0 引言
【研究意义】保护作物免受病虫害以及有害植物危害对建立可持续化的粮食生产系统的作用至关重要[1-3]。在“农药化肥两减”的背景下,农药正朝着水基性、粒状、多功能、省力、安全和降低环境影响的方向发展。结合“绿色种植,统防统治”技术政策,精准施药技术是发展农业的必然选择,有效的种子包衣技术在其中可发挥重要作用。【前人研究进展】目前,包括美国、英国、德国在内的20多个国家成功将种子包衣技术广泛应用于冬小麦[4]、玉米[5]、大豆[6]、甜菜[7]等旱地作物。杨书成等[8]用60 g·L-1戊唑醇悬浮种衣剂处理玉米种子,在使用剂量为50—150 mL/100 kg时,能显著提高玉米出苗率,促进玉米生长,对玉米丝黑穗病的防治效果达到57.03%—91.06%,玉米增产25.8%—44.4%。由于气候差别和特殊种植条件的限制,水稻种衣剂研究仍有很大进步空间;ZENG等[9]研究发现,种子包衣与传统的水稻种子相比增产5%,原材料消耗成本降低25%。近年来,菲律宾成功解决了除草剂不能在水稻种衣剂上应用的问题,扩大了水稻种衣剂的研究方向以及使用范围。良好的活性成分是种衣剂充分发挥作用的重要保障。噻虫嗪是由先正达公司开发并推出市场的一种具有独特结构和优良杀虫活性的新型新烟碱类化合物[10-11],高效的杀虫活性使其被广泛用于控制大范围的内吸性害虫如蚜虫、粉虱、蓟马、甲虫等和一些鳞翅类害虫[12]。吡唑醚菌酯广泛作用于大豆、玉米、谷物和果蔬等作物,对穗颈病防效能达到90.7%,纹枯病防效达到89.4%[13]。【本研究切入点】现有水稻种衣剂在应用中存在脱落率高、药效发挥不稳定等问题。其主要原因在于种衣剂成膜剂多以聚乙烯醇、壳聚糖或其共混产物为主,这些材料易溶于水,难以保持活性成分,从而影响种衣剂的稳定性和生物活性[14-15]。并非所有的成膜剂都适合做水稻成膜剂,有水环境应用的种衣剂对成膜剂的耐水性比旱地作物要求更高。具有优异的成膜性和缓释性,以及卓越的耐水性和环境相容性的成膜剂是获得高活性、持效期长和安全性高的水稻种衣剂的关键[16-19]。【拟解决的关键问题】采用乳液共聚法,合成丙烯酸丁酯-双丙酮丙烯酰胺二元聚合物作为种衣剂成膜助剂,并优选40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂配方。对该种衣剂在水稻种子上的成膜时间、均匀度、脱落率以及悬浮率进行测定,并评估该种衣剂对水稻种子萌发、生长以及生理生化和生物活性等方面的影响。1 材料与方法
试验于2015—2016年在湖南农业大学农药研究室及试验基地完成。1.1 主要试剂及供试品种
96.5%噻虫嗪（上海禾本药业有限公司）;97%吡唑醚菌酯（贵州道元生物有限公司）;丙烯酸丁酯（天津市永大化学试剂有限公司）;双丙酮丙烯酰胺（国药集团化学试剂有限公司）;25%噻虫·咯·霜灵（有效成分成分：噻虫嗪：22.2%,咯菌腈：1.1%,精甲霜灵：1.7%,商品名：迈舒平,先正达（中国）投资有限公司）;水稻品种：湘早籼6号。1.2 主要仪器
DJ-1型旋转式黏度计NDJ-1（上海麦聚瑞电子仪器有限公司）;IKA T18 ULTRA-TURRAX高速分散机（广州仪科实验室技术有限公司）;Motic光学显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（邦西仪器科技上海有限公司）;ZNCL-S-5D磁力搅拌器（河南爱博特科技发展有限公司）;Rise-2006激光粒度分析仪（济南润之科技有限公司）;SPF400型试验多用分散机（中美合资莱州腾源化工机械厂）;Uvmini-1240紫外可见分光光度计（长沙市八方科学仪器有限公司）;CP214电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。1.3 成膜剂的制备及性能评价
采用乳液聚合法制备双丙酮丙烯酰胺-丙烯酸丁酯二元共聚物。将10%双丙酮丙烯酰胺置于集热式恒温磁力搅拌器80℃下搅拌,30 min后升温至90℃,按摩尔比1:1加入丙烯酸丁酯,同时滴加引发剂,反应3 h。对制备的共聚物的储存稳定性、成膜性、耐水性等性能进行检测[20]。1.4 40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂的制备
筛选出合适的助剂之后,采用湿法砂磨法,按照预先计算的物料质量配比,将原药、分散剂、增稠剂、水等称量后混合均匀,经高速剪切组织分散机剪切后将浆料移入砂磨机,进行砂磨,加入成膜剂,搅拌均匀后即可制得40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂,检测粒径合格后确定其最佳工艺条件。1.5 种衣剂性质
40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂的性能检测参照文献[21-22]进行。将1 mL的成膜共混乳液在2 cm×10 cm玻璃板上流延成膜。其共混乳液的成膜性分为以下3个等级：I级,成膜均匀,将载玻片浸没于水中浸泡0.5 h后,可以很好地从载玻片上完整地刮下一层膜;Ⅱ级,成膜均匀,将载玻片浸没于水中浸泡0.5 h后,不能很好地从载玻片上完整地刮下一层膜;Ⅲ级,成膜剂不能够在载玻片上均匀成膜。分散性按照分散的好坏可以分为优、良、劣3级。优级：在水中能够呈云雾状自动分散,没有可见颗粒下沉;良级：在水中不能够自动分散,有颗粒下沉,但下沉的颗粒可以缓慢的分散,轻微摇动后可以完全分散;劣级：在水中不能够很好的自动分散,呈颗粒状或絮状下沉,经强烈摇动或者超声波振荡后才可以完全分散。成膜剂冷热贮稳定性的好坏可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3级：热贮稳定性测定（54℃的恒温箱）,冷贮稳定性测定（0℃的冰箱）,14 d后取出试样有效成分的平均分解率<5%,则样品冷热贮稳定性Ⅰ;当 5%<分解率<20%,则样品冷热贮稳定性Ⅱ;分解率>20%,则样品冷热贮稳定性Ⅲ。1.6 盆栽试验
用40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂对水稻种子进行包衣处理,按药种比1:200、1:100、1:75、1:50和1:25进行包衣,以清水为空白对照,以迈舒平（药种比=1:75）种子处理剂为阳性对照,处理后晾干备用。将包衣种子播于花盆中,10粒/盆,每处理5盆,在水稻种植后观察种子的出芽情况,并在7 d后记录每个处理的发芽率。待种子出苗后观察其生长情况,在第25天测定并记录每个处理的株高、根长以及白根数和叶数。取3叶期水稻叶片,采用文献[23-25]的方法测定根系活力、游离脯氨酸、叶绿素等常规生理指标。用愈创木酚法、高锰酸钾滴定法和硝基四唑蓝法测定过氧化物酶（peroxidase,POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）的活性[26-28]。
1.7 统计分析
采用IBM SPSS Statics 21软件对所测数据进行单因素方差分析,用平均值±标准误表示测定结果,并应用Duncan氏新复极差法对处理间的差异显著性进行检验,P<0.05表示差异显著。2 结果
2.1 不同浸水时间对成膜剂稳定性的影响
通过光学显微镜观察种衣剂的吸水性、耐水性变化,在水中浸泡,每隔7 d观察一次。如图1所示,不同时间的成膜外观形貌有所变化,7 d（图1-B）和14 d（图1-C）成膜外观形貌变化较小,孔隙率变化也较小,基本没有溶于水。21 d后,成膜依旧平整,虽有部分损坏,但程度较小（图1-D）。直至35 d,破损面积和孔隙率变化没有明显增大（图1-F）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1浸水不同时间成膜稳定性光学显微镜照片
A：初始Initial;B：7 d;C：14 d;D：21 d;E：28 d;F：35 d
-->Fig. 1Optical microscope photographs of the formed membrane stability under retting different times (10×10)
-->
2.2 种衣剂优选配方及性能检测
参照40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂的优选配方及性能检测结果（表 1）,当成膜剂含量为5.00%时,40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂悬浮率为97.90%,高悬浮率可使有效成分的粒子均匀地悬浮在药液中的时间保持较长,在包衣过程中,药液浓度保持一致,均匀地包在种子上,较好地发挥药效。该水稻种衣剂成膜时间为12.00 min,成膜时间较短,有较好的成膜性;脱落率为3.25%,可以充分保持药效。水稻种衣剂的黏度为0.53 Pa·s,有较好的流动性,包衣均匀（包衣均度：88.23%）,致使分散性良好。热贮、冷贮稳定性、抗冻性良好,有效成分相对分解率<5%,种衣剂各项指标均达到悬浮种衣剂相关标准（表1）。Table 1
表1
表140%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂的优选配方及性能检测
Table 1The optimization formula of 40% thiamethoxam·pyraclostrobin flowable concentrate for seed coating and the performance test
| 组分 Component | 含量 Content (%) | 悬浮率Suspension rate (%) | 成膜时间 Film formation time (min) | 成膜性 Membrane stability | 包衣均度 Coating uniformity (%) | 分散性 Dispersion | 黏度 Viscosity (Pa·s) | 脱落率 Shedding rate (%) | 冷/热贮稳定性 Cold and thermal storage stability |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 噻虫嗪Thiamethoxam | 25.00 | 97.90 | 12.00 | Ⅰ | 88.23 | 良Good | 0.53 | 3.25 | Ⅰ |
| 吡唑醚菌酯Pyraclostrobin | 15.00 | ||||||||
| 快T Quick T | 0.50 | ||||||||
| FS3000 | 8.00 | ||||||||
| 黄原胶Xanthan gum | 0.12 | ||||||||
| 硅酸镁铝 Magnesium aluminum silicate | 0.30 | ||||||||
| 成膜剂 Film forming agent | 5.00 | ||||||||
| 皂土Bentonite | 0.50 | ||||||||
| 乙二醇 Ethylene glycol | 5.00 | ||||||||
| 海舒液体红2R Haishu Liquid Red 2R | 5.00 | ||||||||
| 水Water | 35.58 |
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2.3 不同浓度处理对种子萌发的影响
用40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂在1:200至1:25药种比下对水稻种子进行包衣处理,包衣均度和包衣效果随包衣药剂浓度增加而增加（图2）。当药种比1:200包衣时,由于种衣剂计量过少,致使包衣不够均匀。当药种比为1:25和1:50时,包衣效果最好,包衣均匀,颜色亮丽。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图240%噻虫嗪·吡唑醚菌酯悬浮种衣剂水稻种子包衣
-->Fig. 240% thiamethoxam·pyraclostrobin flowable concentrate for seed coating of rice seed
-->
对不同浓度处理种子萌发结果进行分析,在药种比1:200至1:50范围内包衣的种子发芽率随包衣药剂浓度增加而增高,无显著差异,但高于空白对照组23.26%—31.97%（表2、图3）。包衣浓度过高,不利于种子的萌发。当药种比为1:25时,发芽率降低了15.7%（图3）。除1:25药种处理, 其他处理与阳性对照迈舒平（1:75）没有显著性差异,当药种比为1:50时,较迈舒平（药种比1:75）发芽率提高了6.57%。对不同浓度处理下种衣剂对根长和白根数的影响结果进行分析,处理组的根长比对照组高3.41%—9.29%,无显著性差异;处理组的白根数比对照组的多7.5%—40.5%,但并无显著性差异（表2）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3种衣剂不同处理对水稻种子发芽率的影响
柱上不同字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
-->Fig. 3The effect of different treatments on germination rate of rice seed
Different letters on the bar indicated significant differences (P<0.05). The same as
-->
Table 2
表2
表2不同浓度处理对水稻种子的发芽率和生物量影响
Table 2Germination rate and seedling biomass of different treatments
| 处理 Treatment | 发芽率 Germination rate (%) | 株高 Plant height (cm) | 根长 Root height (cm) | 白根数（条） White root numbers | 叶数（片） Leaf numbers |
|---|---|---|---|---|---|
| CK | 68.80±4.03b | 18.99±0.40b | 8.50±0.42a | 11.93±0.51a | 2.93±0.08a |
| 1:25 | 58.00±3.29c | 18.19±0.44b | 8.42±0.39a | 14.97±0.38a | 3.00±0.00a |
| 1:50 | 90.80±2.06a | 20.22±0.43a | 9.29±0.30a | 16.77±0.28a | 3.00±0.00a |
| 1:75 | 87.60±1.94a | 18.93±0.41b | 8.14±0.41a | 15.27±0.34a | 3.00±0.00a |
| 1:100 | 87.60±1.17a | 18.39±0.19b | 9.01±0.41a | 16.77±0.21a | 3.03±0.03a |
| 1:200 | 84.80±1.02a | 18.28±0.38b | 8.79±0.55a | 12.83±0.52a | 2.93±0.08a |
| 迈舒平Maishuping | 85.20±2.15a | 18.48±0.56b | 9.38±0.42a | 15.63±0.41a | 3.03±0.03a |
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对不同浓度处理下种衣剂对株高影响结果进行分析,株高随着种衣剂浓度的增加呈现上升趋势,种衣剂对水稻幼苗株高具有一定的促进作用,当药种比高于1:50时,种衣剂对水稻幼苗表现抑制作用加强,株高降低（图4、图5）。在药种比为1:50时,种衣剂处理的水稻幼苗与对照具有显著差异,株高提高了6.48%,其他处理株高均低于对照,但与对照差异不显著,与1:50药种比处理存在显著差异（图6）。其他处理的根长、白根数及叶数相对于对照均有所增加,但是与对照组间的差异不显著（表2）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图440%噻虫嗪·吡唑醚菌酯悬浮种衣剂对水稻种子生长影响
-->Fig. 440% thiamethoxam·pyraclostrobin flowable concentrate for seed coating on the growth of rice seedling
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图540%噻虫嗪·吡唑醚菌酯悬浮种衣剂对水稻种子株高和根长影响
-->Fig. 540% thiamethoxam·pyraclostrobin flowable concentrate for seed coating on the plant height and root length of rice seedling (cm)
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6种衣剂不同处理对水稻幼苗株高的影响
-->Fig. 6The effect of different treatments on plant height of rice
-->
2.4 种衣剂对常规生理指标的影响
对水稻幼苗常规生理指标进行测定,结果表明使用种衣剂处理能促进秧苗生长、增强秧苗的抗逆性（表3）。种衣剂处理组药种比为1:50时,根系活力值远高于其他处理并差异显著,相比对照组提高了38.07%;叶绿素含量高于对照组143.02%,与对照组差异显著,其他处理组与对照组有一定差异,但不显著（图7）。种子包衣处理组游离脯氨酸含量均高于对照组,除迈舒平与对照组差异不显著外,其他处理组与对照组均具有显著差异,比对照组高28.74%—83.08%（表3）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7种衣剂不同处理对水稻幼苗叶绿素含量的影响
-->Fig. 7The effect of different treatments on chlorophyll contents of rice
-->
Table 3
表3
表3种衣剂对水稻种子秧苗常规生理指标的影响
Table 3Effects of seed coating agent on physiological ingredients of rice
| 处理 Treatment | 根系活力 Root activity (µg·g-1 FW·h-1) | 叶绿素 Chlorophyll contents (mg·g-1 FW) | 游离脯氨酸 Free proline accumulation (µg·g-1 DW) |
|---|---|---|---|
| CK | 63.75±0.08bc | 1.72±0.42b | 81.98±0.81c |
| 1:25 | 52.30±1.85c | 1.77±0.05b | 155.01±2.17a |
| 1:50 | 88.02±3.12a | 4.18±0.08a | 105.54±11.15b |
| 1:75 | 60.22±2.29bc | 1.67±0.02b | 120.62±4.62b |
| 1:100 | 74.17±5.52b | 1.64±0.12b | 111.66±2.72b |
| 1:200 | 63.8±9.13bc | 1.92±0.08b | 108.37±0.81b |
| 迈舒平 Maishuping | 70.87±1.15b | 2.34±0.39b | 85.28±0.54c |
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2.5 种衣剂对水稻幼苗抗氧化酶活性的影响
苗3叶期,测定不同药种比下40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯水稻悬浮种衣剂处理、对照处理和迈舒平处理秧苗内抗氧化酶含量,结果表明在药种比1:25—1:75时,相比较CK,SOD酶活性提高了19.13%—30.68%;种衣剂处理组POD酶活性低于CK,除药种比1:100外,其他处理与CK没有显著性差异;种衣剂处理组CAT酶活性低于CK,药种比1:25和1:50下具有差异外,其他处理与CK没有显著差异（表4）。总体来说,种衣剂对抗氧化酶活性影响不显著。Table 4
表4
表4不同处理对水稻幼苗叶片抗氧化酶活性的影响
Table 4Effects of different treatments on the antioxidant enzymes activity of rice seedling leaves
| 处理 Treatment | 超氧化物歧化酶活性 SOD activity (U·g-1 FW·min-1) | 过氧化物酶活性 POD activity (U·g-1 FW·min-1) | 过氧化氢酶活性 CAT activity (U·g-1 FW·min-1) |
|---|---|---|---|
| CK | 428.21±37.61bc | 230.00±2.90a | 64.69±5.70ab |
| 1:25 | 537.97±42.84a | 206.27±9.95ab | 46.67±6.05c |
| 1:50 | 559.61±22.30a | 183.00±28.04ab | 47.41±1.05c |
| 1:75 | 510.14±11.67ab | 186.60±26.14ab | 57.78±4.8abc |
| 1:100 | 425.12±13.48c | 160.07±16.52b | 68.89±8.98a |
| 1:200 | 388.02±14.75c | 216.27±12.04ab | 56.30±1.05abc |
| 迈舒平 Maishuping | 483.86±13.21ab | 214.07±7.36ab | 48.89±4.80bc |
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3 讨论
良好的成膜剂是使种衣剂牢固地附着在种子表面,减少农药在水中扩散的关键,且也能使药剂在苗期生长过程中缓慢释放,延长药剂的持效期。聚乙烯醇是市场上常用的成膜剂,经聚醋酸乙烯-乙烯共聚物改性的聚乙烯醇在水中24 h保持形态良好,显著改善了体系的耐水性[29]。本研究表明双丙酮丙烯酰胺-丙烯酸丁酯二元共聚物作为成膜剂,耐水性长达35 d以上,大大提高了成膜剂的耐水性及稳定性。相比较经聚醋酸乙烯-乙烯共聚物改性的聚乙烯醇的成膜剂,同样具有良好的成膜特性。通过对不同浸水时间成膜剂变化的比较,可以证明该膜在水中溶解性缓慢,耐水性良好,有较好的稳定性,为水稻苗期生长提供有力保障。种衣剂一般对作物种子具有一定的药害作用,降低了种子的发芽率以及种子活力,且种衣剂浓度越大影响越显著,但良好的种衣剂可以提高种子活力,达到增产增收的目的[30-31]。ZENG等[9]研究一种抗玉米丝黑穗病玉米种衣剂时发现该种衣剂可以有效提高作物的发芽率、根长和株长等,相比较传统化学种衣剂AMULET,作物产量提升11.6%—14.6%;胡凯军等[32]在通过研究不同种衣剂对燕麦苗期生长情况的影响、筛选最佳配比的种衣剂时发现低浓度能促进种子的萌发;YANG等[33]研究发现,包衣高浓度抑制种子发芽,当用2%戊唑醇湿拌种剂（立克秀,Ralix）3 g Al·kg-1计量包衣时,发芽率仅为4%,这与本研究结果一致。
根系活力是反映植物根系生理机能的重要指标,同时高的根系活力也是高产作物的一个显著特征[34]。袁传卫等[35]在研究不同浓度吡唑醚菌酯拌种对玉米种子的影响时发现在药种比2.5:10 000时,种衣剂能显著提高幼苗的根系活力,药种比高于2.5:10 000时,种衣剂对幼苗的根系活力抑制作用加强;DENG等[36]研究发现用4#-1种衣剂可以增加作物根系活力10%—13.64%。在本试验中,低浓度药种比处理的种子幼苗根系活力明显高于高浓度种衣剂处理种子的幼苗根系活力,同时明显高于CK,而高浓度处理的幼苗根系活力略低于CK,与前人的结果一致,可能是由于低浓度时该种衣剂对水稻幼苗的促进作用更强,随着浓度的增加,该种衣剂对水稻幼苗的抑制作用大于促进作用。
叶绿素对绿色植物的光合作用至关重要,它反映了植物的生长发育状况,其含量的高低直接影响到光合作用的强弱。REHMAN等[37]研究发现,经过种子包衣的水稻种子叶绿素增长3.15%—42.65%。本研究结果与之一致,处理组秧苗叶绿素含量高于对照组2.90%—143.02%,增强了植株光合能力,从而促进地上部干物质积累。
脯氨酸是最有效的渗透调节物质之一,它能提高细胞液浓度,降低其渗透势,保护原生质与环境的渗透平衡,防止水分散失,保护膜结构的完整性,从而提高植物对胁迫环境的适应性[38]。张海清等[23]研究抗寒种衣剂对水稻的抗寒影响和作用机理,发现水稻体内游离脯氨酸量增加了36.62%。在本研究中,处理组比对照组增加了28.74%—83.08%,大大提高了植株的抗逆性。
植物体内的SOD、POD、CAT等物质合称抗氧化酶,它们之间进行协同作用共同抵抗外界逆境对植物细胞的伤害,提高植物的抗逆性[39]。植物抗氧化酶系统起着防止植物细胞膜脂过氧化和维持体内活性氧动态平衡的作用,活性氧动态平衡若被打破则会促使膜脂过氧化[40-42]。TU等[43]研究芽孢杆菌种衣剂时发现,相比较空白对照,SOD含量提升了5.06%—11.68%,POD含量提升了5.13%—11.46%;刘西莉等[44]研究表明包衣后苗体 POX、CAT和SOD活性分别提高了3.43%—61.21%、44.24%—186.64%和72.61%—378.42%,增强植株对氧自由基的清除能力,从保护膜结构的完整性,增强秧苗的抗逆性能力。本研究结果表明SOD酶活性提高了19.13%—30.68%,POX、CAT处理组和对照组无显著性差异,对抗氧化酶无不良影响。
4 结论
40%噻虫嗪·吡唑醚菌酯悬浮种衣剂成膜性能好,成膜时间短,脱落率低,包衣均匀度高,耐水性好,悬浮率达97.9%,种衣剂各项指标均达到悬浮种衣剂相关标准。室内生物活性良好,低浓度下能促进种子的萌发和秧苗生长、增强植株的根系活力和抗逆性,对水稻种子安全,无不良影响。噻虫嗪和吡唑醚菌酯复配作为活性成分组合,可有效防治水稻苗期病虫害。The authors have declared that no competing interests exist.
