随着温室效应加剧,全球平均气温不断升高,高温天气频发。据报道,从1880年到2012年全球的平均地表温度增加约0.85℃,在可预见的未来气温还将继续升高（IPCC,2014）。小麦属于温带起源的喜凉作物,高温能够引起小麦叶片萎蔫、生长势减弱、育性降低并影响籽粒灌浆,使其产量下降,品质变劣。据预测,未来平均气温每升高1℃,全球小麦产量将减产约6%[1]。在中国,小麦籽粒灌浆期经常遭遇30℃以上的高温天气,特别是黄淮海和新疆等小麦主产区易形成干热风,其危害面积可达该区域小麦种植面积的2/3,使小麦减产10%—20%[2]。高温已经成为制约中国甚至世界小麦粮食生产的重大气候灾害之一,因此,鉴定小麦耐热材料,发掘优异等位变异并解析其耐热的遗传和分子调控机理,对培育小麦耐热品种具有重要的理论和实际应用意义。
高温对小麦不同发育时期性状影响不同：出苗至分蘖期,高温主要减少其分蘖数目;拔节至开花期,高温则导致单株穗数、穗粒数和千粒重等性状减少;开花后至成熟期,高温主要缩短灌浆期而使粒重降低并影响籽粒的品质性状[3]。FISCHER等[4]报道在拔节至开花期间,高温处理小麦,平均温度每升高1℃,籽粒产量下降3%—4%。WARDLAW等[5]报道灌浆期间,在15.8—27.7℃范围内,温度每升高1℃,能使灌浆时间缩短约3.l d,千粒重下降2.8 g。SOFIELD等[6]认为灌浆过程期间,如果温度超过30℃,淀粉和蛋白质的积累都受显著负面影响,但是淀粉的合成对高温更加敏感,使蛋白质相对含量提高,并且热敏感品种蛋白质含量增加的幅度（0.22%/天·40℃）显著高于耐热品种（0.13%/天·40℃）。进一步研究发现,高温胁迫没有影响灌浆期间小麦淀粉合成底物（蔗糖）的供应,灌浆速度减慢主要是由于抑制了淀粉合成相关酶的活性,降低了向淀粉的转化率,例如可溶性淀粉合成酶（SSS）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）和淀粉
分支酶（SBE）[7-9]。
高温胁迫也严重影响了小麦生长发育的生理生化特征,例如能够导致PSⅡ系统电子传递效率下降,热耗散不断增加,进一步加剧PSⅡ系统的损害[10-13]。此外,高温胁迫还会使植物体内的酶代谢失活,降低叶绿素的合成效率,引发氧化胁迫,加速叶绿素降解,从而导致植物叶绿素含量的减少,直接影响植物的光合作用[14]。研究显示,小麦在营养生长和生殖生长阶段高温处理7 d（32℃/27℃,昼/夜）,使其光合作用效率分别降低32%和11%,生物产量分别降低32%和15%[15]。苏德荫等[16]研究发现,在一定温度范围内（25℃—35℃）,小麦的呼吸作用随着温度的增加而增加,但是光合效率却急剧下降,34℃时净光合强度和呼吸强度几乎相等,导致植物体内无光合产物的积累。WARDLAW等[5]进一步研究表明,当温度从21℃/16℃（昼/夜）升高到30℃/25℃（昼/夜）时,由于呼吸作用的加强造成小麦25%产量损失。同时,高温对小麦的蒸腾速率也有重要的影响,但不同品种对高温的反应不一致,例如热敏感品种藁城8901、豫麦49和周麦18高温处理后,蒸腾速率与对照相比明显下降（47.3%、40.5%和53.4%）,而耐热品种郑麦9405的蒸腾速率较对照略有上升[17]。高温还会影响小麦的其他生理生化指标,例如郭洪雪等[18]对二叶期小麦叶片进行1、12、24和36 h高温处理,发现超氧化物歧化酶（SOD）活性及膜脂过氧化产物（MDA）含量呈现先上升后下降变化趋势,而可溶性糖含量一直呈现上升趋势。
1 小麦耐热性的遗传学基础
利用遗传改良培育耐热性小麦品种是抵御高温胁迫的有效措施。SUN等[19]首次利用膜热稳定测定法对硬粒小麦（Langdon）的耐热相关基因进行了染色体定位研究,发现其与染色体3A、3B、4A、4B和5A有关。徐如强等[20]对普通小麦品HOPE和中国春（CS）的研究则表明,耐热相关基因主要存在于第2和3部分同源群的染色体上。陈希勇等[21]以CS和HOPE染色体代换系为材料,发现在HOPE的2A、3A、2B、3B和4B染色体上均具有耐热相关基因位点。另外,孙其信等[22]发现异源细胞质对耐热性有显著影响,并存在显著的核质互作。随着分子标记技术的快速发展,利用生理学指标和热感指数,研究人员在小麦不同染色体上鉴定出多个耐热相关QTL位点。例如,以冠层温度为指标,PINTO等[23]利用Seri/Babax的167个重组近交系定位了16个与高温密切相关的QTL,能够解释28%的表型变异,发现位于4A和3B的QTL对高温和干旱同时有贡献;BENNETT等[24]利用RAC875/Kukri DH群体在3B染色体上发现了2个耐热相关QTL,能够解释高温条件下表型变异的22%;PALIWAL等[25]利用耐热品种NW1014和热敏感品种HUW468构建了148个重组自交系,定位了7BL的耐热相关QTL,其解释约20%的表型变异。以叶绿素含量和叶绿素荧光参数为指标,VIJAYALAKSHMI等[26]利用冬小麦耐热品种Ventnor和热敏感品种Karl92构建了重组近交系,在2A、3A、3B、6A、6B和7A染色体上分别鉴定到9、1、1、2、2和1个耐热相关QTL;利用Ventnor和Karl92的F2:3家系,YANG等[27]以灌浆持续时间为参数,检测到与之紧密连锁的2个QTL,分别能够解释表型变异的11%和12%。另外,TALUKDER等[28]利用GBS-SNP标记构建了重组近交系小麦遗传图谱,测量TMD（thylakoid membrane damage）、SCC（SPAD chlorophyll content）、PMD（plasma membrane damage）等生理指标,在基因组上共鉴定到5个QTL区域与高温抗性紧密相关,分别位于1B、1D、2B、6A和7A染色体上,其中TMD相关位点（6A、7A和1D）能够解释耐热性变异的11.9%—30.6%,SCC相关位点（6A、7A、1B和1D）能够解释耐热性变异的11.4%—30.8%,PMD相关位点（7A、2B和1D）能够解释耐热性变异的10.5%—33.5%。
以穗粒数及粒重热敏感指数为指标,MASON等[29]利用121个小麦重组近交系（Halberd×Karl92）在1B、5A和6D染色体上鉴定了14个QTL,能够解释表型变异的4.5%—19.3%;以Halberd和Cutter重组近交系为材料,MASON等[30]考察了产量、旗叶长度、旗叶宽度和蜡质含量的热敏感指数,在1A、2A、2B和3B染色体上定位了5个QTL位点,解释了9.8%—38.6%效应;以千粒重、灌浆时间和产量热敏感指数为指标,PALIWAL等[25]利用148个NW1014和HUW468的重组自交系在2B、7B和7D染色体上鉴定到4个与耐热相关的QTL区间,能够解释表型变异的7.21%—25.39%。李世平等[31]利用旱选10号和鲁麦14的DH群体对小麦幼苗耐热性QTL进行了分析,考察了高温胁迫前后苗的根干重、苗干重、幼苗生物量、叶片叶绿素含量、叶绿素荧光参数及其耐热指数等性状,发现控制幼苗耐热相关性状的QTL位点在2D、6B、3A、4A、5A和7A染色体上分布较多,而控制幼苗性状耐热指数的QTL在染色体6A、6B、3A、2D、5A和7A上分布较多,QTL位点在染色体上的分布有区域化的趋势。另外,利用相同材料,李世平等[32]对其灌浆期生理性状及千粒重耐热指数也进行了QTL定位分析,共检测到与耐热性相关的12个加性效应QTL和17对上位性效应QTL,分布在除1D、6D和7B以外的所有染色体上,其中染色体1B、2D、5A、5B、6A、6B和7A与灌浆期耐热性关系密切,这12个加性效应QTL对表型变异的平均贡献率为6.47%,17对上位性效应QTL的平均贡献率为4.66%。
小麦耐热性属多基因控制的数量性状,性状考察难度较大,其遗传学基础的研究相对滞后。近年来,研究人员利用耐热性具有差异的材料构建遗传分离群体,以冠层温度、灌浆持续时间、细胞膜稳定性和叶绿素含量等生理学参数,以及穗粒数和千粒重热感指数为指标,定位了多个与耐热性密切相关的QTL,分布在小麦不同染色体上。值得注意的是,多个遗传群体在第3部分同源群都定位到了耐热相关的QTL,说明其对小麦耐热性贡献比较稳定。这些研究为以后耐热相关QTL的聚合,指导小麦分子标记辅助育种奠定了坚实的基础。但是,可以清楚地看到,小麦耐热QTL的研究仍处在初步定位阶段,远未达到精细定位阶段,离候选基因克隆尚有一定的距离。鉴定稳定的耐热相关QTL,建立精细定位群体,利用新的分子标记技术对目标基因进行精细定位并克隆将会是未来小麦耐热性遗传研究的一个重要方向。
2 小麦耐热性的分子生物学基础
2.1 小麦高温信号感知与传导
植物固着生长,遇到高温胁迫时不能迅速移动躲避,因此为了适应环境变化而进化出了多种分子机制来调节自身的生长发育。植物细胞对高温刺激的感受和传递是引起保护性响应并产生耐热性的关键步骤,虽然目前没有关于植物感受高温的传感器系统的报道,细胞膜流动性和钙离子信号途径与感受和传递高温信号密切相关。王飞等[33]以小麦耐热基因型TAM107和热敏感基因型CS为材料,发现高温胁迫后,TAM107的细胞膜稳定性显著高于CS,同时,作为耐热指示性脂肪酸的C18:3含量在TAM107的下降比例（39.84%）显著高于CS（28.28%）,说明耐热小麦品种的膜系统较热敏感品种对高温逆境有较强的耐受性。另外,李利红等[34]在小麦灌浆期间叶面喷施CaCl2可保护D1蛋白,提高光系统Ⅰ和Ⅱ的电子传递速率和全链电子传递速率,同时提高净光合速率和最大光化学效率,使小麦适应高温等环境。脱落酸（ABA）是植物响应非生物胁迫最重要的一种植物激素,在遭受高温时,植物体内都会迅速积累大量的ABA,启动下游耐热相关基因如热激蛋白,从而使植物抗逆性增强[35]。CAMPBELL等[36]在小麦幼苗克隆到2个热激蛋白基因（TaHSP101B和TaHSP101C）,它们的表达受到高温和ABA刺激的诱导表达。杨东清等[37]发现高温环境下外源喷施ABA能够降低GA3含量,提高小麦灌浆速率,提高了籽粒胚乳细胞增殖速率,扩大胚乳细胞数目,最终提高小麦的耐热性。另外,SEARS等[38]报道通过筛选对ABA不敏感的突变体能够提高小麦耐高温的能力,进一步说明了ABA对小麦耐热性的贡献。水杨酸（salicylic acid,SA）也广泛参与了植物对高温胁迫的响应[39]。当植物体遭受外界胁迫刺激时,活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平会升高,其过量积累就会引起细胞的氧化胁迫。水杨酸主要通过激活抗氧化胁迫相关基因,清除活性氧分子来提高植物的耐热性[40-41]。在小麦叶片上外源施加SA可以诱导抗氧化酶APX和SOD的活性,提高高温胁迫下对活性氧的清除能力,同时能够增加体内游离脯氨酸的积累,改善渗透调节能力,最终提高小麦的耐热性[42]。
2.2 小麦高温胁迫响应的转录组分析
植物应对高温胁迫的响应过程中,大量基因都会发生差异表达。利用高通量的组学方法可以从总体上揭示基因表达对高温胁迫的响应规律。QIN等[43]利用小麦基因芯片对TAM107和CS在高温胁迫下的转录表达谱进行了分析,鉴定到6 560个高温胁迫响应的探针,其中,剧烈响应探针主要编码热激蛋白和热激转录因子、铁蛋白、GA调节蛋白等,并发现光合作用相关基因在CS中下调更剧烈,暗示热敏感品种CS在高温胁迫下光合作用受到了严重抑制,而部分编码泛素蛋白、核糖体蛋白、泛素激活酶的基因在TAM107中被特异上调表达,这些差异可能是造成这两个品种耐热性差异的原因之一。SZUCS等[44]利用寡核苷酸基因芯片研究了小麦品种Plainsman V和Cappelle Desprez在干旱胁迫和旱热共胁迫的籽粒转录组响应,分析显示干旱胁迫只造成大约0.5%的基因发生差异表达,而旱热共胁迫下差异表达基因的数目增加到5%—7%,且贮藏蛋白基因、淀粉代谢相关基因以及胚和胚乳发育有关基因只在旱热共胁迫下表现出显著差异表达。
LIU等[45]利用高通量测序对TAM107和CS进行了高温、干旱和旱热共胁迫下的苗期叶片转录组测序,虽然3种胁迫下差异表达基因都显著富集在逆境胁迫相关代谢途径（如“response to water deprivation”、“heat acclimation”、“response to wounding”）,但仍然有1 738（16%）和2 482（23%）个基因特异受旱热共胁迫诱导上调和下调表达。另外,作者发现部分耐热相关基因在染色体上成簇分布,而且成簇分布的基因编码功能类似的蛋白,但是这些基因的时空表达模式存在差异,这可能是小麦在长期进化过程中通过基因复制形成的。进一步分析发现,小麦苗期叶片中有49%的基因其A、B、D部分同源基因在胁迫条件下表达模式发生了显著分化,而且胁迫越剧烈,A、B、D部分同源基因表达分化程度也越高,这种部分同源基因差异表达可能有利于小麦更好地适应高温胁迫。
2.3 小麦高温胁迫响应的蛋白质组分析
蛋白质组学是以基因组学和高通量蛋白质分析技术为基础发展起来的一门新兴学科,可以大规模分析差异表达的蛋白质组分。SKYLAS等[46]以耐热品种Fang和热敏感品种Wyuna为材料,利用双向凝胶电泳进行高温胁迫前后的小麦胚乳蛋白质组进行分析,结合质谱鉴定了48个处理前后差异表达的蛋白点,其大多数是小分子热激蛋白,并且有7个蛋白点只在耐热品种中表达。MAJOUL等[47]利用双向凝胶电泳结合质谱分析研究了高温对小麦籽粒醇溶蛋白表达的影响,鉴定到37个受高温胁迫后差异表达的蛋白点,进一步分析发现25个蛋白受高温诱导上调表达包括6个热激蛋白,另外只有1个葡萄糖-6-磷酸腺苷酰转移酶下调表达。同时,作者对高温胁迫下非醇溶蛋白的变化进行了分析,发现43个高温胁迫响应蛋白,其中24个上调表达,19个下调表达。这些差异表达的蛋白涉及到淀粉合成,碳水化合物代谢,ATP合成以及翻译起始的因子[48]。KAMAL等[49]利用China-108、Yeonnon-78、Norin-61和Kantou-107 4个小麦品种鉴定到124个逆境胁迫响应蛋白,其中39个（31.56%）蛋白受高温诱导表达,包括热激蛋白、热激转录因子、GTP结合蛋白、β淀粉酵素、颗粒结合淀粉合成酶、延伸因子等。LAINO等[50]为了研究高温对硬粒小麦蛋白质的影响,以Svevo为材料,利用双向凝胶电泳结合质谱分析对其灌浆期间的非醇溶蛋白进行了分析,发现132个多肽在高温胁迫前后差异表达,其中47个通过质谱得到了进一步验证,包括热激蛋白、糖酵解和碳水化合物代谢相关蛋白以及胁迫相关蛋白等。WANG等[51]利用耐热品种810和热敏感品种1039进行高温胁迫前后叶片蛋白质组学分析,发现高温胁迫后,光合作用相关蛋白、糖酵解相关蛋白、热激蛋白和ATP产生相关蛋白在2个小麦品种中都存在差异表达。与热敏感品种相比,耐热品种中信号转导、热激蛋白、光合作用和抗氧化相关蛋白上调表达,氮素转运相关蛋白下调表达。2.4 小麦高温胁迫响应的表观遗传组学分析
表观遗传学是近年来的研究热点,指在DNA序列没有发生变异的情况下,基因表达发生可遗传的改变,主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和小分子RNAs调控等来实现,它在调节植物生长发育和响应逆境胁迫等方面发挥了重要作用。GARDINER等[52]利用亚硫酸盐测序方法从全基因组水平上鉴定了小麦的DNA甲基化水平,发现温度升高能够影响40个位点的修饰水平发生改变,并且发现20个基因的表达水平和DNA甲基化水平同时发生改变,暗示着高温引起的基因表达变化可能与DNA甲基化密切相关。利用抑制DNA甲基化试剂5-azacytidine处理耐热材料TAM107、冀麦5265和热敏感材料CS,刘建[53]通过观察萎蔫程度和测定细胞膜稳定性发现,降低DNA甲基化后能显著提高小麦耐热性。同时利用RNA-seq对5-azacytidine试剂处理并高温胁迫的TAM107苗期叶片进行了转录组测序,结合已发表的分析的高温胁迫转录组数据和小麦甲基化数据[45,52],发现DNA甲基化抑制剂从全基因组水平上改变了高温响应的基因数目、种类及功能类别,而且差异表达的基因中约37%的基因可能存在DNA甲基化位点。进一步分析发现,高温胁迫响应的小麦部分同源基因（51%）的表达分化模式也受到5-氮杂胞苷处理的影响,证明DNA甲基化在抵御高温过程中发挥着重要作用[53]。非编码RNA是指不能编码蛋白质的RNA,包括
长片段非编码RNA和小分子RNA。XIN等[54]开展了高温胁迫响应的小麦长片段非编码RNA的相关工作,利用耐热小麦品种TAM107在全基因组水平上鉴定出125个长片段非编码RNA,其中77个在高温胁迫前后差异表达,并且乙酰化修饰水平的改变与部分高温响应的长片段非编码RNA的差异表达密切有关。另外,通过生物信息学分析发现部分长片段非编码RNA是通过产生小分子RNA行使功能。因此,作者又利用Solexa高通量测序技术对高温胁迫前后的小RNA表达谱进行了分析,筛选出32个高温胁迫前后差异表达的miRNA,发现同一家族的不同miRNA成员表达在高温胁迫前后也存在分化[55]。WANG等[56]发现miR159在高温胁迫以后显著下调表达,并且其调控的靶基因TaGAMYB上调表达,在水稻中超表达小麦TamiR159显著降低了其耐热性,暗示miR159-TaGAMYB途径在响应小麦高温胁迫过程中发挥着重要的作用。另外,组蛋白乙酰化修饰水平也可能与小麦耐热性密切相关。HU等[57]报道了拟南芥AtGCN5突变以后耐热性明显降低,而其小麦同源基因能够恢复拟南芥突变体的耐热性。ChIP分析结果表明GCN5能够显著富集在HSFA3和UVH6的启动子区域,有利于H3K9和H3K14的乙酰化,从而提高响应基因的表达水平。
随着组学技术的发展,人们发现高温胁迫通过转录水平、翻译水平和代谢水平广泛地影响了植物的生长发育。相应地,植物中大量高温胁迫响应基因被鉴定出来,通过功能富集分析发现,这些基因除了富集在逆境响应途径,激素和表观遗传修饰途径也参与了植物抵御高温胁迫的过程。XIN等[54-55]关于miRNA和长片段非编码RNA的研究,刘建[53]关于DNA甲基化的研究以及HU等[57]对组蛋白修饰的研究进一步证明了这一推断。然而在很长一段时间,由于小麦转基因技术的不完善,候选基因的功能验证成为解析小麦耐热分子机理的瓶颈,许多研究人员只好利用拟南芥等模式植物进行功能验证,但是双子叶植物拟南芥和单子叶植物小麦具有很大的差异,而且参与小麦耐热响应的许多基因在拟南芥中不存在同源基因,因此,在研究中具有很大的局限性,这也是导致小麦耐热分子机理研究滞后的重要原因之一。
3 结论与展望
高温胁迫已经成为限制小麦生产的重大气候灾害之一,其耐热性的遗传改良成为生产中急需解决的重大科学问题,因此,搜集、评鉴并再利用小麦耐热遗传材料,研究小麦耐热的生理学、遗传学和分子生物学基础,实现品种耐热性与高产的统一,已成为小麦研究中的热点和难点。中国是小麦资源大国,拥有种质资源4.3万份,但是对耐热种质资源没有系统评价以及耐热优异等位基因的发掘。以前小麦资源的收集、引进、筛选和创新再利用的研究主要以高产抗病为主,对高温胁迫影响缺乏深刻的认识,研究的深度、广度不够,限制了育种中抗逆亲本有针对性地选择利用,难以满足小麦生产发展的需要;另外,没有建立简单易行的稳定评价指标,尚未形成标准的小麦耐热性评价体系,加大了小麦耐热研究的困难;同时耐热相关基因的分子标记开发不够,难以通过基因聚合为辅助育种改良小麦耐热性提供有效的帮助,所以未来急需建立标准的小麦耐热性评价标准,开展中国耐热小麦品种资源评价及耐热相关基因分子标记的开发和应用。
在基础研究方面,目前,在水稻和拟南芥中相继图位克隆了耐热基因,但是鉴于小麦基因组的庞大和复杂,虽然研究人员通过构建遗传连锁群体,以不同农艺性状和生理性状为指标,定位了多个耐热相关的QTL并开发了与之紧密连锁的分子标记,但迄今为止尚未见小麦耐热QTL的克隆报道,使得小麦耐热性的遗传学基础研究与其他植物相比相对落后。同时,由于转基因等生物技术在小麦研究中应用的滞后,基因在小麦抵御高温胁迫中的功能验证也一直停滞不前,小麦耐热的分子生物学基础研究也相对薄弱。但是近几年,随着小麦基因组信息的逐渐完善和分子标记技术的飞速发展,例如小麦660K、90K芯片的开发和利用以及BSA-RNA-seq的应用使得耐热相关QTL的定位会更加精确,为基因的克隆提供了技术支持。另外,日本烟草公司农杆菌介导的小麦转基因技术的引进和中国基因枪技术转化小麦效率的提高打破了这种限制,同时CRISPR-Cas9技术的发展为小麦基础研究提供了技术支持,以上的技术和信息储备令小麦耐热功能基因组研究和结构基因组研究迎来了一个巨大的机遇和挑战。如果能够加强小麦耐热材料的评价、优异等位基因的筛选、耐热遗传学和分子生物学研究领域的投入,不仅能够使中国在相关的基础研究取得世界领先地位,同时可以为中国小麦耐热性的遗传改良提供数据基础和技术支持,对保障中国小麦高产稳产具有重要理论和实践意义。
The authors have declared that no competing interests exist.
