0 引言
【研究意义】小麦（Tritium aestivum L.）是世界上分布范围较广、种植面积较大、单产和总产量较高的粮食作物之一,作为重要的人类食品、动物饲料和加工原料,其产量和品质对国民经济的发展和人民生活水平的改善至关重要[1]。其中,培育优良品种是提高小麦产量、改进小麦品质的主要措施[2]。在众多小麦育种方法中,常规杂交育种是最为有效的途径。利用玉米花粉诱导小麦单倍体的加倍单倍体途径是正在兴起的育种技术[3-5],并利用该技术培育了小麦新品种[5-6],具有潜在发展空间。【前人研究进展】去雄是小麦杂交育种、远缘杂交育种和基于染色体消除加倍单倍体育种中一项繁琐的工作,常常需要花费较长时间和较多人力,化学杀雄剂（chemical hybridization agent,CHA）可以有效解决这一问题[7]。在长期的育种实践中,人们尝试了多种化学杀雄剂[8-10],但效果都不尽理想,存在药效不稳定、杀雄不彻底、环境不友好等缺点[11],没有充分发挥化学杀雄在育种中的作用。化学杀雄剂SQ-1很好地克服了上述缺点,效果持续时间长、杀雄彻底、无环境污染,在适宜条件下杀雄率达95%—100%,异交结实率超过85%,在中国很多小麦育种单位得到了普遍应用[10-12]。在杀雄机理方面,SQ-1可抑制花药中的糖酵解、三羧酸循环及电子传递链过程,使不育株花药的有氧代谢过程受阻,能量供应不足,导致花粉细胞大量败育。因此,在不育花药中花药细胞内积累了过量活性氧,为消除过量的活性氧,抗氧胁迫相关基因大量表达。另外,化学杀雄剂SQ-1诱导小麦败育花粉细胞的异常变化与RAFTIN1的表达相对应[13]。但有关化学杀雄剂SQ-1对小麦品种间杂交及小麦与玉米杂交结实性的影响还缺乏研究。在玉米花粉诱导小麦单倍体方面,杂交后的成胚率较低[14],限制了该技术在育种实践中的有效应用,需要提高小麦与玉米杂交的成胚率。研究表明,阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins,AGP）作为高等植物细胞组成的主要糖蛋白[15],在植物胚胎发生过程中起重要作用[16-17]。从云杉（Piceaabies）种子中提取的AGP能够促进其悬浮细胞体细胞胚的发育[18],从胡萝卜种子中提取得到的AGP可以促进其胚性细胞的增加。培养基中添加AGP结合剂β-Glc Yariv,再生性能较好的菊苣品系其叶片再生性能完全受到抑制,β-Glc Yariv移除后,菊苣叶片又恢复再生能力,且AGP在胚性细胞形成过程中的表达上调[19]。培养基中添加10 mg·L-1 AGP对油菜[20]、大白菜[21]小孢子胚胎发生及胚性细胞分化过程有促进作用,降低了胚状体褐化和死亡现象,显著提高了成苗率。培养基中添加10 mg·L-1 AGP对小麦小孢子胚状体发生同样具有促进作用,降低了小孢子死亡率和白化苗发生率[22]。培养基中添加50—100 mg·L-1 AGP显著促进了不同小麦品种幼胚培养胚状体的发生,提高了植株再生率[23]。【本研究切入点】目前,有关SQ-1对小麦品种间杂交及小麦远缘杂交结实性的影响还缺乏研究,AGP是否可以提高玉米花粉诱导后的小麦单倍体成胚率还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究在小麦拔节期喷施SQ-1,开花期分别授以小麦花粉和玉米花粉,研究SQ-1对小麦品种间杂交以及小麦与黑麦、玉米杂交成胚率的影响。同时,通过在小麦与玉米杂交后的处理液中加入不同浓度AGP,研究AGP对小麦单倍体胚诱导率的影响。另外,在离体培养条件下发现玉米花粉诱导小麦单倍体胚多苗现象,并进行组织细胞学观察,对于在小麦杂交育种和单倍体育种合理利用SQ-1及AGP,提高玉米花粉诱导小麦单倍体成胚率等,具有一定参考价值。1 材料与方法
1.1 植物材料
冬小麦品种济麦22、扬麦16和科农199,春小麦品系Fielder、CB037和中国春（CS）由中国农业科学院作物科学研究所小麦分子遗传课题组收集、保存,兰州黑麦由北方民族大学生物科学与工程学院任贤教授提供。抗白粉病高代春小麦品系JW38由中国农业科学院作物科学研究所小麦分子遗传课题组利用宁春4号与CB037杂交,然后用宁春4号回交5次,自交4次,分子标记辅助选择结合白粉病抗性鉴定选育而成。2014—2016年,用于试验的冬小麦材料秋播于中国农业科学院作物科学研究所试验农场,春小麦材料和兰州黑麦分别冬播或春播于中国农业科学院作物科学研究所温室和试验农场。玉米杂交品种郑单58花粉取自中国农业科学院作物科学研究所温室。1.2 化学杀雄和人工去雄及授粉
化学杀雄方法：小麦拔节末期（旗叶一半露出倒二叶叶鞘,雄蕊发育处于药隔期）用小型压力喷壶喷施化学杀雄剂SQ-1（全国小麦杂种优势利用攻关协作组提供,中国农业科学院作物科学研究所矮败小麦课题组保存）,浓度为原药液的12%（添加1% Tween）,喷洒时间为下午17：00,抽穗2 d及时整穗（去除上、下部小穗和每个小穗中间小花）、套袋,整穗3 d（颖壳已蓬松、柱头羽毛状已张开）授小麦花粉或远缘植物（黑麦、玉米）花粉。人工去雄：小麦抽穗1—2 d及时整穗（花粉尚未成熟,去除上、下部小穗和每个小穗中间小花）、去除花药和套袋,去雄3 d授小麦花粉或远缘植物（黑麦、玉米）花粉。收集玉米新鲜花粉的方法为上午8：00抖去雄穗上的旧花粉,上午10：00用A4打印纸收集花药中的新鲜花粉。每个杂交组合至少设置3次重复。品种间杂交每个重复2穗以上,远缘杂交每个重复10穗以上,每穗22—26朵小花。化学杀雄剂SQ-1处理后小麦发育时期比对照推迟2—3 d,授粉时期相应比人工去雄推迟2—3 d。1.3 玉米花粉诱导后的处理和阿拉伯葡聚糖蛋白浓度设置
化学杀雄和人工去雄的小麦穗授玉米花粉后,分别于第2天和第3天用小型压力喷壶喷施含2,4-D（Sigma公司产品,货号为D7299）100 mg·L-1的处理液。为了研究阿拉伯葡聚糖蛋白对玉米花粉诱导后小麦单倍体成胚率的影响,在处理液中添加了0、0.5、1.0和2.0 g·L-1阿拉伯葡聚糖蛋白（Sigma公司产品,货号为G9752）。1.4 小麦远缘杂交幼胚离体拯救培养
小麦与黑麦、玉米杂交后18—20 d,从田间或温室中采集授以玉米花粉的全部小麦杂交穗和授以黑麦花粉的部分小麦杂交穗,剥取杂交籽粒（授玉米花粉的小麦颖果空瘪、膨大,没有胚乳;授黑麦花粉的颖果发育正常,包括胚和胚乳）,依次用70%酒精表面消毒1 min,15 %次氯酸钠灭菌20 min,无菌水冲洗5次,在解剖镜下取出杂交幼胚,胚轴朝上接种至1/2MS培养基（1/2MS大量元素、1/2MS微量元素、1/2MS铁盐、VB1 1.0 mg·L-1、谷氨酰胺150 mg·L-1、蔗糖20 g·L-1和植物凝胶2.4 g·L-1,pH6.0）上,每个培养管接种3—4个杂交胚,25℃黑暗条件下培养3 d,然后在25℃、光照条件下培养20—25 d。1.5 组织学和细胞学观察
小麦与玉米杂交诱导的小麦单倍体胚接种后2 d,在体式显微镜下观察单倍体胚的组织结构。小麦与黑麦杂交产生的二倍体胚和小麦与玉米杂交产生的小麦单倍体胚培养15—20 d时,从试管中培养的小麦植株上取1—2 cm长度的根尖,冰水处理24 h,浸泡在3﹕1的酒精与乙酸溶液中固定24 h,然后放入95%酒精中保存。将经固定液处理的根尖用1N HCl在60℃下水解14 min,然后用醋酸洋红进行染色,在相差显微镜下观察染色体数目。1.6 数据统计和分析
小麦与玉米杂交后20 d统计授粉小花数和发育籽粒数,接种后统计接种胚数,培养7 d后统计萌发胚数,培养15—20 d统计单倍体苗数,计算籽粒发育率（幼嫩籽粒数/授粉小花数×100%）、得胚率（接种胚数/授粉小花数×100%）、萌发率（萌发胚数/授粉小花数×100%）和成苗率（单倍体苗数/授粉小花数×100%）。小麦品种间及小麦与黑麦杂交后30—35 d直接收获成熟杂交穗,统计授粉小花数和结实粒数,计算杂交结实率（结实粒数/授粉小花数×100%）。用t测验分析人工去雄和化学杀雄间主要指标的差异显著性。2 结果
2.1 化学杀雄剂SQ-1对小麦品种间杂交结实率的影响
对3个小麦品种Fielder、科农199和济麦22先后在拔节末期和抽穗期进行化学杀雄和人工去雄,分别授以CB037或Fielder花粉,统计授粉小花数和结实粒数,计算杂交结实率（表1）。结果显示,Fielder、科农199和济麦22人工去雄的结实率分别为69.4%、82.8%和93.0%,化学杀雄的结实率分别为19.8%、73.3%和83.3%,人工去雄比化学杀雄的结实率高9.5%—49.6%。不同小麦品种内2个处理间的差异均达到极显著水平。结果表明,相比人工去雄,化学杀雄剂SQ-1处理显著降低了小麦品种间杂交结实率,对不同品种的影响不同,对Fielder的影响最大,对科农199和济麦22的影响相似。Table 1
表1
表1人工去雄与化学杀雄对小麦品种间杂交效果的影响
Table 1Effect of artificial emasculation and chemical hybridization agent on seed setting between wheat varieties
| 母本 Female parent | 去雄方式 Method for stamen treatment | 父本 Male parent | 授粉小花数 Florets pollinated | 结实粒数 Grains | 结实率 Setting rate (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| Fielder | AE | CB037 | 62 | 43 | 69.4 |
| Fielder | CHA | CB037 | 162 | 32 | 19.8** |
| 科农199 Kenong199 | AE | Fielder | 64 | 53 | 82.8 |
| 科农199 Kenong199 | CHA | Fielder | 150 | 110 | 73.3** |
| 济麦22 Jimai22 | AE | Fielder | 142 | 132 | 93.0 |
| 济麦22 Jimai22 | CHA | Fielder | 150 | 125 | 83.3** |
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2.2 化学杀雄剂SQ-1对小麦与黑麦杂交结实率的影响
利用小麦品种CS作为母本,兰州黑麦作为父本,研究了化学杀雄和人工去雄对小麦与黑麦远缘杂交结实率的影响。结果显示,人工去雄方式中CS与兰州黑麦的结实率为78.8%,SQ-1杀雄方式中CS与兰州黑麦的结实率为64.5%（表2）。与人工去雄方式相比,使用化学杀雄剂SQ-1降低了小麦与黑麦间杂交的结实率,差异达到显著水平（表2）。CS与兰州黑麦F1杂种根尖细胞有丝分裂中期染色体观察发现,人工去雄方式和化学杀雄剂SQ-1处理方式产生的F1杂种染色体数目均为28条（图1）,表明SQ-1处理对小麦与黑麦远缘杂交后的染色体构成没有影响。Table 2
表2
表2人工去雄与化学杀雄对中国春与兰州黑麦杂交效果的影响
Table 2Effect of artificial emasculation and chemical hybridization agent on seed setting in a wild cross between a wheat line Chinese Spring and a rye line Lanzhou Heimai
| 去雄方式 Method for stamen treatment | 授粉小花数 Florets pollinated | 结实粒数 Grains | 结实率 Setting rate (%) |
|---|---|---|---|
| 人工去雄AE | 250 | 197 | 78.80 |
| 化学杀雄CHA | 220 | 142 | 64.54* |
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1不同去雄方式获得中国春与兰州黑麦F1杂种的染色体构成鉴定
-->Fig. 1Identification of chromosome constitution of the F1 hybrid between a wheat line Chinese Spring and a rye line Lanzhou Heimai by different emasculation treatment methodsA：中国春;B：黑麦;C：SQ-1处理获得的中国春与兰州黑麦F1杂种;D：人工去雄处理获得的中国春与兰州黑麦F1杂种A: Chinese Spring; B: Lanzhou Heimai; C: The F1 hybrid between Chinese Spring and Lanzhou Heimai by SQ-1 treatment; D: The F1 hybrid between Chinese Spring and Lanzhou Heimai by artificial emasculation treatment
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2.3 化学杀雄剂SQ-1对小麦与玉米杂交成胚率的影响
冬小麦品种科农199、春小麦高代小麦品系JW38在拔节末期进行化学杀雄和人工去雄处理,分别授以玉米杂交品种郑单58花粉,统计授粉小花数、膨大籽粒数和形成幼胚数,计算籽粒膨大率和得胚率（表3）。对科农199而言,人工去雄情况下籽粒膨大率和成胚率分别为66.45%和14.29%,SQ-1化学杀雄情况下籽粒膨大率和成胚率分别为66.53%和1.41%;对JW38来说,人工去雄情况下籽粒膨大率和成胚率分别为54.69%和2.38%,化学杀雄情况下籽粒膨大率和成胚率分别为59.28%和1.11%。对科农199、JW38化学杀雄和人工去雄处理的颖果率和得胚率进行的t测验结果表明,SQ-1处理对颖果率没有影响,但对成胚率有显著影响,与人工去雄处理的差异达到了显著或极显著水平（表3）。认为化学杀雄剂SQ-1在阻碍了小麦雄配子发育的同时,也一定程度影响了小麦雌配子的发育,但对小麦种皮的发育没有影响。Table 3
表3
表3人工去雄与化学杀雄对小麦与玉米物种间杂交效果的影响
Table 3Effect of artificial emasculation and chemical hybridization agent on haploid wheat embryo induction between wheat and maize
| 母本 Female parent | 去雄方式 Method for stamen treatment | 授粉小花数 Florets pollinated | 颖果数 Caryopses obtained | 接种胚数 Embryos cultured | 颖果率 Caryopses formation rate (%) | 成胚率 Embryos induction rate (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 科农199 Kenong199 | AE | 301 | 200 | 43 | 66.45 | 14.29 |
| 科农199 Kenong199 | CHA | 496 | 330 | 7 | 66.53 | 1.41** |
| JW38 | AE | 715 | 391 | 17 | 54.69 | 2.38 |
| JW38 | CHA | 1621 | 961 | 18 | 59.28 | 1.11* |
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2.4 阿拉伯葡聚糖蛋白对小麦与玉米杂交成胚率和得苗率的影响
小麦品种扬麦16用玉米品种郑单58授粉后,分别用含阿拉伯葡聚糖蛋白0.5、1.0和2.0 g·L-1的2,4-D（100 mg·L-1）处理液处理,以不含AGP的2,4-D处理液作为对照。结果发现,随着2,4-D处理液中AGP浓度的增加,小麦单倍体胚的得胚率从11.5%逐渐提高到17.0%、萌发率从8.0%提高到12.0%、成苗率则从9.3%提高到14.5%（图2）,表明2,4-D处理液中加入0.5—2.0 g·L-1 AGP一定程度提高了小麦与玉米杂交后小麦单倍体胚的获得率,相应提高了小麦单倍体成苗率（图2）,认为AGP一定程度促进了小麦与玉米杂交后小麦单倍体胚的生长和发育。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2不同浓度AGP对小麦与玉米杂交产生小麦单倍体的影响
-->Fig. 2Impact of different AGPs concentrations on haploid wheat embryos and plants induction in the wild cross between wheat and maize
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2.5 玉米花粉诱导小麦单倍体胚的多苗现象
对小麦品种扬麦16与玉米品种郑单58杂交后产生的部分小麦单倍体胚在离体培养条件下进行了组织学观察,发现一些单倍体胚表面有2—6个突起（图3-A）。培养15—20 d,每个突起发育为独立的幼苗,即出现了一胚多苗现象（图3-B）,部分单倍体胚出现了4—6棵苗,在13.07%的单倍体胚上观察到了一胚多苗现象。这些一胚多苗植株只有1个根系（图3-B）,染色体检查结果表明,其染色体数目为21条（图3-C）,为没有加倍的单倍体植株。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3玉米花粉诱导小麦单倍体胚的组织学和染色体观察
-->Fig. 3Histological and cytological observation of haploid wheat embryos and plants derived from the wild cross between wheat and maizeA：小麦与玉米杂交后发育的单倍体胚,箭头所示为产生多苗的突起胚轴组织;B：小麦单倍体胚产生的多苗,箭头所示分别为1个胚产生的3个苗和6个苗;C：小麦单倍体植株的染色体组成（21条）A: Haploid wheat embryos induced by maize pollens, on which the original multiple embryonic axis were pointed by arrows; B: Multiple seedlings developed from a single haploid wheat embryo, in which 3 and 6 seedlings from a haploid embryo were indicated by arrows, respectively; C: Chromosome composition of haploid wheat plant (21 chromosomes)
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3 讨论
目前,在小麦杂交育种和单倍体育种中,配制杂交组合主要采用人工去雄、化学杀雄和雄性不育系利用等方式,这3种配制方式各有优劣。人工去雄授粉的配组自由度比较大,灵活性较好,其缺陷是耗费较多人工和时间,而且易受不良天气条件的影响。化学杀雄简便快速,成本较低,可以配制大量杂交组合,但很多化学杀雄剂的杀雄效果不够稳定,一经喷药就不能收获自交种子,对环境有一定影响。雄性不育系尤其是矮败小麦的利用[24-25],不但极大节约了人力和时间,可以大规模配制杂交组合并进行轮回选择[26-27],而且不受天气和环境条件的影响,不育系种子和可育系种子同时获得[25],但配制杂交之前需要把常用小麦亲本转育为矮败小麦,前期准备工作耗时较长。近几年,利用矮败小麦与玉米杂交,成功获得了2种类型的小麦单倍体植株,证明了矮败小麦用于小麦单倍体育种的可行性[28],另外发现,不同杂交技术对小麦与玉米种间杂交产生单倍体有一定影响,利用改良垂直剪颖剪药杂交技术不仅操作方便,而且功效高速度快[29]。育种工作中根据选用的杂交亲本和人员等具体情况,灵活运用各种杂交组合配制方式。迄今为止,化学杀雄剂SQ-1在小麦[9-11]、糜子[30]、谷子[31]等作物杂交育种中得到了较为广泛的应用,同时,对化学杀雄剂的作用机制也进行了一定研究。SONG等[32]的研究结果表明,化学杀雄剂SQ-1处理小麦植株后,小麦旗叶发生了氧化胁迫,叶片中的氧自由基、H2O2和丙二醛水平显著增加,相反,超氧化物歧化酶、过氧化物酶和愈创木酚过氧物酶等主要抗氧化酶的活性显著降低。BA等[33]利用cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-AFLP）和甲基化敏感扩增多态性（MSAP）对1 376株化学杀雄剂诱导的雄性不育株DNA甲基化水平进行了研究,发现6.66%的DNA序列在基因表达上发生了变化,3.42%的DNA序列出现了甲基化现象,喷施SQ-1后小麦植株中基因表达水平和DNA甲基化水平显著变化。ZHU等[34]运用转录组测序技术比较分析了SQ-1处理的小麦植株和对照植株花药部位的基因表达差异,发现1 088个基因在SQ-1处理和未处理的小麦花药中的表达水平有明显差异,其中的643个基因上调表达,445个基因下调表达,这些基因主要涉及到光合作用、呼吸作用、嘌呤和嘧啶代谢、氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢、RNA转运和信号转导等生理过程。WANG等[35]运用光学显微镜镜检、末端标记法和蓝色荧光染色等方法观察了SQ-1处理后小麦花药的显微结构,发现绒毡层细胞大量程序性死亡,进而导致花药败育。李莉等[36]通过利用2-DE凝胶电泳技术和生物信息学技术比较了小麦遗传性雄性不育系和SQ-1诱导的生理型雄性不育系,发现6个差异蛋白可能与雄性不育相关。
但是,化学杀雄剂SQ-1对小麦品种间杂交,以及小麦与玉米杂交后诱导小麦单倍体等的影响还鲜有报道。本研究探讨了SQ-1对小麦品种间杂交结实率的影响,以及小麦与玉米杂交后诱导小麦单倍体植株等的影响,结果表明,SQ-1处理后小麦品种间杂交的结实率以及小麦与玉米杂交后小麦单倍体胚和单倍体植株诱导率均有降低,认为SQ-1处理不但致使小麦小孢子败育,也一定程度影响了小麦大孢子的育性,具体原因有待进一步研究。
以往有关AGP促进植物胚胎发生的作用多侧重于培养基添加[21-23],AGP直接处理植株的研究则不多。研究发现,在适宜浓度2-吗啉基乙磺酸（3 mmol·L-1）和pH（6.4）条件下,喷施10 mg·L-1的AGP能够显著提高甘蓝花药培养胚胎发生率[37]。另外,LETARTE等[22]对2个春小麦品种喷施阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan,AG）和AGP,发现小麦花药培养的胚胎发生率和植株再生率显著增加。然而,有关AGP在小麦与玉米杂交中诱导小麦单倍体植株的影响还未曾研究。本研究发现,在小麦与玉米杂交后的2,4-D处理液中添加0.5—2.0 mg·L-1 AGP一定程度提高了小麦单倍体胚获得率、萌发率和成苗率,并且经AGP处理产生的单倍体胚出现了频率较高的一胚多苗的现象。陈新民等[38]用3个小麦品种与玉米杂交后,发现7.8%的胚表现为多苗现象（一个胚萌发出2—3个苗）,认为这种现象可能是由胚的多极化造成的。本研究中观察到玉米花粉诱导的部分单倍体胚表面有4—6个突起结构,进一步发育出4—6个苗,认为这些突起可能是发育形成多苗的胚性组织,一胚多苗现象可能在小麦与玉米杂交中广泛存在,有关其产生机制有待进一步探究。
4 结论
化学杀雄剂SQ-1处理情况下,不同小麦品种间杂交结实率为19.8%—83.3%,中国春与兰州黑麦杂交结实率为65.5%,不同小麦品种与玉米杂交诱导小麦单倍体胚成胚率为1.11%—1.41%;而在人工去雄情况下,不同小麦品种间杂交结实率为69.4%—93.0%,中国春与兰州黑麦杂交结实率为78.8%,不同小麦品种与玉米杂交诱导小麦单倍体胚成胚率为2.38%—14.29%;2种处理方式的差异达到显著或极显著水平,表明SQ-1显著降低了小麦品种间杂交及小麦与黑麦、玉米间杂交的结实性。在小麦与玉米杂交后的处理液中添加0.5—2.0 g·L-1 AGP一定程度上提高了小麦单倍体胚获得率和成苗率,13.07%的胚发育出了2—6株苗,这种一胚多苗现象出现在单倍体胚离体培养之前。The authors have declared that no competing interests exist.
