0 引言
【研究意义】 高温热应激严重影响种猪性欲和精液品质,进而影响种猪繁殖率[1-3]。探明热应激损伤猪精子发生和精液品质的分子机制,并提出应对措施,对种猪繁殖实践具有重要意义。【前人研究进展】 对热应激损伤实验动物小鼠[4]、大鼠[5-6]和猴[7]的精子发生分子机制的研究发现,部分原因是热应激诱导细胞凋亡,导致生殖细胞减少,进而导致少精症和无精症。细胞凋亡信号途径在进化中高度保守。蛋白酶Caspases（cysteine aspartic acid specific protease）家族成员在细胞凋亡调节中起重要作用。在哺乳动物细胞中,Caspases依赖的细胞凋亡主要由两条途径引发：由死亡受体起始的外源途径和由线粒体起始的内源途径。细胞凋亡的内源途径中,线粒体细胞色素C（Cyt-C）从线粒体释放到胞质中是细胞凋亡内源信号途径的关键。Cyt-C释放到胞质中,与胞质的Apaf-1（apoptosis protease activating factor）分子结合,激活Caspase-9酶原,进而激活Caspase-3酶原,Caspase-3的活化,细胞凋亡将不可避免的发生[8-10]。热应激诱发细胞凋亡见于阴囊和睾丸局部受热[11]和精索静脉曲张[12]。用40℃或42℃温水浴处理小鼠睾丸30 min,Caspase-3表达增加,大量生精细胞死亡[13]。Caspase-3由细胞质进入细胞核是其发挥促凋亡作用所必需,但其机制尚不清[14]。另外,小鼠缺乏睾丸特异性Cyt-C,精子功能受损[15]。Cyt-C在生殖细胞和支持细胞数量比例的维持中也发挥着十分重要的作用[16-17]。Caspase-3基因敲除小鼠,Cyt-C的释放受到抑制,而活化的Caspase-3以正反馈的形式,进一步刺激Cyt-C向胞质的释放,进一步加速细胞凋亡[18]。【本研究切入点】高温影响猪精子发生和精液品质,但分子机制不清楚。来自其他哺乳动物的研究提示,细胞凋亡与凋亡调节蛋白在热应激损伤精子发生中起重要作用,细胞凋亡的调节机制研究认为线粒体细胞色素C释放到胞质中,并最终激活Caspase-3蛋白酶,起始细胞凋亡。热应激对这两种细胞凋亡调节蛋白在猪睾丸表达是否有影响,未见报道。【拟解决的关键问题】高温热应激条件下,用QRT-PCR法、Western blot法和免疫组织化学法研究热应激对性成熟猪睾丸Cyt-C和Caspase-3mRNA蛋白表达与组织细胞定位的影响。1 材料与方法
1.1 试验动物及处理
140 kg左右,14月龄,健康状况良好的性成熟长白公猪9头,饲养在20—27℃的猪舍环境;随机分成3组,其中3头,置37—40℃的猪舍环境,每天3 h,连续7 d,为短期热应激处理组（heat stress 7 d,HS7d）;3头置37—40℃的猪舍环境,每天3 h,连续42 d,为一个精子发生周期热应激处理组（heat stress 42 d,HS42d）;每天在热应激处理结束后,将猪驱赶回20—27℃的猪舍;其余3头猪整个试验期保留在20— 27℃的猪舍,为对照组（control,CON）。试验时间为2015年7、8月份,地点为太谷县某养殖场。热应激处理结束24 h,各组试验用猪,手术法摘取猪睾丸组织,将部分睾丸组织切成小块,迅速分装于冻存管,冻存于液氮,用于总RNA和总蛋白的提取。部分睾丸组织切成的小块,迅速置于Bouin氏固定液中,4℃冰箱固定12 h,后转入70%酒精,经脱水、透明、浸蜡,用于制作石蜡切片。1.2 试验方法
1.2.1 RNA提取和QPT-PCR的扩增 Trizol法提取总RNA（Trizol Readent,Invitrogen公司产品）,1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,用ND-1000（NanDrop Technologies）测定其浓度。用QIAGEN公司反转录试剂盒进行cDNA合成,去除基因组DNA,反应体系为：gDNA Wipeout Buffer,7×：2 µL;总 RNA：1 µg;加至14 µL,体系混匀后置于PCR仪中,按条件：42℃ 2 min进行反应;cDNA合成,反应体系为：Quantiscript RT Buffer, 5×：4 µL;RT Primer Mix：1 µL;Reverse-transcription master mix：1 µL;Template RNA（Entire genomic DNA elimination reacton）：14 µL,体系混匀置于PCR仪中,按条件：42℃,30 min;95℃,3 min进行反应,-20℃保存cDNA。参照NCBI给出的Cyt-C和Caspase-3基因全序列中的CDS序列使用primer premier 5.0软件设计荧光定量RCR扩增引物,交由华大基因合成,引物见表1。
Table 1
表1
表1荧光定量PCR引物序列及扩增条件
Table 1Fluorescence quantitative PCR primer sequences and amplification conditions
| 目的基因 Genes | 引物序列 Sequence of premier (5′-3′) | 引物 Production (bp) | 退火温度 Temperature (℃) |
|---|---|---|---|
| Cyt-C | F:CACTGTAGAAAAGGGAGGCA | 166 | 55 |
| R:CTTCTTGGGATTCTCCAGGTAC | |||
| Caspase-3 | F:CAGTAGACAAGCAACAAAGCG | 151 | 55 |
| R:AAGGTTCTTAGACCCCAGCA | |||
| 18SrRNA | F:GAAGGGCACCACCAGGAGT | 158 | 55 |
| R:CAGACAAATCACTCCACCAA |
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用QIAGEN试剂盒（QuantiFast SYBR Green PCR Kit,QIAGEN公司产品）进行荧光定量PCR,18SrRNA作为内参基因与Cyt-C和Caspase-3共同进行扩增,每个样品重复3次,置于Stratagene Mx3005P 实时荧光定量PCR仪（Stratagene Agilent,USA）上反应。根据扩增曲线的CT值计算定量结果。通过2-ΔΔCT 计算Cyt-C和Caspase-3在对照组和试验组猪睾丸中的相对表达水平。18SrRNA标准化Cyt-C和Caspase- 3mRNA的相对表达量。
1.2.2 Western blot 分析 用蛋白提取试剂盒（碧云天公司产品）提取睾丸组织总蛋白,用ND-1000测定蛋白质浓度。每空上样量为200 μg 蛋白样品,进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳转移至硝酸纤维素（NC）膜;5%脱脂奶粉封闭1 h;TBST冲洗,加入第一抗体（多克隆兔抗Cyt-C,TBST1000倍稀释;多克隆兔抗Caspase-3,5%脱脂奶粉200倍稀释;单克隆兔抗GAPDH,TBST2500倍稀释;一抗均为Abcam公司产品）覆盖NC膜,室温放置30 min,4℃过夜;第2天取出,室温放置30 min,TBST冲洗10 min×3,加入山羊抗兔IgG抗体（TBST6000倍稀释,康为世纪公司产品）,37℃ 孵育1 h,TBST冲洗5 min×6;加入高灵敏度发光试剂（康为世纪公司产品）,胶片曝光。用ImageJ（National Institutes of Health,USA）进行分析。
1.2.3 免疫组织化学 石蜡切片经脱蜡至水,用新配置3% H2O2 37℃孵育10 min,以去除内源性过氧化物酶,PBS（PH7.4）冲洗3 min×3;正常山羊血清封闭液37℃ 孵育10 min;分别滴加第一抗体（多克隆兔抗Cyt-C,BSA1000倍稀释;多克隆兔抗Caspase-3,BSA100倍稀释,第一抗体均为Abcam公司产品）,室温放置30 min,之后置4℃冰箱过夜;第2天取出,室温放置30 min,PBS冲洗3 min×3,滴加第二抗体（多聚化山羊抗兔IgG,康为世纪公司产品）,37℃ 孵育30 min,PBS冲洗3 min×3;DAB（福州迈新生物技术开发有限公司产品）显色,苏木精复染,脱水,透明,中性树胶封片,显微镜下观察。棕红色着色判定为免疫反应阳性,根据阳性着色的深浅和范围,确定表达水平的高低。阴性对照切片,用正常非免疫兔血清代替第一抗体。
1.3 数据分析
试验数据用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）与显著性检验,差异显著P<0.05,差异极显著P<0.01。所有实验数据以“平均值±标准误（mean±SEM）”表示。2 结果
2.1 热应激对Cyt-C和Caspase-3 mRNA相对表达水平的影响
QRT-PCR研究显示,对照组Cyt-CmRNA的相对表达量为0.8340±0.0196,热应激处理7 d和42 d组Cyt-CmRNA的相对表达量升高,分别为2.1742± 0.1212、1.1254±0.0414,分别是对照组的2.61倍（P<0.01）、1.35倍（P<0.05）（图1-A）。对照组Caspase- 3mRNA的相对表达量为1.0068±0.1130,热应激处理7 d和42 d组Caspase-3 mRNA的相对表达量升高,分别为3.7975±0.3391、3.0010±0.5516,分别是对照组的3.77、2.99倍（P<0.01）（图1-B）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1QRT-PCR分析Cyt-C和Caspase-3mRNA在对照组和热应激处理猪睾丸组织的表达
-->Fig. 1Quantitative real-time PCR analysis of Cyt-C and Caspase-3mRNA expression in testes samples collected from the control and heat treatment boars
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2.2 热应激对Cyt-C和Caspase-3蛋白相对表达量的影响
Western blot研究显示,各试验猪睾丸组织提取物中存在分别与多克隆兔抗Cyt-C和多克隆兔抗Caspase-3进行免疫反应的阳性条带,分子量分别为12和32 kD（图2-A）。对照组Cyt-C蛋白水平相对表达量为0.4455±0.0644,热应激处理7 d和42 d组Cyt-C蛋白水平相对表达量升高,分别为0.9069± 0.0446、0.7332±0.0724,分别是对照组的2.04倍、1.65倍（P<0.01）（图2-B）。对照组Caspase-3蛋白水平相对表达量为0.1768±0.0308,热应激处理7 d和42 d组Caspase-3蛋白水平相对表达量升高,分别为0.5974±0.0390、0.3574±0.0742,分别是对照组的3.38倍（P<0.01）、2.02倍（P<0.05）（图2-C）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2Western blot法分析Cyt-C和Caspase-3在猪睾丸的表达
-->Fig. 2Western blot analysis of Cyt-C and Caspase-3 expression in boar testes
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2.3 免疫组织化学试验
2.3.1 Cyt-C在猪睾丸中免疫组织化学染色 Cyt-C在猪睾丸组织中免疫反应阳性物（棕色着色）定位于间质细胞、支持细胞和各个发育阶段生精细胞的胞质中,在生精细胞Cyt-C低表达于精原细胞,高表达于减数分裂后精母细胞和精子细胞。与对照组相比,热处理（HS7d,HS42d）导致Cyt-C的胞质内定位更加弥散,鉴于线粒体为直径0.3—1.0 μm,长短1.5—3.0 μm大小的线状、颗粒状小体,更细小的弥散分布提示Cyt-C脱离线粒体进入细胞质定位。阴性对照切片,以正常非免疫兔血清代替一抗,未见特异性着色（图3）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3Cyt-C蛋白在猪睾丸的免疫组织化学定位
-->Fig. 3Immunohistochemical localization of Cyt-C protein in boar testes
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2.3.2 Caspase-3在猪睾丸中免疫组织化学染色 Caspase-3在各组睾丸的细胞定位大体相似,间质细胞和精原细胞低表达,大量减数分裂后的生精细胞呈Caspase-3阳性表达（棕色着色）。与对照组相比,热处理（HS7d,HS42d）导致部分支持细胞和管周肌样细胞Caspase-3阳性表达,大量圆形和长形精子细胞的细胞核呈Caspase-3阳性表达,Rs所指圆形为圆形精子细胞的细胞核（图4-F,J）,Es所指椭圆形为长形精子细胞的细胞核（图4-G,K）。阴性对照切片,以正常非免疫兔血清代替一抗,未见特异性着色（图4）。
3 讨论
Caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子,以无活性的酶原形式存在于活细胞的胞质中[10]。Caspase-3在哺乳动物睾丸的表达有大量报道,Caspase-3表达于人类精子发生过程中各级生精细胞和支持细胞[19];小鼠精子发生过程中的精原细胞和精母细胞[13,20];大鼠精子发生过程中的精母细胞[21];新生羊驼间质细胞和各级生精细胞[22];鲶鱼精子细胞[23];Caspase-3在各种动物睾丸生精细胞中的表达,提示Caspase-3与精子发生密切相关,但其机制尚不清楚。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4Caspase-3蛋白在猪睾丸的免疫组织化学定位
-->Fig.4Immunohistochemical localization of Caspase-3 protein in boar testes
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本项研究中Caspase-3蛋白和mRNA表达水平在热应激处理（37℃ 3 h连续7 d和42 d）猪睾丸显著升高。短期热应激处理（7 d）导致Caspase-3蛋白和mRNA表达升高。这与 JIA等对猕猴[7]和大鼠[24]睾丸的研究结果相似。参照文献报道,野猪的精子发生周期为41 d,本项研究中连续42 d（一个精子发生周期）热处理组猪睾丸Caspase-3蛋白和mRNA的表达高于对照组,但较7 d热处理组降低,这一方面可能是由于细胞对热刺激一定程度的调整适应;另一方面,也提示细胞在长期热应激环境条件下,以凋亡信号途径应对不良环境刺激的能力降低。
本项研究Caspase-3免疫组织化学结果显示,Caspase-3低表达于间质细胞和精原细胞,大量减数分裂后的生精细胞呈Caspase-3阳性。与对照组相比,热处理导致部分支持细胞Caspase-3的表达,大量生精细胞的细胞核呈Caspase-3阳性着色（棕色）。先前的研究证实,Caspase-3以酶原的形式存在于正常细胞的胞质中,Caspase-3高表达于减数分裂以后生精细胞,提示减数分裂以后细胞易于接受凋亡信号的刺激,是当受到热应激刺激时容易发生凋亡的细胞类型,这一点在有关热应激诱导的细胞凋亡类型已有证实[19,25-26]。支持细胞是曲精小管内唯一与生精细胞接触的体细胞,为生精细胞的发育提供营养支持。热处理导致支持细胞Caspase-3的阳性表达,提示热应激处理可能导致支持细胞启动细胞凋亡途径,而这一点对精子发生的损失是不可逆的。Caspase-3由细胞质进入细胞核定位是其发挥促凋亡作用所必需[27]。本项研究中,热处理导致大量精子细胞表现细胞核Caspase-3阳性着色（棕色）,提示精子细胞是易于发生细胞凋亡的主要细胞类型。
细胞色素C是一种水溶性蛋白,分子量约为12 kD,位于线粒体内膜,是电子传递链的重要组成部分。线粒体释放到胞浆中的Cyt-C可通过与Apaf-1（apoptosis protease activating factor）结合,激活Caspase-9,并进而活化Caspase-3,介导细胞凋亡。本项研究中,热应激处理导致Cyt-C蛋白和mRNA的表达升高,热应激处理7 d导致Cyt-C蛋白和mRNA的表达显著升高,这与JIA等对猕猴[7]和大鼠[24]睾丸Cyt-C的研究结果相似。热处理42 d组Cyt-C蛋白和mRNA的表达水平较对照组高,但低于7 d组,这提示短期热应激处理可能导致细胞代谢加快,细胞凋亡的倾向性升高;而长期热应激环境（一个精子发生周期）,Cyt-C的高表达有所恢复,提示细胞对热应激有一定的调整能力,逐渐恢复到较低水平。
Cyt-C免疫组织化学定位显示,整个睾丸组织的各类细胞均有Cyt-C的表达,这与文献[16]的研究报道相似。本项研究发现不同细胞类型Cyt-C的表达量高低有明显差别,精原细胞Cyt-C的表达量小,而减数分裂后生精细胞Cyt-C的表达水平高;结合Cyt-C是线粒体内膜电子传递链的重要组分,Cyt-C表达水平的高低反映细胞代谢水平的高低;这就提示精原细胞代谢水平较低,对细胞凋亡信号的刺激反应弱;减数分裂以后生精细胞代谢水平高,对细胞凋亡信号的反应强。
对照组Cyt-C的表达呈现弥散颗粒状,提示Cyt-C局限在线粒体区域,Cyt-C高表达于精母细胞和精子细胞,说明精母细胞和精子细胞线粒体含量丰富,而精原细胞线粒体含量少。与对照组相比,热应激处理组Cyt-C的表达呈现出弥散细点状,提示Cyt-C有脱离线粒体进入细胞质定位的特征。
试验期间,热应激组猪在进入37—40℃的猪舍时,有烦躁不安、不愿进入热圈的反应,反复驱赶对试验结果也会产生一定影响,本结果实际反映了热应
激及驱赶的综合应激效应。
综上所述,热应激处理导致线粒体的表达水平升高和向胞质的释放量增加,通过信号分子激活Caspase-3,使Caspase-3表达水平升高,在减数分裂后的生精细胞细胞核的定位增加,活化的Caspase-3进一步反馈性调节使Cyt-C向胞质的释放增加,活化的Caspase-3增加,影响精子发生,导致精液品质下降。
4 结论
热应激处理导致线粒体细胞色素C和Caspase-3在猪睾丸mRNA和蛋白表达水平的增加,在睾丸组织细胞定位发生变化：线粒体细胞色素C脱离线粒体进入细胞质定位,Caspase-3由细胞质进入细胞核定位,提示线粒体细胞色素C和Caspase-3可能与热应激导致的猪精液品质下降存在关联。The authors have declared that no competing interests exist.
