果‘威赛克旭’和普通型苹果‘旭’中,91071也仅仅只是在柱型苹果‘威赛克旭’的叶片和茎尖中表达。依此推断,91071是最有希望的Co候选基因,而其他5个基因不可能是Co的候选基因。
PETERSEN等[87]报道在柱型苹果‘P28’顶端分生组织中两个候选基因MDP0000927098（ATL5K- like）和MDP0000163720（ACC1-like）也是上调表达。BALDI等[20]分析Co区域的ORFs发现：存在若干潜在的Co候选基因,包括AP2/ERF、bHLH、MYB和NAM转录因子。
WOLTERS等[88]分析了定位于50 kb区域间6个预测基因的表达模式,与‘旭’苹果相比,MdCo31基因在‘威赛克旭’苹果腋芽中上调表达。OTTO等[89]参考‘金冠’苹果基因组,发现两个候选基因MDP0000934866（bHLH155-lile）和MDP0000878773（ACC1-like）,这两个候选基因在‘威赛克旭’叶片中显著上调表达。OTTO等[89]发现,与普通型苹果‘A14’相比,已经确定的候选基因MDP0000934866（bHLH155-lile）在柱型苹果‘P28’顶端分生组织中约有2倍的上调表达,而dmr6-like（downy mildew resistance 6-like）仅仅在‘P28’中表达,在‘A14’中不表达。
先前报道的Co有5个候选基因：MdCo3l/ dmr6-like、MDP0000934866、MDP0000878773、MDP0000927098和MDP0000163720[87-89]。其中的MdCo3l/dmr6-like就是相对应的91071,该基因在柱型苹果和普通型苹果之间表达有差异,其他候选基因表达水平相似,没有差异[87]。因此更加说明91071（MdCo3l/dmr6-like）是最有希望的Co基因候选基因。OKADA等[82]将候选基因91071转入烟草中,转基因烟草的植株高度和节间长度均变短,这与WOLTERS等[88]报道拟南芥中过表达该基因导致节间变短类似。同时,在苹果中过表达该基因也引起节间变短,但柱型苹果的生长表型不仅仅是节间短,有可能Co区域的其他基因参与减少侧枝和增加短枝的形成。在未来,验证该基因是否引起侧枝减少和增加短枝也非常重要[83]。
3 展望
柱型苹果是一类特殊的自然突变体,前期的研究表明其内源激素的含量与其树体生长密切相关,但到底哪一个是原因哪一个是结果或者说二者之间的直接关联还有待进一步探讨。传统遗传学分析证实柱型苹果树形性状是由显性的Co控制的质量性状,Co已经被精细定位于第10号染色体上的18.52—19.09 Mb区间,Co的产物可能不是在根上而是在枝条上发挥作用,也可能以某种方式参与营养生长到生殖生长的转变,Co还可能与植物激素IAA、CK和GA的代谢和信号转导有关,因此,Co的详细功能尚需要验证,其基因产物或者突变类型仍然未知。另外,Co在株形调控方面是单独发挥作用,还是同多个基因联合发挥作用?Co如何通过信号转导途径发挥功能?这一系列问题仍然是未来科学研究的焦点。随着分子生物学的迅猛发展,未来对Co位点区域的进一步深度挖掘和分析势在必行。今后应进一步采用蛋白-蛋白互作（Y2H、BIFC、Pull-Down及CoIP）、蛋白-DNA启动子结合（Y1H、EMSA及ChIP）、启动子活性检测（LUC和GUS报告试验）,RNAi及转基因植株等基因功能验证技术,对相关的候选关键基因进行功能验证,以进一步揭示柱型苹果独特生长特性的分子机理。只有明确柱型苹果独特树形生长特性的分子机理,果树育种工作者才能打破传统育种方式中柱型性状和果实品质差紧密连锁的弊端,通过分子育种手段创造出品质优良的柱型苹果新种质,为矮化密植高产提供优良资源,这也是未来柱型苹果发展利用的最理想途径和根本出路。
The authors have declared that no competing interests exist.
