甘蓝型油菜polCMS育性恢复位点的全基因组关联分析

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魏大勇, 谭传东, 崔艺馨, 吴道明, 李加纳, 梅家琴, 钱伟. 甘蓝型油菜polCMS育性恢复位点的全基因组关联分析[J]. , 2017, 50(5): 802-810 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.003
WEI DaYong, TAN ChuanDong, CUI YiXin, WU DaoMing, LI JiaNa, MEI JiaQin. Genome-Wide Association Study of the Fertility Restorer Loci for pol CMS in Rapeseed (Brassica napus L.)[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2017, 50(5): 802-810 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.003

0 引言

【研究意义】雄性不育在植物界普遍存在,早在1763年,德国植物学家KÖLREUTER观察到雄性不育现象。目前,雄性不育主要包括由线粒体基因和核基因共同控制的细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）和由核基因单独控制的细胞核雄性不育（genic male sterility,GMS）两种^[1]。油菜是世界上继大豆和油棕之后的第三大油料作物,菜油是中国主要食用油之一。作为第一个有实用价值的油菜细胞质雄性不育类型,波里马细胞质雄性不育（Polima CMS）已被广泛应用于油菜杂交种的制种^[2]。早前关于甘蓝型油菜pol CMS恢复基因的研究多数是基于分离群体构建的连锁图谱进行QTL定位,费时费力。随着甘蓝型油菜参考基因组的释放和高通量测序成本的不断降低,新型技术比如高通量SNP芯片的出现,加快了候选基因识别的进程。因此,本研究通过全基因组关联分析快速挖掘影响pol CMS的育性恢复位点,对加快杂种油菜的育种进程具有重要现实意义。【前人研究进展】由于pol CMS在油菜育种中的广泛应用,恢复基因（Rfp）的定位越来越受到关注。前人对育性恢复性状的遗传分析说明,该性状受1对显性基因控制^[3]。由于在白菜型油菜（AA）、芥菜型油菜（AABB）和甘蓝型油菜（AACC）中都发现了Rfp,因此,推测Rfp可能位于A组染色体^[4]。蔡强^[5]通过连续回交构建的pol CMS育性恢复基因近等基因系群体,将与恢复基因连锁的标记定位在N9连锁图上,位于分子标记pW123bE和CNU008之间;LI等^[6]找到一个与Rfp遗传距离为0.2 cM的SSR标记KBrDP1,并与DH系遗传连锁图整合,将Rfp定位在9号连锁群上;LIU等^[7]将pol CMS育性恢复位点定位在白菜（B. rapa）的A09染色体29.2 kb内,并预测区间内一个开放阅读框ORF2为候选位点;LIU等^[8]验证了上述开放阅读框ORF2,并且发现ORF2是通过减少orf224的表达来恢复油菜pol CMS的育性。截止到目前,已在七大作物中克隆了13个植物育性恢复基因,分别为玉米的Rf2^[9-10],矮牵牛的Rf-PPR592^[11],萝卜的Rfo和Rfkl^[12-14],水稻的Rf1a (Rf5)^[15-18]、Rf1b^[18]、Rf2^[19]、Rf17^[20]、Rf4^[21]和Rf6^[22],高粱的Rf1^[23],甜菜的Rf1（bvORF20）^[24-25]以及甘蓝型油菜的ORF2^[8]。除了玉米的Rf2、水稻的Rf17和甜菜的Rf1外,其他10个恢复基因的编码蛋白都含有PPR（pentatrieopeptide repeat）基序。PPR基序是由SMALL和PEETERS于2000年发现和命名的,由35个氨基酸组成的序列单元经串联重复排列而成的一个基因家族^[26]。大部分PPR蛋白N端具有线粒体和叶绿体定位序列,是研究植物核质互作的理想模型^[27]。目前研究倾向于认为,恢复基因的功能是通过抑制线粒体基因组中CMS相关嵌合基因的表达,来抑制或消除雄性不育的毒害效应,但是具体机制仍不清楚。由于多个物种的恢复基因中存在PPR保守基序,因此,PPR特征可以作为鉴定植物恢复基因候选基因的有效手段。【本研究切入点】尽管油菜pol CMS育性恢复主效基因已被鉴定,但育性恢复仍存在微效多基因的影响,因此,本研究采用pol CMS系301A作母本,与308份甘蓝型油菜自然群体分别进行杂交得到308份F₁,通过甘蓝型油菜自然群体（测交父本）的SNP芯片数据对308份F₁的育性等级进行全基因组关联分析。【拟解决的关键问题】本研究通过GWAS期望寻找更多的甘蓝型油菜pol CMS育性恢复位点或基因（包括微效基因）,并通过等位基因或单体型效应分析,寻找与育性相关的SNP位点,为以后的功能标记开发奠定基础,应用于该不育系统恢复系和保持系的筛选鉴定。

1 材料与方法

1.1 供试材料和表型测定

甘蓝型油菜pol CMS 301A作母本,与308份不
同来源的甘蓝型油菜分别杂交产生308份F₁,分别于2013年和2014年播种在重庆市油菜工程技术研究中心试验地（重庆北碚）,3行区播种,每行10株,每年2次重复。于始花期（每个株系有一半植株至少开花3朵）观察5株长势一致F₁植株的花粉育性和雄蕊/雌蕊发育情况,统计每个F₁的育性等级用于后续分析。同时也记录了始花期当天和前10天的日平均温度。参考杨光圣等^[4]方法,根据花粉的多少和雄蕊/雌蕊发育情况划定材料育性等级：1级,花药发育正常,大量花粉;2级,花药发育基本正常,中量花粉;3级,花药退化成三角形,雄蕊低于雌蕊,少量花粉;4级,花药退化成三角形,雄蕊明显低于雌蕊,极少花粉;5级,花药退化成三角形且呈乳白色,雄蕊明显低于雌蕊,没有花粉。其中1级和2级为可育,4级和5级为不育,3级为部分可育（图1）。

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图1308份甘蓝型油菜F₁的育性等级
-->Fig. 1The fertility of 308 F₁ plants in B. napus
-->

1.2 SNP基因型分型和数据过滤

于苗期选择鲜嫩叶片提取总DNA,提取及纯化使用TIANGEN^®植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）,浓度最后统一稀释成100 ng·μL^-1,-20℃保存备用。采用Illumina公司开发的Brassica 60K SNP芯片对上述材料进行基因型分型^[28]。将芯片数据得到的52 157个SNP位点与法国公布的甘蓝型油菜品种“Darmor- Bzh”的基因组v4.1（http://www.genoscope.cns.fr/ brassicanapus/data/）进行本地BLASTN,比对的阈值设为e^-10。比对结果参考SCHIESSL等^[29]的条件过滤：序列一致性（identity）>95%,没有gaps,比对长度（alignment length）>49 bp。

1.3 群体结构和亲缘关系评估

群体结构分析采用STRUCTURE v2.3.4^[30],亚群数目k设置为1到9 ,5次模拟运算,蒙特卡罗迭代（MCMC）和模拟参数迭代（length of bum in period）都设置为1?10⁵次循环,在混合模型和频率相关模型下进行独立运算。最后输出的k值通过后验概率值结果LnP (D)和2个连续的后验概率值的变化速率Δk来矫正并确定群体中存在的最优类群数目^[31]。数据的可视化通过基于R语言的SelectionTools包（http://www. uni-giessen.de/population-genetics/downloads）来实现。利用SPAGeDi v1.4软件^[32]对甘蓝型油菜自然群体进行亲缘关系（relative kinship）评估。

1.4 全基因组关联分析和候选基因预测

利用R语言的GenABEL包进行GWAS分析^[33],采用PCA + K的混合线性模型对性状和标记进行关联位点的检测,阈值设定为P<4.25×10^-5（1/所使用的标记,-log₁₀^p= 4.37）。结果通过Manhattan图和Q-Q图显示^[34]。通过R语言的p.adjusted命令计算假阳性率（false discovery rate,FDR）。将显著SNP位置左右各延伸100 kb或者与显著SNP处于同一单体型块（R²>0.5）的区间,定义为候选关联区间,在此区间参考以下条件预测候选基因：1）在甘蓝型油菜或拟南芥参考基因组上与性状相关的已知功能的基因;2）SNP直接落在基因内部;3）参考已报道QTL定位的结果。
每个SNP或单体型解释的表型变异采用SAS软件的proc glm进行计算,所用模型为y = geno,其中,y为表型观测值,geno为SNP或单体型的基因型。

2 结果

2.1 甘蓝型油菜F₁的育性等级分析

前期研究发现,pol CMS系301A属于低温敏感型,持续低温易形成微粉,所有父本材料不受环境影响,都正常可育。301A与308份正常可育的甘蓝型油菜分别杂交所得F₁,育性调查结果方差分析显示,两年的F₁育性等级存在显著差异（P<0.01）,说明环境对育性有一定的影响。但相关分析发现,两年的育性等级存在显著的正相关（r = 0.52,P<0.01）（图1）。考虑到pol CMS系301A对温度的敏感,记录调查育性等级当天及前10天的日平均温度,相关性结果显示,育性等级与始花期前10 d的日平均温度存在显著的负相关（r=-0.41—-0.20,P<0.01）,但和始花期当天的日平均温度没有显著的相关性（r₂₀₁₃=-0.039,P₂₀₁₃=0.338;r₂₀₁₄=-0.082,P₂₀₁₄=0.526）,说明该育性恢复位点受雄蕊分化期间温度的影响但不受调查时温度的影响（电子附表1）。
Table 1
表1
表1附表1供试材料及表型数据
Table 1Supplementary Table 1List of rapeseed accessions used in this study

可育父本编号 Fertility male parents accession	生态型 Ecotype	2013年育性等级 Fertility levels in 2013	2013年始花期当天的日平均温度 Daily average temperature of beginning flowering in 2013 (℃)	2013年始花期前10天的日平均温度 Daily average temperature 10 days ages from beginning flowering in 2013	2014年的育性等级 Fertility levles in 2014	2014年始花期当天的日平均温度 Daily average temperature of beginning flowering in 2014 (℃)	2014年始花期前10天的日平均温度 Daily average temperature 10 days ages from beginning flowering in 2014
Bn-197	W	2	20	15.6	2	16	15.3
Bn-188	W	2	20	15.6	1	18	16.5
Bn-180	W	2	14.5	13.7	1	15.5	16.8
Bn-203	W	3	14.5	13.7	1	16.5	16.9
Bn-056	W	3	20	14.1	5	17	14.4
Bn-075	W	3	20	14.1	3	16.5	15
Bn-200	W	2	20	15.6	2	16.5	15
Bn-129	W	4	20	14.1	5	16.5	15
Bn-041	W	2	20	14.1	2	19.5	16
Bn-067	W	4	20	14.7	4	16	15.3
Bn-139	W	3	20	14.1	4	16.5	15
Bn-070	W	2	14.5	13.7	2	16	15.3
Bn-141	W	2	13	11	4	16	16.9
Bn-016	W	3	20	14.7	4	15.5	14.9
Bn-079	W	2	20	15.6	4	19.5	16
Bn-017	W	3	20	15.6	2	18	16.5
Bn-198	W	2	20	14.1	5	16.5	15
Bn-147	W	2	20	14.7	4	17	14.4
Bn-185	W	2	20	15.6	3	16	16.9
Bn-183	W	4	20	14.1	5	17.5	14.9
Bn-027	W	4	20	15.6	4	18	16.5
Bn-174	W	3	14.5	13.7	2	18.5	15.5
Bn-064	W	2	11	10.7	2	19.5	16
Bn-191	W	2	14.5	13.7	1	15.5	14.9
Bn-199	W	2	13	15.5	5	18.5	15.5
Bn-137	W	2	12.5	16.3	4	16.5	15
Bn-160	W	2	12.5	16.3	4	18.5	15.5
Bn-158	W	3	12.5	16.3	3	16	16.9
Bn-213	W	3	12.5	16.3	2	18	16.5
Bn-172	W	2	12.5	16.3	2	16.5	15
Bn-103	W	2	20	14.1	4	16	16.9
Bn-133	W	4	12	11.3	4	15.5	14.9
Bn-121	W	3	20	14.1	1	18	16.5
Bn-168	W	2	12	16.1	2	15.5	14.9
Bn-156	W	3	20	14.7	3	18	16.5
Bn-119	W	5	20	14.1	3	16.5	15
Bn-120	W	3	20	15.6	5	18	14.4
Bn-134	W	2	12	16.1	4	18	16.5
Bn-054	W	2	17.5	13.7	1	16.5	15
Bn-012	W	3	17	12.1	3	20.5	14.6
Bn-044	W	5	13	11	4	16.5	15
Bn-015	W	4	20	10.9	4	16	16.9
Bn-078	W	2	17.5	13.7	2	15.5	14.9
Bn-028	W	3	16	11.7	3	19.5	16.7
Bn-040	W	2	17.5	13.7	5	18.5	15.5
Bn-008	W	2	17.5	13.7	5	16.5	15
Bn-072	W	2	15.5	12.7	4	21	16.8
Bn-052	W	2	14.5	13.7	3	15.5	14.9
Bn-059	W	4	12	11.3	4	20.5	14.6
Bn-085	W	3	20	14.1	2	16.5	15
Bn-061	W	2	15.5	12.7	4	17	14.4
Bn-038	W	2	24	19.2	4	16.5	16.9
Bn-001	W	3	20	15.6	4	17.5	16.8
Bn-086	W	3	14.5	13.7	3	16.5	16.9
Bn-002	W	3	20	14.1	5	17.5	14.9
Bn-018	W	3	20	14.1	3	16.5	16.9
Bn-045	W	2	20	15.6	1	18	16.5
Bn-053	W	2	12	16.1	5	17	14.4
Bn-023	W	2	12	15.8	3	17.5	16.9
Bn-055	W	3	12.5	16.3	1	18.5	15.5
Bn-202	W	3	17.5	13.7	3	18	16.5
Bn-186	W	2	20	14.1	2	19.5	16.7
Bn-031	W	3	14.5	13.7	3	18	16.5
Bn-107	W	2	17.5	13.7	1	19.5	16.7
8Q 263	W	2	16	11.7	5	16	14.9
8Q 265	W	2	12	15.9	1	15.5	14.9
8Q 264	S	3	13	10.8	3	17	16.8
Bn-311	S	3	13	10.8	5	18.5	16
Bn-395	S	3	13	10.8	5	19.5	14.4
Bn-273	S	2	12	11.3	3	15.5	14.9
Bn-320	S	2	11	16.2	3	17.5	16.5
Bn-238	S	1	12	10.7	3	16.5	16.9
Bn-364	S	2	13	10.8	3	15.5	14.9
Bn-245	S	2	13	11.4	2	21	16.8
Bn-274	S	2	16	11.7	4	17	16.8
Bn-279	S	2	17	12.1	2	19.5	16.7
Bn-343	S	1	13	11.4	1	18	16.5
Bn-309	S	3	12	10.7	5	17.5	14.9
Bn-316	S	2	12	11.3	5	16.5	15.3
Bn-269	S	3	12	9.4	4	16.5	16.9
Bn-339	S	4	12.5	13.5	4	18.5	16
Bn-361	S	2	12	11.3	5	15.5	15.3
Bn-400	S	2	12	10.8	5	19.5	14.4
Bn-392	S	2	12	10.7	2	18.5	16
Bn-275	S	3	12	10.8	5	16	14.9
Bn-328	S	4	12	9.4	5	18	15.5
Bn-348	S	1	17	12.1	1	21	16.8
Bn-355	S	4	12	10.7	3	15.5	15.3
Bn-291	S	2	11	10.7	4	15.5	15.3
Bn-335	S	2	12	11.3	3	21	16.8
Bn-334	S	3	13	10.8	1	16.5	16.9
Bn-366	S	2	12.5	9	4	19.5	16.7
Bn-248	S	4	12	9.8	4	18	15.5
Bn-313	S	3	12	7.2	3	19.5	16.7
Bn-330	S	3	13	11	3	16.5	16.9
Bn-360	S	2	12	11.3	1	19.5	16.7
Bn-292	S	4	12.5	9	5	18	15.5
Bn-340	S	5	15.5	12.7	2	17.5	16.5
Bn-359	S	2	12.5	13.5	4	16.5	16.9
Bn-363	S	3	13	13.7	2	21	16.8
Bn-365	S	3	12	10.8	4	17.5	16.5
Bn-376	S	2	13	11	2	19.5	16.7
Bn-483	S	2	12	10.8	4	18	15.5
Bn-299	S	4	12	11.3	5	16	15
Bn-342	S	3	11	10.7	5	18.5	16
Bn-350	S	3	13	11	5	16	15
Bn-323	S	2	13.5	11.4	5	17	14.6
Bn-314	S	3	12.5	9	3	16	15
Bn-290	S	4	11	10.7	5	18	15.5
Bn-333	S	2	13	11.4	1	20.5	16.9
Bn-289	S	2	16	11.7	5	16	15
Bn-281	S	2	13	10.8	3	16	16.9
Bn-240	S	2	13	10.8	3	16	16.9
Bn-259	S	4	20	14.7	4	17	16.8
Bn-283	S	3	16	11.7	4	17.5	16.5
Bn-393	S	2	11	12.5	3	18	15.5
Bn-357	S	2	13	11	4	16	16.9
8Q 268	S	3	12	9.8	4	16	16.9
8Q 269	S	4	12	10.8	5	16.5	15.3
8Q 271	S	3	13	10.8	3	19.5	14.6
8Q 272	S	2	16	11.7	5	18	15.5
Bn-322	S	2	16	11.7	4	16	16.9
9w237	SW	3	9.5	5.8	3	17.5	16.5
9w238	SW	1	12	11.3	2	15.5	15.3
9w239	SW	1	13	11	1	17	16.8
9w240	SW	1	12.5	16	2	15.5	15.3
9w241	SW	1	12	12	1	16.5	16.9
9w242	SW	1	12	10.7	1	16.5	16.7
9w243	SW	1	12	10.8	2	21	16.8
9w244	SW	3	13	11	5	18.5	16
9w245	SW	1	13	11	1	16.5	16.8
9w246	SW	1	12	13.8	1	17.5	16.5
9w247	SW	3	12	11.3	5	18.5	16
9w248	SW	4	12	9.4	5	19.5	14.6
9w249	SW	3	16	11.7	4	17.5	16.5
9w251	SW	1	16	11.7	2	19.5	16.7
9w252	SW	1	12	10.8	1	19.5	16.7
9w253	SW	2	16	11.7	5	15.5	15.3
9w255	SW	5	11	10.7	5	17	14.6
9w256	SW	1	13	10.8	1	14.5	16.7
9w257	SW	2	13	10.8	4	18.5	15.1
9w259	SW	4	13.5	11.4	4	19.5	16.7
9w261	SW	1	16	11.7	1	15.5	15.3
9w262	SW	3	12	11.3	5	20.5	15.3
9w263	SW	3	17	12.1	5	20.5	15.3
9w264	SW	1	13	11	1	15.5	15.3
9w266	SW	1	13	10.8	1	16.5	16.8
9w267	SW	3	16	11.7	5	18	15.5
9w268	SW	3	12	11.3	5	18.5	15.3
9w269	SW	4	17	12.1	3	18	15.5
9w270	SW	1	12	10.8	1	18	15.5
9w271	SW	4	12	10.8	4	18.5	15.1
9w272	SW	2	16	11.7	5	16.5	14.9
9w273	SW	5	12	10.8	4	15.5	15.3
9w274	SW	4	12	9.8	5	16.5	14.9
9w275	SW	2	11.5	10.3	5	16	15
9w276	SW	1	16	11.7	2	16	15
9w277	SW	3	11.5	10.3	5	18	15.5
9w279	SW	5	13.5	11.4	4	19.5	16.7
9w280	SW	2	11	12.1	5	18	15.5
9w281	SW	4	13	11	5	15.5	15.3
9w282	SW	4	13	11	5	19.5	14.4
9w283	SW	3	11	10.7	5	16.5	14.9
9w284	SW	3	13.5	11.4	5	16.5	14.9
9w285	SW	4	12	10.7	3	15.5	15.3
9w286	SW	4	15.5	12.7	3	16.5	14.9
9w287	SW	3	13	11	3	19.5	14.6
9w288	SW	1	12	9.4	1	16	15
9w289	SW	1	12	10.8	1	18	15.5
9w290	SW	4	12	11.3	5	15.5	15.3
9w292	SW	2	13	11	5	15.5	15.3
9w294	SW	2	17	12.1	1	17.5	16.5
9w295	SW	3	13.5	11.4	1	18	15.5
9w297	SW	3	13	11	5	15.5	15.3
9w298	SW	3	13	11	5	19.5	14.6
9w299	SW	3	16	11.7	4	16.5	14.9
9w300	SW	3	15.5	12.7	5	16.5	14.9
9w301	SW	3	16	11.7	4	20.5	17.2
9w302	SW	3	13	11.4	4	18.5	15.1
9w303	SW	2	13	11	3	21	16.8
9w304	SW	5	13.5	11.4	5	15.5	15.3
9w305	SW	1	12	10.7	1	16	16.9
9w306	SW	3	13	11	5	16.5	14.4
9w307	SW	2	12	11.3	5	16	15
9w309	SW	4	12	11.3	5	16.5	14.4
9w313	SW	2	12.5	9	5	19.5	14.6
9w314	SW	3	12	11.3	5	18.5	15.3
9w315	SW	3	16	11.7	4	17.5	16.5
9w317	SW	4	13	11.4	4	16	15
9w318	SW	3	12	11.3	5	15.5	15.3
9w319	SW	3	11.5	10.3	5	16.5	14.9
9w320	SW	1	12	9.8	2	16.5	14.9
9w321	SW	2	13.5	11.4	4	16	15
9w322	SW	5	13	10.8	4	19.5	14.6
9w324	SW	4	13	10.8	5	19.5	14.6
9w325	SW	4	12	9.8	5	16.5	14.9
9w327	SW	4	12	10.8	4	16.5	14.9
9w328	SW	5	11	10.7	5	15.5	15.3
9w330	SW	3	12	11.3	4	16.5	14.9
9w333	SW	4	12	7.9	5	16.5	14.9
9w335	SW	4	12	10.8	4	15.5	15.3
9w336	SW	1	12	9.4	1	18	15.5
9w337	SW	2	12	10.8	1	16.5	14.9
9w340	SW	2	12	9.4	2	18.5	15.1
9w341	SW	2	12	10.8	2	21	16.8
9w342	SW	2	13	11	4	19.5	14.6
9w343	SW	4	12	10.7	5	15.5	15.3
9w345	SW	3	12	10.7	4	17	16.8
9w349	SW	2	13	10.8	5	18.5	15.3
9w350	SW	3	12	10.8	5	15.5	15.3
9w351	SW	4	13	10.8	5	16.5	14.9
9w354	SW	4	12	7.2	5	17.5	14.9
9w355	SW	1	12	10.8	2	18.5	15.1
9w356	SW	2	12	10.7	5	16	15
9w357	SW	4	6	5.9	2	21	16.8
9w358	SW	2	11.5	10.3	5	18	15.5
9w359	SW	3	12	11.3	4	18	15.5
OJ105	SW	3	13	10.8	5	19.5	14.6
OJ106	SW	4	11.5	10.3	5	18.5	15.3
OJ107	SW	2	13	10.8	3	19.5	14.6
OJ108	SW	3	13	11	5	16	15
OJ110	SW	2	16	11.7	3	16	15
OJ111	SW	5	12	11.3	5	18.5	15.3
OJ115	SW	3	11	6	5	17.5	14.4
OJ117	SW	4	13	11.4	4	15.5	15.3
OJ118	SW	3	13	11	5	15.5	15.3
OJ119	SW	4	10.5	8.4	4	14.5	16.7
OJ120	SW	2	12	11.3	5	15.5	15.3
OJ121	SW	3	13.5	11.4	5	17	14.6
OJ122	SW	3	13	11.4	5	16.5	14.9
0J125	SW	3	13	11	4	16.5	14.9
0Q230	SW	3	11	10.7	5	19.5	14.6
0Q231	SW	3	11	10.7	1	18.5	15.1
0Q232	SW	3	11.5	10.3	2	15.5	15.3
0Q233	SW	3	13	11	5	15.5	15.3
0Q234	SW	2	16	11.7	5	18	15.5
0Q236	SW	4	11	6	5	16	15
0Q237	SW	1	12	11.3	4	16.5	14.9
0Q239	SW	5	13	10.8	4	18	15.5
0Q240	SW	5	12	11.3	5	17	14.6
0Q242	SW	2	17	12.1	5	18.5	16
0Q229	SW	3	11.5	10.3	4	16.5	14.9
2Q 174	SW	4	13	11	4	16.5	14.4
2Q 175	SW	4	12	10.7	5	18	15.5
2Q 226	SW	1	12	15.8	1	21	16.8
2Q 237	SW	3	13	11	5	19.5	14.6
2Q 240	SW	4	16	11.7	5	16.5	14.9
2Q 426	SW	1	12.5	14.9	2	18	15.5
2Q 430	SW	1	12	10.8	1	16.5	16.8
2Q 431	SW	4	12	10.8	5	16.5	14.4
2Q 433	SW	3	13.5	11.4	2	16.5	14.4
2Q 435	SW	1	13	10.8	1	19.5	16.8
2Q 440	SW	3	13	11	4	19.5	14.6
2Q 451	SW	2	13.5	11.4	5	18	15.5
2Q 463	SW	3	12	10.8	4	16	16.9
2Q 466	SW	4	11	10.7	5	16	15.3
2Q 467	SW	1	12	10.8	1	15.5	15.3
2Q 474	SW	3	13	11	5	16.5	14.4
2Q 476	SW	3	12.5	9	1	19.5	16.8
2Q 477	SW	3	12	9.4	1	19.5	16.8
2Q 483	SW	4	13	11	3	16	15
2Q 484	SW	2	13	11	4	17.5	16.5
2Q 494	SW	2	13.5	11.4	3	18.5	16
2Q 495	SW	2	12	11.3	1	15.5	15.3
2Q 496	SW	3	13	11	3	17.5	16.5
2Q 511	SW	4	12.5	9	4	16.5	14.9
2Q 516	SW	5	11.5	8.6	5	16	15
2Q 518	SW	1	12	12.5	1	16.5	14.9
2Q 522	SW	1	11.5	10.3	1	19.5	16.8
2Q 525	SW	1	13	10.8	1	15.5	15.3
2Q 528	SW	2	13.5	11.4	4	21	16.8
2Q 531	SW	2	12	9.4	5	16.5	14.4
2Q 542	SW	4	10.5	8.4	3	16	15
2Q 544	SW	1	12	12.6	1	16.5	16.8
2Q 547	SW	3	12	9.8	5	16.5	14.4
2Q 551	SW	4	12	10.7	5	15.5	15.3
2Q 553	SW	1	12	10.7	1	15.5	15.3
2Q 554	SW	3	12	10.8	5	15.5	15.3
2Q 558	SW	3	13	11	5	21	14.9
2Q 560	SW	3	11	10.7	4	15.5	15.3
2Q 561	SW	3	16	11.7	3	16.5	14.4
2Q 583	SW	1	13	10.8	1	19.5	16.8
2Q 592	SW	5	12	9.8	4	16	15
2Q 594	SW	4	12.5	9	2	16.5	14.9
2Q 605	SW	3	16	11.7	3	18.5	16
2Q 607	SW	3	12	11.3	4	17	16.8
2Q 609	SW	4	7.5	5.9	5	17	14.6
2Q 612	SW	3	12	10.7	5	18.5	16
2Q 622	SW	1	11.5	10.3	1	17	16.8
2Q 645	SW	2	17	12.1	5	17	14.9
2Q 706	SW	3	12	10.7	5	15.5	15.3
2Q 731	SW	2	16	11.7	2	16.5	14.9
2Q 813	SW	3	13	11	3	16.5	14.9
2Q 853	SW	2	12	9.4	5	18.5	16
2Q 002	SW	1	13	11	1	18	15.5
2Q 031	SW	5	12	9.4	5	16.5	14.4
2Q 038	SW	2	17	12.1	5	16	15.3
2Q 055	SW	4	16	11.7	5	18	15.5
2Q 057	SW	2	17	12.1	4	18.5	16
2Q 071	SW	3	11.5	8.6	5	18.5	16
2Q 073	SW	1	13	11	1	16.5	15
2Q 079	SW	3	12	10.7	5	16.5	14.4
2Q 081	SW	2	11	10.7	5	17	14.9
2Q 101	SW	4	13	11.4	5	15.5	15.3
2Q 114	SW	3	17	12.1	3	16.5	14.9
2Q 132	SW	1	12.5	9	1	16	15
2Q 135	SW	1	11.5	15.8	1	16.5	15
2Q 151	SW	2	12.5	9	5	16.5	14.4

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2.2 SNP评价和分布

利用Illumina公司的GenomeStudio软件对308份甘蓝型油菜的60K芯片进行基因型分型。参考SCHIESSL等^[29]方法,剔除没有定位到甘蓝型油菜参考基因组和定位在random染色体上的标记,同时删除MAF小于0.05和缺失加杂合大于25%的标记,最后剩下23 489个定位到唯一染色体上的SNP标记,用于后续分析（电子附表2,http://pan.baidu.com/s/ 1mhVbk04）。
通过SNP在基因组上的分布发现,SNP数目最多
的是C04染色体,占10.3%（2 425个SNP）;最少的是C09染色体,占2.80%。A和C亚基因组平均每条染色体分布1 093和1 396个SNP,结合甘蓝型油菜A、C亚基因组的大小得出,A亚基因组SNP的密度（平均每100 kb有4.6个SNP）是C亚基因组的1.5倍,说明A亚基因组发生了更多的重组交换,这可能是由于油菜从欧洲引入亚洲后导入了油菜的亲本之一白菜的遗传成分,拓宽了油菜A亚基因组的遗传多样性。

2.3 群体结构和亲缘关系

从19条染色体上均匀选取5 700个SNP（MAF>0.05）用于群体结构和亲缘关系的估测。群体结构的亚群通过独立的k值无法确定,因为LnP(D)值随着k值的增加而增大,没有出现拐点,因此,采用EVANNO等^[35]方法计算Δk值,Δk在k = 3时出现峰值（图2-a）。所有308份父本最后被分为3个亚群,亚群1主要由冬性材料构成,亚群2主要是春性材料,而半冬性材料主要构成了亚群3（图2-b）,该结果与生态型的来源一致。
亲缘关系分析发现,任何2个材料之间平均亲缘关系值为0.072,73%的任意材料间亲缘关系值小于0.1,其中,约53%的材料亲缘关系值为0（图2-c）。以上结果表明所用材料之间的亲缘关系较远,适合GWAS的研究。

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图2308份甘蓝型油菜的群体结构和亲缘关系分析
-->Fig. 2Analysis of population structure and relative kinship in 308 B. napus
-->

2.4 全基因组关联分析和QTL比较

为了消除年度间的环境影响,采用MERK等^[36]方法对2年的表型数据进行最佳线性无偏预测（best linear unbiased prediction,BLUP）,估计育性等级的BLUP值,并结合SNP基因型数据采用基于R语言GenABEL包的PCA + K混合线性模型进行GWAS分析。
GWAS分析共检测到13个SNP与育性等级显著关联（P<4.26×10^-5,-log₁₀^p>4.37）,分布在A01、A09、C03、C06和C08 5条染色体上,单个位点解释的表型变异介于2.53%—9.96%,Q-Q图显示该模型很好地控制了假阳性概率的产生（图3,表1）。根据位点间的连锁不平衡（R²>0.5）,检测到的13个SNP被分为6个候选区间,预测到6个与育性相关的候选基因,其中4个候选基因的编码蛋白含有育性恢复基因特有的PPR（pentatricopeptide repeat）保守基序（表1）。
A09染色体上显著SNP（Bn-A09-p34393068和Bn-scaff_16445_1-p932699）构成的候选区间与C08染色体显著SNP（Bn-A09-p34437367）所对应的候选区间有极高的共线性（图3）,且都定位在远古祖先图中横的虚线代表阈值（1/23490,-log₁₀^p= 4.37）,竖的虚线代表在A09和C08部分同源区间共定位的SNP。红色标记表示本研究和LIU等^[7]共同预测的候选基因染色体核型A block（24个祖先染色体核型block之一,拟南芥对应位置在chr1：202 136—204 189,基因从AT1G01560到AT1G19850）。同时该区间与已报道的A09染色体上1个pol CMS恢复基因精细定位区间重叠,候选基因都对应同一个拟南芥基因AT1G12300,进一步验证了该分析方法的准确性。

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图3全基因组关联分析和QTL比较分析
-->Fig. 3GWAS and comparative analysis of QTL in B. napus
-->

Table 1
表1
表1GWAS结果和候选基因预测
Table 1The results of GWAS and candidate genes prediction

染色体 Chromosome	SNP	位置 Position (bp)	贡献率 R² (%)	-log₁₀⁽^P^-value)	假阳性率 FDR	候选基因 Candidate gene	拟南芥同源基因 Arabidopsis homologue	基因注释 Gene annotation
A01	Bn-A01-p8683487	7839954	9.48	4.97	0.084	BnaA01g15370D	AT3G52680	含F-box结构域的蛋白F-box domains- containing protein
A09	Bn-A09-p34393068	31632438	7.52	4.93	0.055	BnaA09g46700D	AT1G12300	PPR蛋白超家族 PPR superfamily protein
A09	Bn-scaff_16445_1-p932699	31672083	8.12	5.10	0.187	BnaA09g46700D	AT1G12300	PPR蛋白超家族 PPR superfamily protein
C03	Bn-scaff_26320_1-p297674	30891473	4.16	4.45	0.064	BnaC03g45840D	AT2G15690	PPR蛋白超家族 PPR superfamily protein
C06	Bn-scaff_15818_1-p363620	15656961	3.48	4.61	0.097	BnaC06g13000D	AT3G02010	PPR蛋白超家族 PPR superfamily protein
C06	Bn-scaff_15818_1-p374433	15667668	3.39	4.47	0.067	BnaC06g13000D	AT3G02010	PPR蛋白超家族 PPR superfamily protein
C08	Bn-scaff_16197_1-p1404163	32712230	3.3	4.56	0.072	BnaC08g34590D	AT2G23140	RING/U-box蛋白超家族RING/U-box superfamily protein
C08	Bn-scaff_16197_1-p1400239	32716429	5.76	4.58	0.077
C08	Bn-scaff_16197_1-p1382140	32737077	3.21	4.52	0.071
C08	Bn-scaff_16197_1-p1381407	32737818	4.82	4.52	0.071
C08	Bn-scaff_16197_1-p1380700	32738490	3.58	4.6	0.071
C08	Bn-scaff_16197_1-p1367016	32753010	2.53	5.00	0.112
C08	Bn-A09-p34437367	35852167	9.96	4.97	0.084	BnaC08g40710D	AT1G12300	PPR蛋白超家族PPR superfamily protein

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2.5 单体型效应

除了上述2个候选基因与已有报道的结果一致,另外2个含有PPR保守基序的候选基因未发现相对应的QTL报道,接下来对这两个候选区间进行单体型效应分析。C03染色体上候选基因BnaC03g45840D位于显著SNP（Bn-scaff_26320_1-p297674）上游45 kb处,该区域SNP平均R²大于0.8,构成一个单体型块,所有7个SNP构成5种单体型,单体型效应分析发现,68.9%的材料具有单体型G-T-A-T-G-A-G,平均育性等级为3.9±1.44,20.1%的材料具有单体型A-C-C-C-N-C-A,平均育性等级为2.1±1.53,剩下3种单体型共占10.5%,2种比例最大的单体型与育性等级显著关联（P<0.001）。C06染色体候选基因BnaC06g13000D位于显著SNP（Bn-scaff_15818_1- p374433）下游100 kb处,编码的蛋白同样含有PPR保守基序,该100 kb区间内所有SNP处于极高的LD（R²>0.9）（图4-a）,只存在2种单体型,通过一个位点的效应分析可以预测整个区间的效应。随后对候选基因BnaC06g13000D上游最近的1个SNP（Bn-scaff_15818_1-p471106,上游2.9 kb）等位基因（C/T）效应分析发现,当SNP位点从CC变为TT时,可育材料（1和2级）增加了71.7%,不育材料（4和5级）降低了37.8%（图4-b）,该位点与育性等级显著关联（P<0.001）。

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图4候选基因BnaC06g13000D的LD和SNP等位基因效应分析
-->Fig. 4The LD and SNP effect analysis of alleles of BnaC06g13000D
-->

3 讨论

本研究所使用的60K SNP芯片已被广泛应用在基于自然群体的全基因组关联分析^[37]和基于分离群体的QTL定位研究中^[38]。利用该SNP芯片对308份油菜F₁的育性等级进行GWAS分析,最终预测了4个含PPR保守基序的候选基因,其中2个落在A09和C08染色体的部分同源区间,且与已克隆的A09上的pol CMS恢复基因位点（ORF2）相同,对应同一个拟南芥基因AT1G12300。该候选区间被多个群体的QTL定位重复检测到^[5-7]。另外2个候选基因对应的区间未发现相应的QTL报道,贡献率都不到5%,可能是由微效多基因控制,因而在早前基于双亲的分离群体中不容易被检测到。进一步单体型分析说明,与2个候选基因处于同一单体型块的SNP的等位基因或单体型的变化与pol CMS的育性显著相关,通过这些SNP的差异可以开发功能标记,应用于甘蓝型油菜pol CMS恢复系和保持系的筛选。
高通量测序技术的迅猛发展,将基因组学水平的研究带入了一个新的时期。芸薹属60K SNP芯片的开发和甘蓝型油菜参考基因组的释放,使我们能够快速、准确地挖掘重要农艺性状的候选基因和进一步的深入研究。本研究采用目前在植物中广泛应用的全基因组关联分析方法,成功鉴定出与甘蓝型油菜pol CMS育性恢复相关的位点,省时省力,同时该自然群体可以对其他农艺性状和品质性状进行定位,成为快速解码大量未知基因功能的重要途径。同时该研究将有助于其他CMS系统育性恢复候选基因的快速挖掘,促进油菜的杂种优势利用。

4 结论

通过GWAS分析,成功鉴定出13个可能影响pol CMS育性恢复有关的SNP位点,分布在5条染色体上。预测了4个含PPR保守基序的候选基因,其中2个候选基因在A09和C08染色体的部分同源区间,且与早前报道的一个pol CMS育性恢复位点一致。另外2个为新鉴定到的微效基因,与候选基因处于同一单
体型块内的SNP变化与育性等级显著相关。
The authors have declared that no competing interests exist.