禾谷镰孢复合种毒素化学型及遗传多样性分析

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马红霞, 孙华, 郭宁, 张海剑, 石洁, 常佳迎. 禾谷镰孢复合种毒素化学型及遗传多样性分析[J]. 中国农业科学, 2018, 51(1): 82-95 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.01.008
MA HongXia, SUN Hua, GUO Ning, ZHANG HaiJian, SHI Jie, CHANG JiaYing. Analysis of Toxigenic Chemotype and Genetic Diversity of the Fusarium graminearum Species Complex[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2018, 51(1): 82-95 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.01.008

0 引言

【研究意义】禾谷镰孢复合种（Fusarium graminearum species complex,FGSC）是引起中国玉米穗腐病的优势病原菌之一^[1],病原菌通过气流传播^[2-4]。该病原菌不仅可直接危害果穗,影响种子萌发,降低玉米品质及产量;其产生的毒素主要为雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其衍生物15-ADON和3-ADON,对人畜健康造成很大威胁^[5-9],给产后贮藏加工带来严重影响^[10]。禾谷镰孢复合种有较高的遗传变异^[11],不同地理环境其遗传变异率不同^[12]。研究发现,2015年北方春玉米区玉米穗腐病的优势病原菌为禾谷镰孢复合种^[13],但对引起该区域的穗腐病禾谷镰孢复合种的来源问题未见报道。对来自不同省份禾谷镰孢复合种的遗传多样性进行研究,明确各地种群和东北春玉米区种群间的亲缘关系,对病害防控和预测预报具有重要意义。【前人研究进展】禾谷镰孢复合种侵染谷物籽粒产生的毒素类型主要为单端孢烯族化合物,控制该化合物生物合成基因的研究较多。LEE等研究发现,Tri13和Tri7是镰孢菌单端孢烯族化合物决定生物合成最终产物为DON还是NIV的关键基因^[14-15];CHANDLER等^[16]根据这2个关键基因设计了Tri7F/DON、Tri7F/NIV和Tri13F/ DONR、Tri13NIVF/R等专化性引物,用于区分产DON和NIV毒素类型;董怀玉等^[17]利用上述专化性引物对分离自中国北方春玉米区玉米籽粒的禾谷镰孢复合种进行产毒素化学型检测,发现F. graminearum只产生DON,F. asiaticum可以产生DON和NIV。Tri3控制C-15位置的乙酰化反应,JENNINGS等^[18]根据基因序列设计引物用于进一步区分黄色镰孢（F. culmorum）产DON菌株的乙酰化产毒类型;李伟等^[19]利用Tri3专化性引物发现长江流域产3-AcDON毒素的F. asiaticum是引起小麦赤霉病的优势种群;纪莉景^[20]采用Tri13和Tri3专化性引物分析禾谷镰孢的产毒类型,明确了中国禾谷镰孢产毒类型为NIV、15-ADON和3-ADON,并且它们的分布与地域有关。基于PCR的分子标记技术越来越多地应用于镰孢菌遗传多样性分析,例如随机扩增多态性DNA标记（RAPD）^[21]、限制性片段长度多态性（RFLP）^[22]、扩增片段长度多态性（AFLP）^[23]、简单序列重复间区的DNA序列（inter simple sequence repeat,ISSR）^[24]、延伸因子（EF-1α）^[19]等。有关玉米穗腐病病原菌禾谷镰孢复合种的遗传多样性也有报道^[20,25-26]。纪莉景^[20]采用RAPD技术确定中国存在3类禾谷镰孢进化群lineage7、lineage6和lineage3,并发现每一类群内各地理来源菌株间存在丰富的遗传多样性;董怀玉等^[25]利用禾谷镰孢复合种特异性引物Fg16F/R,明确北方春玉米区玉米穗腐病病原菌禾谷镰孢复合种存在SCAR类型1和类型5;任旭^[26]采用VNTR和SSR标记对禾谷镰孢复合种进行遗传多样性分析,表明产毒化学型和地域分布对多样性分析有一定影响。ISSR标记是基于PCR的分子标记技术,扩增谱带为显性,数据可靠且可重复,多态性较高,广泛应用于镰孢菌遗传多样性分析^[11,27-30]。ALBAYRAK等^[9]利用ISSR技术发现禾谷镰孢和黄色镰孢在种内和种间均具有遗传变异,且毒素类型和镰孢菌种类与地理区域有相关性。【本研究切入点】禾谷镰孢复合种目前为止已确定至少由15种不同的病原菌组成^[1]。不同地理来源的禾谷镰孢复合种产毒类型不同且存在较高的遗传变异。ISSR技术在镰孢菌种间和种内进行遗传分析过程中均能表现出明显的遗传差异性,可用于镰孢菌遗传多态性的分析研究,但用于玉米穗腐病病原菌禾谷镰孢复合种的遗传多样性分析未见报道。【拟解决的关键问题】采用基因Tri13和Tri3特异性引物分析不同省（自治区）禾谷镰孢复合种产毒类型,利用ISSR技术分析其遗传多样性,明确各地种群间的亲缘关系,为该病害流行、预测预报、防控及相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2015—2016年在河北省农林科学院植物保护研究所完成。

1.1 材料

于2015年采集北方春播区（甘肃、内蒙古、黑龙江、辽宁、吉林、山西、河北张家口及唐山）和黄淮海夏播区（河北石家庄、河南、山东、安徽、江苏）的玉米穗腐病病样,通过组织分离法分离得到92株禾谷镰孢复合种菌株（表1）,采用艾德莱真菌基因组提取试剂盒提取这些菌株的菌丝DNA,-20℃保存备用。
Table 1
表1
表1供试禾谷镰孢复合种的来源、编号和毒素化学型
Table 1Origin, number and toxigenic chemotype of FGSC in this study

采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	毒素化学型 Toxigenic chemotype				采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	毒素化学型 Toxigenic chemotype
采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	NIV	DON	3-ADON	15-ADON	采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	NIV	DON	3-ADON	15-ADON
安徽省黄山市黄山区 Huangshan, Huangshan, Anhui	AH1	-	-	-	+	山西省晋中市寿阳县 Shouyang, Jinzhong, Shanxi	SX3	-	+	-	+
安徽省宿州市泗县 Sixian, Suzhou, Anhui	AH2	-	+	-	+	山西省晋中市寿阳县 Shouyang, Jinzhong, Shanxi	SX5	-	+	-	+
江苏省徐州市睢宁县 Suining, Xuzhou, Jiangsu	JS1	-	+	-	+	山西省晋中市寿阳县 Shouyang, Jinzhong, Shanxi	SX24	-	-	-	+
江苏省徐州市睢宁县 Suining, Xuzhou, Jiangsu	JS2	+	-	-	+	山西省忻州市忻府区 Xinfu, Xinzhou, Shanxi	SX12	-	+	-	+
江苏省徐州市睢宁县 Suining, Xuzhou, Jiangsu	JS3	-	-	-	-	山西省忻州市忻府区 Xinfu, Xinzhou, Shanxi	SX23	-	-	-	+
采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	毒素化学型 Toxigenic chemotype				采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	毒素化学型 Toxigenic chemotype
采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	NIV	DON	3-ADON	15-ADON	采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	NIV	DON	3-ADON	15-ADON
山东省潍坊市青州市 Qingzhou, Weifang, Shandong	SD1	-	-	-	-	辽宁省抚顺市清原县 Qingyuan, Fushun, Liaoning	LN1	-	+	-	+
山东省潍坊市青州市 Qingzhou, Weifang, Shandong	SD2	-	+	-	+	辽宁省抚顺市清原县 Qingyuan, Fushun, Liaoning	LN3	-	-	-	+
山东省潍坊市青州市 Qingzhou, Weifang, Shandong	SD4	-	+	-	+	辽宁省抚顺市清原县 Qingyuan, Fushun, Liaoning	LN4	-	-	-	+
山东省枣庄市驿城区 Yicheng, Zhaozhuang, Shandong	SD3	-	-	-	-	辽宁省大连市普兰店区 Pulandian, Dalian, Liaoning	LN2	-	+	-	+
山东省烟台市莱州市 Laizhou, Yantai, Shandong	SD5	-	+	-	+	吉林省吉林市磐石县 Panshi, Jilin, Jilin	JL15	-	-	-	+
河南省周口市扶沟县 Fugou, Zhoukou, Henan	HN1	-	-	-	+	吉林省吉林市磐石县 Panshi, Jilin, Jilin	JL1	-	+	-	+
河南省周口市扶沟县 Fugou, Zhoukou, Henan	HN2	-	+	-	+	吉林省吉林市磐石县 Panshi, Jilin, Jilin	JL3	-	+	-	+
河南省周口市扶沟县 Fugou, Zhoukou, Henan	HN3	-	-	-	-	吉林省吉林市磐石县 Panshi, Jilin, Jilin	JL7	-	-	-	+
河北省张家口市万全县 Wanquan, Zhangjiakou, Hebei	HB1	-	-	-	-	吉林省延边市安图县 Antu, Yanbian, Jilin	JL2	-	+	-	+
河北省张家口市万全县 Wanquan, Zhangjiakou, Hebei	HB4	-	-	-	-	吉林省四平市双辽市 Shuangliao, Siping, Jilin	JL6	-	+	-	+
河北省张家口市万全县 Wanquan, Zhangjiakou, Hebei	HB5	-	-	-	+	吉林省长春市榆树市 Yushu, Changchun, Jilin	JL4	-	-	-	-
河北省张家口市万全县 Wanquan, Zhangjiakou, Hebei	HB6	-	+	-	+	吉林省长春市榆树市 Yushu, Changchun, Jilin	JL5	-	+	-	+
河北省张家口市万全县 Wanquan, Zhangjiakou, Hebei	HB7	-	+	-	+	吉林省长春市榆树市 Yushu, Changchun, Jilin	JL9	-	+	-	+
河北省石家庄市藁城市 Gaocheng, Shijiazhuang, Hebei	HB2	-	+	-	+	吉林省吉林市永吉县 Yongji, Jilin, Jilin	JL14	-	+	-	+
河北省石家庄市赵县 Zhaoxian, Shijiazhuang, Hebei	HB3	-	+	-	+	吉林省吉林市永吉县 Yongji, Jilin, Jilin	JL8	-	-	-	+
河北省石家庄市辛集市 Xinji, Shijiazhuang, Hebei	HB8	-	+	-	+	吉林省吉林市永吉县 Yongji, Jilin, Jilin	JL11	-	-	-	+
河北唐山市 Tangshan, Hebei	HB9	-	-	-	-	吉林省白城市洮北区 Zhaobei, Baicheng, Jilin	JL10	-	-	-	+
山西省长治市平顺县 Pingshun, Changzhi, Shanxi	SX1	-	+	-	+	吉林省长春市 Changchun, Jilin	JL12	-	-	-	+
山西省长治市平顺县 Pingshun, Changzhi, Shanxi	SX11	-	+	-	+	吉林省松原市扶余县 Fuyu, Songyuan, Jilin	JL13	-	+	-	+
采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	毒素化学型 Toxigenic chemotype				采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	毒素化学型 Toxigenic chemotype
采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	NIV	DON	3-ADON	15-ADON	采集地点 Collection site	菌株编号 Isolate number	NIV	DON	3-ADON	15-ADON
山西省长治市平顺县 Pingshun, Changzhi, Shanxi	SX4	-	+	-	+	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ1	-	+	-	+
山西省长治市平顺县 Pingshun, Changzhi, Shanxi	SX14	-	-	-	+	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ2	-	+	-	+
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX6	-	+	-	+	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ4	-	+	-	+
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX7	-	-	-	-	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ5	-	+	-	+
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX8	-	+	-	+	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ6	-	-	-	-
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX13	-	-	-	-	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ10	-	+	-	+
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX17	-	+	-	+	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ11	-	+	-	+
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX20	-	+	-	+	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ12	-	+	-	+
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX25	-	+	-	+	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ13	-	-	-	-
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX26	-	-	-	+	黑龙江省哈尔滨市宾县 Binxian, Harbin, Heilongjiang	HLJ14	-	-	-	-
山西省长治市襄垣县 Xiangyuan, Changzhi, Shanxi	SX27	-	+	-	+	黑龙江省绥化市兰西县 Lanxi, Suihua, Heilongjiang	HLJ3	-	+	-	+
山西省长治市壶关县 Huguan, Changzhi, Shanxi	SX9	-	+	-	+	黑龙江省绥化市肇东市 Zhaodong, Suihua, Heilongjiang	HLJ7	-	+	-	+
山西省长治市壶关县 Huguan, Changzhi, Shanxi	SX21	-	+	-	+	黑龙江省黑河市 Heihe, Heilongjiang	HLJ8	-	+	-	+
山西省长治市壶关县 Huguan, Changzhi, Shanxi	SX28	-	+	-	+	黑龙江省黑河市 Heihe, Heilongjiang	HLJ9	-	-	-	+
山西省长治市沁县 Qinxian, Changzhi, Shanxi	SX10	-	+	-	+	内蒙古自治区通辽市科尔沁区 Horqin District, Tongliao, Inner Mongolia Autonomous Region	NMG1	-	+	-	+
山西省长治市屯留县 Tunliu, Changzhi, Shanxi	SX16	-	-	-	+	内蒙古自治区通辽市科尔沁区 Horqin District, Tongliao, Inner Mongolia Autonomous Region	NMG4	-	-	-	-
山西省长治市屯留县 Tunliu, Changzhi, Shanxi	SX22	-	-	-	+	内蒙古自治区通辽市科尔沁区 Horqin District, Tongliao, Inner Mongolia Autonomous Region	NMG2	-	+	-	+
山西省长治市长治县 Changzhi, Changzhi, Shanxi	SX29	-	+	-	-	内蒙古自治区通辽市科尔沁区 Horqin District, Tongliao, Inner Mongolia Autonomous Region	NMG3	-	+	-	+
山西省长治市长治县 Changzhi, Changzhi, Shanxi	SX18	-	+	-	+	甘肃省酒泉肃州区 Suzhou, Jiuquan, Gansu	GS4	-	-	-	-
山西省长治市长治县 Changzhi, Changzhi, Shanxi	SX19	-	+	-	+	甘肃省酒泉肃州区 Suzhou, Jiuquan, Gansu	GS1	-	+	-	+
山西省晋城市陵川县 Lingchuan, Jincheng, Shanxi	SX15	-	+	-	+	甘肃省酒泉肃州区 Suzhou, Jiuquan, Gansu	GS2	-	-	-	+
山西省晋中市寿阳县 Shouyang, Jinzhong, Shanxi	SX2	-	+	-	+	甘肃省酒泉肃州区 Suzhou, Jiuquan, Gansu	GS3	-	-	-	+

No amplification product+：有扩增结果Amplification products;-：没有扩增结果

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1.2 禾谷镰孢复合种毒素化学型检测

根据Tri13和Tri3序列设计的特异性引物（表2）分析禾谷镰孢复合种的产毒类型。PCR反应体系为2×Es TaqMasterMix 12.5 μL,上下游引物（10 μmol·L^-1）0.5 μL,Template 1 μL,加ddH₂O补足至25 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min,94℃变性30 s,退火（视不同引物而定）45 s,72℃延伸1 min,35个循环,最后72℃延伸7 min。PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上以120 V电泳30 min,使用GelDoc XR+凝胶成像系统照相。
Table 2
表2
表2本研究所用特异性引物
Table 2Specific primer pairs used in this study

引物 Primer	引物序列 Primer sequence (5′-3′)	化学型 Chemotype	扩增片段 Product size (bp)	退火温度 Tm (℃)	文献 Reference
Tri13F	TACGTGAAACATTGTTGGC	DON, NIV	234, 415	57	[31]
Tri13R	GGTGTCCCAGGATCTGCG	DON, NIV	234, 415	57	[31]
Tri303F	GATGGCCGCAAGTGGA	3-ADON	586	52	[18]
Tri303R	GCCGGACTGCCCTATTG	3-ADON	586	52	[18]
Tri315F	CTCGCTGAAGTTGGACGTAA	15-ADON	864	58	[18]
Tri315R	GTCTATGCTCTCAACGGACAAC	15-ADON	864	58	[18]

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1.3 ISSR分析

1.3.1 ISSR引物筛选随机选择不同地区的4个菌株的DNA等量混合成DNA模板,对加拿大哥伦比亚大学（University of British Columbia,UBC）公布的100个ISSR引物进行初步筛选,选择扩增条带丰富、重复性好、信号强、背景清晰的引物用于全部92个DNA样品的扩增。
1.3.2 ISSR-PCR体系及程序 PCR反应体系为2×Es TaqMasterMix 10 μL,Primer（10 μmol·L^-1）1.5 μL,Template 1 μL,加ddH₂O补足至20 μL。采用的13个引物见表2。PCR反应程序：94℃预变性5 min,94℃变性30 s,退火（视不同引物而定）45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环,最后72℃延伸7 min。
PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上以120 V电泳30 min,使用GelDoc XR+凝胶成像系统照相。扩增出2种及以上不同的条带即为多态性引物。
1.3.3 数据分析对ISSR电泳谱带进行记录,在相同位置出现条带的记为“1”,无条带的记为“0”,缺失条带记为“9”或“. ”。使用Popgen32软件进行数据分析,计算Shannon’s多样性指数、群体间的遗传距离和遗传相似性^[32];利用NTsys2.10e软件,采用clustering模块中的SAHN进行UPGMA聚类分析,并构建供试菌株的系统聚类图。

2 结果

2.1 禾谷镰孢复合种毒素化学型PCR分析

利用引物Tri13F/Tri13R可同时鉴定NIV（415 bp）和DON（234 bp）（图1-A）。92株菌株只有江苏菌株JS2可产生NIV,有56个（60.87%）菌株可产生DON（表1）,表明北方春玉米区和黄淮夏玉米区禾谷镰孢复合种产生的主要毒素化学型为DON。引物Tri315F/Tri315R扩增的目的条带大约为870 bp（图1-B）,有76株（82.61%）菌株可产生15-ADON（表3）。引物Tri303F/Tri303R没有扩增出目的条带,表明92株菌株不能产生3-ADON。

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图1部分禾谷镰孢复合种菌株产毒素化学型的PCR检测 M：DM2000 DNA Marker。A：部分禾谷镰孢复合种菌株NIV和DON化学型检测 PCR amplification of NIV and DON of some FGSC isolates;B：部分禾谷镰孢复合种菌株15-ADON化学型检测PCR amplification of 15-ADON of some FGSC isolates
-->Fig. 1Detection of toxigenic chemotypes of some FGSC isolates by PCR assay
-->

综合分析表1和表3可知,仅有江苏菌株JS2能产生NIV和15-ADON;有55株（59.78%）可同时产生DON和15-ADON;有20株（21.74%）仅产生15-ADON;山西菌株SX29只产生DON;但有15株（16.30%）即不产生DON也不产生NIV。
Table 3
表3
表3禾谷镰孢复合种毒素化学型的地域差异
Table 3Regional variation in toxigenic chemotypes of FGSC

地理来源 Geographical region	菌株数 Number of isolates	禾谷镰孢复合种毒素化学型 FGSC toxigenic chemotype
地理来源 Geographical region	菌株数 Number of isolates	NIV	DON	3-ADON	15-ADON
安徽省Anhui	2	0	1	0	2
江苏省Jiangsu	3	1	1	0	2
山东省Shangdong	5	0	3	0	3
河南省Henan	3	0	1	0	2
河北省Hebei	9	0	5	0	6
山西省Shanxi	29	0	21	0	26
辽宁省Liaoning	4	0	2	0	4
吉林省Jilin	15	0	8	0	14
黑龙江省Heilongjiang	14	0	10	0	11
内蒙古自治区Inner Mongolia Autonomous Region	4	0	3	0	3
甘肃省Gansu	4	0	1	0	3
总计Total	92	1	56	0	76

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2.2 ISSR-PCR扩增

从100个引物中筛选出13个扩增条带丰富、重复性好、信号强、背景清晰的引物。所选的13个引物对11个省（自治区）的92个菌株进行ISSR-PCR扩增（图2）,结果如表4所示。共获得102个条带,其中多态性条带101个,占99.02%。扩增的DNA片段大小在200—2 500 bp。不同引物扩增条带数不等,条带数在2—14条,多数为7—9条,平均每条引物产生多态性条带7.85条。其中866号引物扩增出的条带数最多（14条）;而引物855扩增出的条带数最少（2条）。除引物855的多态性条带为50%外,其余引物均为100%。

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图26个引物对部分禾谷镰孢复合种菌株基因组DNA的ISSR-PCR扩增
-->Fig. 2Amplification of genome DNA of some FGSC isolates with 6 primers
-->

Table 4
表4
表4ISSR引物扩增
Table 4The amplification with ISSR primers

引物 Primer	序列 Sequence (5′-3′)	退火温度 Tm (℃)	扩增条带数 Number of amplified bands	多态性条带 Number of polymorphic bands	多态性百分率 Percent polymorphism (%)
807	(AG)₈T	47	7	7	100
808	(AG)₈C	52	9	9	100
809	(AG)₈G	47	11	11	100
810	(GA)₈T	46	8	8	100
811	(GA)₈C	47	8	8	100
812	(GA)₈A	46	5	5	100
836	(AG)₈YA	48.5	8	8	100
855	(AC)₈YT	46	2	1	50
856	(AC)₈YA	46	8	8	100
861	(ACC )₆	61.7	5	5	100
866	(CTC )₆	62	14	14	100
868	(GAA)₆	48	8	8	100
876	(GATA)₂(GACA)₂	36.2	9	9	100
总计Total			102	101	99.02

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2.3 不同地理种群禾谷镰孢复合种遗传多态性

对禾谷镰孢复合种菌株按不同省（自治区）来源分为11组,其多态性分析如表5所示。在群体平均水平上,多态性位点为101个,多态性位点比率为99.02%,有效等位基因数（NE）为1.5207,基因多样性指数（H）为0.3129,Shannon’s信息指数（I）为0.4774,表明禾谷复合种群体存在丰富的遗传变异。就各地区而言,H值在0.1421—0.3160,I值在0.2075—0.4744,表明禾谷镰孢复合种的遗传多样性在不同地理种群间存在一定差异。河北、山西、黑龙江和吉林种群遗传多样性最高,内蒙古和辽宁种群次之,山东、江苏和甘肃种群较低,安徽和河南种群最低。
Table 5
表5
表5禾谷镰孢复合种不同地理种群的遗传多样性水平
Table 5Genetic diversity parameters among geographic populations of FGSC

采样地点 Collection site	多态性位点 Number of polymorphic loci	多态性比率 Percent of polymorphism (%)	观察等位基因数 Observed number of alleles (NA)	有效等位基因数 Effective number of alleles (NE)	基因多样性指数 Nei’s gene diversity (H)	Shannon’s 信息指数 Shannon’s information index (I)
河北HB	88	86.27	1.8627	1.4945	0.2924	0.4411
河南HN	39	38.24	1.3824	1.2415	0.1431	0.2133
山东SD	55	53.92	1.5392	1.3114	0.1845	0.2790
安徽AH	35	34.31	1.3431	1.2426	0.1421	0.2075
江苏JS	49	48.04	1.4804	1.3256	0.1884	0.2776
甘肃GS	53	51.96	1.5196	1.3397	0.1946	0.2885
内蒙古NMG	61	59.80	1.5980	1.4033	0.2286	0.3371
山西SX	98	96.08	1.9608	1.5268	0.3117	0.4715
黑龙江HLJ	94	92.16	1.9216	1.5374	0.3160	0.4744
吉林JL	89	87.25	1.8725	1.4538	0.2724	0.4154
辽宁LN	56	54.90	1.5490	1.3617	0.2090	0.3094
群体平均水平Average level of population	101	99.02	1.9902	1.5207	0.3129	0.4774

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分析得到11个地理种群总基因多样性Ht为0.3101,各地理种群内基因多样性Hs为0.2257,地理群体间的基因多样性Dst为0.0844,表明相同省份来源的菌株具有较近的亲缘关系。地理种群间的基因分化系数Gst为0.2722,这说明不同地理种群间遗传变异占种群总遗传变异的27.22%,大部分遗传变异（72.78%）发生在种群内。根据遗传分化系数估算的基因流的值Nm=1.3372（>1）,表明种群间存在一定的基因流动。

2.4 不同地理种群禾谷复合体遗传相似性

11个地理种群间的遗传距离和遗传相似系数如表6所示,不同地理种群间的遗传相似性为0.7920—0.9997,遗传距离为0.0003—0.2332。根据遗传相似性和遗传距离分析,河北、山西、黑龙江和吉林菌株群体间相似系数最大,遗传距离最小,亲缘关系最近;其次是山东与江苏菌株间,以及辽宁与吉林菌株间的亲缘关系较近,相似系数均为0.96;内蒙古、甘肃和河南的菌株与上述这些地区的亲缘关系较远;安徽和内蒙古菌株间的亲缘关系最远,相似系数为0.7920,遗传距离为0.2332。
Table 6
表6
表6禾谷镰孢复合种不同地理种群间的遗传相似性和遗传距离
Table 6Genetic identity and genetic distance among geographic populations of FGSC

地理种群 Geographical group	河北 HB	河南 HN	山东 SD	安徽 AH	江苏 JS	甘肃 GS	内蒙古 NMG	山西 SX	黑龙江 HLJ	吉林 JL	辽宁 LN
河北HB	****	0.9015	0.9440	0.8817	0.9242	0.9178	0.9269	0.9844	0.9868	0.9753	0.9368
河南HN	0.1037	****	0.9055	0.8076	0.8806	0.8581	0.8316	0.9115	0.9190	0.9251	0.9135
山东SD	0.0577	0.0993	****	0.9046	0.9637	0.8991	0.8842	0.9437	0.9461	0.9399	0.9197
安徽AH	0.1259	0.2137	0.1003	****	0.9200	0.8152	0.7920	0.8773	0.8745	0.8598	0.8226
江苏JS	0.0788	0.1272	0.0370	0.0834	****	0.8674	0.8414	0.9261	0.9211	0.9236	0.8978
甘肃GS	0.0857	0.1530	0.1064	0.2044	0.1422	****	0.9221	0.9566	0.9549	0.9558	0.8780
内蒙古NMG	0.0759	0.1844	0.1231	0.2332	0.1726	0.0811	****	0.9318	0.9464	0.9181	0.8855
山西SX	0.0157	0.0927	0.0579	0.1309	0.0768	0.0444	0.0706	****	0.9997	0.9961	0.9517
黑龙江HLJ	0.0133	0.0844	0.0554	0.1341	0.0822	0.0461	0.0551	0.0003	****	0.9932	0.9567
吉林JL	0.0251	0.0778	0.0619	0.1510	0.0795	0.0452	0.0854	0.0039	0.0068	****	0.9668
辽宁LN	0.0653	0.0905	0.0838	0.1953	0.1078	0.1301	0.1216	0.0495	0.0442	0.0338	****

Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)对角线上方为遗传相似系数,对角线下方为遗传距离

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2.5 禾谷镰孢复合体ISSR聚类分析

利用NTsys2.10e软件对92个菌株进行ISSR聚类分析,结果如图3所示,菌株间具有丰富的遗传多样性,相似系数在0.43—0.95。在相似系数为0.43时,所有的菌株被分成2大类群,Group 1包括4株北方春播区菌株（吉林、山西和河北张家口）,这些菌株既不产生NIV也不产生DON;Group 2由余下的88株菌株构成,这些菌株产生的毒素类型主要为DON和15-ADON,其来源于北方春播区（山西、黑龙江、吉林、辽宁、甘肃和河北张家口、唐山）和黄淮海夏播区（河北石家庄、河南、山东、江苏和安徽）,虽然图3显示它们交叉聚在一起,但大部分春播区菌株聚在一起,较多的夏播区菌株聚在一起。

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图3禾谷镰孢复合种菌株的UPGMA聚类图
-->Fig. 3Dendrogram obtained by UPGMA clustering for FGSC isolates
-->

在相似系数为0.56时,92个菌株可划分成9个群。A群和B群组成Group 1;C群由76.08%的菌株组成,该群在相似系数为0.664水平上又分成6个亚群,Ⅰ亚群由34株春播区菌株（山西、吉林、黑龙江、内蒙古、甘肃和河北张家口）组成,Ⅱ亚群由9个春播区菌株（内蒙古、山西、辽宁、吉林和黑龙江）和7株夏播区菌株（山东、河南、江苏和河北石家庄）组成,Ⅲ亚群由5个春播区菌株（山西、吉林、黑龙江和辽宁）和3株夏播区菌株（河北石家庄和江苏）组成,Ⅳ亚群由1株吉林菌株组成,Ⅴ亚群由9株春播区菌株（吉林、黑龙江、山西、甘肃和河北张家口）组成,Ⅵ亚群由3株山西菌株组成;D群由1株安徽菌株构成;E群由1株山西菌株和3株夏播区菌株（江苏、山东和安徽）构成;F群由4株春播区菌株（内蒙古、黑龙江和河北唐山）构成;G群由2株春播区菌株（吉林和辽宁）和1株河南菌株构成;H群由1株河北张家口菌株构成;I群由4株春播区菌株（黑龙江、辽宁、山西和河北张家口）和1株山东菌株构成。

3 讨论

镰孢菌属真菌是玉米上的重要病原菌,能够产生多种次生代谢产物,可引起玉米的穗腐病、茎腐病和根腐病等。其中禾谷镰孢复合种是引起玉米穗腐病的优势病原菌之一,禾谷镰孢复合种主要产生的毒素化学型为NIV和DON及其衍生物3-ADON和15-ADON;化学型的产生类型与地域有一定的关系,在中国冷凉地区一般以15-ADON为主,温暖地区如长江流域以3-ADON和NIV为主^[19-20]。本研究发现分离自春玉米区禾谷镰孢复合种的毒素化学型主要为DON和15-ADON,夏玉米区禾谷镰孢复合种产生的毒素化学型主要为DON和15-ADON,个别菌株可产生NIV。该研究结果与以上结论一致。
基于PCR的分子标记技术广泛应用于镰孢菌遗传多样性研究,大部分的分子标记技术以基因组DNA为靶标,比如RAPD、RFLP等,还有部分以线粒体DNA为模板。ISSR标记技术是以基因组DNA为模板的技术,揭示的多态性较高,检测非常方便,广泛应用于镰孢菌多样性分析。本研究利用13个多态性丰富的ISSR引物对来自11个省（自治区）的92个禾谷镰孢复合种菌株进行遗传多样性分析,共扩增出102个条带,其中多态性条带为101个,多态性比率为99.02%,表明禾谷镰孢复合种群体存在丰富的遗传变异,这一结果与QU等^[33]对禾谷镰孢菌群体的研究结果一致。
生物群体的遗传多样性是评价生物资源状况的重要依据之一,Nei’s基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）是衡量生物遗传多样性的重要参数。本研究在群体平均水平上,H为0.3129,I为0.4774,表明禾谷镰孢复合种存在较高的遗传多样性水平。11个地理种群的H值和I值的计算结果趋势一致,均为河北、山西、黑龙江和吉林种群遗传多样性最高,安徽和河南种群最低。这可能与来自安徽和河南的菌株数目较少有关。何婧等^[34]认为各采集地点禾谷镰孢菌数量的增加可提高遗传多样性水平。
不同地理种群总基因多样性（Ht）为0.3101,种群内基因多样性（Hs）为0.2257,地理种群间的基因分化系数（Gst）为0.2722,说明不同地理种群间存在一定的遗传变异,但大部分遗传变异（72.78%）发生在种群内。瞿波^[35]通过AFLP标记技术发现同一来源地的菌株很难找到相同的个体,说明禾谷镰孢复合种群体内存在广泛的遗传变异。
根据遗传分化系数估算的基因流值Nm=1.3372（>1）,表明不同地理种群间存在一定的基因流动,这一结果通过对地理种群间亲缘关系的分析进一步得到证实。根据遗传相似性和遗传距离分析,发现河北、山西、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和甘肃菌株群体间亲缘关系较近,山东、江苏、河南和安徽菌株间亲缘关系较近,安徽和内蒙古菌株间的亲缘关系最远,这表明菌株间的亲缘关系与地理来源有关。进一步对92个菌株的聚类结果分析发现,绝大多数北方春玉米区菌株（山西、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和河北张家口及唐山）聚在一起,黄淮海夏玉米区菌株（河北石家庄、山东、江苏、安徽和河南）趋向在一起,而且各个地理来源的菌株趋向聚在一起,同样说明禾谷镰孢复合种间的遗传多样性与生态环境有关,这与前人研究结果一致。瞿波^[35]认为中国的禾谷镰孢存在温暖型菌系和冷凉型菌系两种类型,具有明显的生态地理划分;何婧等^[34]研究发现,禾谷镰孢复合种间遗传多样性与其地理来源有一定的关系;董怀玉等^[25]通过对禾谷镰孢复合种SCAR类型测定发现玉米穗腐病禾谷镰孢菌存在明显的生态地理类型。在相似系数为0.664时,C群分为6个亚群,其中Ⅱ和Ⅲ亚群均包含春玉米区菌株和夏玉米区菌株,说明这些菌株亲缘关系较近,表明春玉米区穗腐病病原菌以本地菌源为主,但不排除部分病原菌可从夏玉米区远距离气传的可能。下一步研究应加大上述区域穗腐病病原菌禾谷镰孢复合种的采集范围和数量,以明确春玉米区穗腐病病原菌禾谷镰孢复合种的来源。

4 结论

北方春玉米区和黄淮海夏玉米区引起玉米穗腐病的禾谷镰孢复合种主要毒素化学型为DON和15-ADON。基于ISSR技术,表明禾谷镰孢复合种群体内存在丰富的遗传变异;相同地理来源的菌株有较近的亲缘关系,且不同地理种群间也存在一定的基因交流,遗传多样性水平与地理来源有关。
（责任编辑岳梅）
The authors have declared that no competing interests exist.