删除或更新信息,请邮件至freekaoyan#163.com(#换成@)

蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

谢丽雪, 郑姗, 张立杰, 张小艳, 李韬. 蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术[J]. , 2016, 49(22): 4366-4374 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.22.009
XIE Li-xue, ZHENG Shan, ZHANG Li-jie, ZHANG Xiao-yan, LI Tao. Development of IC-RT-nested PCR for the Detection of Blueberry shock virus[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2016, 49(22): 4366-4374 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.22.009

0 引言

【研究意义】蓝莓(Vaccinium spp.)为杜鹃花科越桔属(Vaccinium)多年生灌木,原产于北美,在北美、欧洲、南美和亚洲等地均有种植,其中美国和加拿大为主要生产国,约占世界蓝莓总产量的80%[1]。蓝莓被喻为世界第3代水果,具有抗氧化、抗癌、明目等功效,已被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一,其果实在鲜食、加工或作为高级化妆品原料等方面具有广阔的市场前景和较高的经济价值[2-3]。病毒病是蓝莓生产上的一种重要病害,对蓝莓的产量和品质能够造成不同程度的影响。蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是侵染蓝莓的主要病毒之一,该病毒属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)成员,最早在美国被发现[4]。BlShV能够侵染绝大多数蓝莓品种,引起的典型症状为开花期时花和叶片突然完全坏死,造成的产量损失可达34%—90%[5-6]。由于BlShV引起的蓝莓休克病至今尚无有效防治药剂,采用无毒苗是预防该病毒发生的关键,因此加强该病毒检测技术的研究,建立特异性强、准确性好、灵敏度高的快速检测技术具有重要意义。【前人研究进展】目前,用于BlShV检测的主要方法包括血清学ELISA和分子生物学RT-PCR技术。应用商品化的ELISA试剂盒检测BlShV,具有操作简便、特异性好、样品检测量大的优点。SPAK等[7-8]利用ELISA检测试剂盒,分别对捷克、塞尔维亚蓝莓上的BlShV、蓝莓焦枯病毒(Blueberry scorch virus,BlScV)、蓝莓带化病毒(Blueberry shoestring virus,BSSV)等多种病毒的发生情况进行了调查。SEDEGUI等[9]建立了一种能用于蓝莓叶片上BlShV检测的高通量ELISA方法,其特异性、灵敏度与标准ELISA方法相当或更高。由于灵敏度的限制,ELISA方法可能无法准确检测含量较低的病毒,容易出现假阴性的结果。相对于ELISA方法,利用RT-PCR检测BlShV具有时间快、灵敏度高和特异性强的突出优点,该技术已成功用于BlShV的检测。笔者前期根据BlShV外壳蛋白基因序列设计一对特异性引物,建立了以RNA为模板的普通RT-PCR检测方法[10]。因RNA提取步骤较多,不仅操作过程RNA易出现污染,而且操作者需要接触有毒试剂,所以在实际检测中仍有一定的不足。在RT-PCR基础上改进的IC-RT-PCR技术,无需提取RNA作为模板,该技术直接以抗体特异性捕捉病毒粒体,在简化操作、避免接触有毒试剂的同时减少了污染,近年来在病毒检测中应用越来越广泛。代欢欢等[11]以带有鸢尾黄斑病毒(Iris yellow spot virus,IYSV)的烟草叶片为材料,建立了IYSV的IC-RT-PCR检测技术,灵敏度是普通RT-PCR的4倍、DAS-ELISA的100倍以上。KUMAR等[12]通过对病毒提取液和RNA释放条件的优化,建立了用于葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevine leafroll-associated virus 3,GLRaV-3)快速检测的IC-RT-PCR技术。VISWANATHAN等[13]利用能够捕捉甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的重组抗体,建立了同时检测两种病毒的双重IC-RT-PCR方法,其灵敏度高于ELISA。Nested PCR是根据已报道的病毒基因序列,设计外侧、内侧两套引物,先以外侧引物进行第1轮扩增,再以扩增产物为模板,利用内侧引物进行第2轮扩增,该技术与普通RT-PCR相比,特异性更强、灵敏度更高。周彦等[14]针对柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)核酸结合蛋白基因的保守序列设计两对特异性引物,通过优化退火温度,建立了CYVCV巢式RT-PCR检测方法,灵敏度较RT-PCR提高100倍。ADKAR-PURUSHOTHAMA等[15]根据柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)外壳蛋白CP基因序列,设计特异性巢式PCR引物,建立了CTV特异、灵敏的RT-Nested PCR检测技术,用于显症和无症植株上CTV的快速检测,检测效果与荧光定量RT-PCR相当。LEE等[16]通过特异性引物设计和筛选,建立了桃丛簇花叶病毒(Peach rosette mosaic virus,PRMV)RT- nested PCR检测方法。【本研究切入点】IC-RT-nested PCR是一种将IC-RT-PCR与nested PCR相结合的病毒检测技术,能够进一步提高检测的特异性和灵敏度。关于应用该技术检测BlShV,到目前为止尚未见相关研究报道。【拟解决的关键问题】以BlShV为研究对象,蓝莓叶片提取液为材料,设计两对特异性引物,通过病毒抗体免疫捕捉病毒粒体和RT-nested PCR,建立BlShV的IC-RT-nested PCR分子检测技术,为农业生产和进出境口岸对蓝莓上BlShV的检测、监测提供有效的技术手段。

1 材料与方法

试验于2014年10月至2016年3月在福建省农业科学院果树研究所完成。

1.1 材料

供试蓝莓休克病毒(BlShV)、蓝莓焦枯病毒(BlScV)、蓝莓带化病毒(BSSV)、蓝莓叶斑驳病毒(Blueberry leaf mottle virus,BLMoV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)毒源由笔者实验室保存;蓝莓样品为中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片和进境美国蓝莓叶片;BlShV抗体、酶标抗体购自Adgen公司;TrizoL试剂购自Invitrogen公司;RT试剂、PCR mix购自Promega公司;pMD-18T载体购自宝生物(大连)有限公司产品;DNA Marker、胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 引物的设计与合成

根据GenBank已公布的BlShV运动蛋白基因(movement protein,MP)与外壳蛋白(coat protein,CP)的间隔区及CP基因部分区域序列,设计两对特异引物:BlShV-F(外侧正向引物)/BlShV-R(外侧反向引物)、BlShV-1(内侧正向引物)/BlShV-2(内侧反向引物),引物序列见表1。引物委托上海生物工程技术服务有限公司合成。
Table 1
表1
表1引物序列
Table 1Sequences of primers
引物名称 Primer name引物序列 Primer sequence (5′-3′)长度 Length (nt)目的片段 Expected size (bp)
BlShV-FCGAGTAATCATGGTTTGCAAG21746
BlShV-RGACCGGTATCGAACCTTCAC20
BlShV-1GTGGTCAGTGTAAGAAGTGC20486
BlShV-2CGTACTCCAAATCGGATGG19


新窗口打开

1.3 样品提取液的制备

称取蓝莓叶片0.3 g,加入3 mL样品提取缓冲液(磷酸盐缓冲液,pH 7.4,内含2% PVP,0.2%卵清蛋白,0.05%吐温20),研磨后4℃下8 000 r/min 离心10 min,取上清液作为样品提取液。以健康蓝莓叶片采用上述方法制备的提取液作为阴性对照。

1.4 DAS-ELISA

BlShV抗体用包被缓冲液(pH 9.6)稀释后,在酶标板中每孔加入100 μL,室温放置4 h或4℃下包被过夜;倒去酶标板中包被抗体溶液,PBST洗3次;在酶标板中每孔加入100 μL样品提取液,室温放置2 h或4℃下包被过夜;倒去酶标板中样品提取液,PBST洗3次;BlShV酶标抗体用酶标抗体缓冲液稀释后,在酶标板中每孔加入100 μL,室温放置2 h;倒去酶标板中酶标抗体溶液,PBST洗3次;在酶标板中每孔加入100 μL新配制的硝基苯磷酸二钠盐(pNPP)底物溶液。室温下避光放置,至阳性对照孔明显显色,用酶标仪测定405 nm下的OD值,若样品OD405 nm/阴性对照OD405 nm≥2,判为阳性;样品OD405 nm /阴性对照OD405 nm<2,判为阴性。试验以健康蓝莓叶片提取液作为阴性对照、感染BlShV病叶提取液作为阳性对照,重复2次。

1.5 普通RT-PCR

1.5.1 RNA提取 取样品提取液250 μL,加入1 mL TrizoL试剂,室温剧烈振荡后静置5 min;加入氯仿300 μL,充分颠倒混匀30 s,室温下静置5 min,4℃下12 000 r/min离心15 min,小心吸取上层水相;加入等体积异丙醇,颠倒混匀后室温静置15 min,4℃下12 000 r/min离心10 min,弃上清;沉淀用1 mL 75%冷乙醇洗涤,4℃下7 500 r/min离心3 min,弃上清,重复2次;沉淀充分干燥后用20 μL DEPC-H2O溶解沉淀。
1.5.2 RT-PCR 取3 μL RNA,加入外侧反向引物BlShV-R 1 μL、ddH2O 7 μL,70℃水浴10 min后迅速冰浴5 min,再加入5×M-MuLV反转录酶缓冲液5 μL、dNTPs(10 mmol·L-1)2 μL、RNasin(40 U·μL-1)1 μL、M-MuLV反转录酶(200 U·μL-1)1 μL。经42℃ 1 h、70℃ 10 min合成cDNA。PCR采用25 μL反应体系:外侧正向引物BlShV-F(10 μmol·L-1)1 μL,外侧反向引物BlShV-R(10 μmol·L-1)1 μL,2×Taq PCR mix 12.5 μL,cDNA模板3 μL,ddH2O 7.5 μL。PCR反应条件:94℃ 5 min;94℃ 30 s、51℃ 45 s、72℃ 1 min,35个循环,最后一轮循环后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统观察结果。

1.6 IC-RT-nested PCR

1.6.1 免疫捕获病毒粒子 将100 μL用包被缓冲液稀释200倍的BlShV抗体加入PCR管中,37℃孵育2 h;倒去抗体溶液,PBST洗3次,再加入100 μL用于DAS-ELISA检测的样品提取液,4℃包被过夜。
1.6.2 反转录 倒去PCR管中样品提取液,先后用PBST洗3次、DEPC-H2O洗2次,在PCR管中进行反转录。先向PCR管中加入外侧反向引物BlShV-R(10 μmol·L-1)1 μL、ddH2O 10 μL,70℃水浴10 min后立即冰浴5 min,再加入下列试剂:5×M-MuLV反转录酶缓冲液5 μL,dNTPs(10 mmol·L-1)2 μL,RNasin(40 U·μL-1)1 μL、M-MuLV反转录酶(200 U·μL-1)1 μL。经42℃ 1 h、70℃ 10 min合成cDNA,-20℃保存备用。
1.6.3 第1轮PCR扩增 以合成的cDNA为模板,进行第1轮PCR扩增。PCR反应体系:外侧正向引物BlShV-F(10 μmol·L-1)1 μL,外侧反向引物BlShV-R(10 μmol·L-1)1 μL,2×Taq PCR mix 12.5 μL,cDNA 3 μL,ddH2O 7.5 μL。PCR反应条件同1.5.2。
1.6.4 第2轮PCR扩增 取第1轮PCR产物0.5 μL作为模板,进行第2轮PCR扩增。PCR反应体系:内侧正向引物BlShV-1(10 μmol·L-1)1 μL,内侧反向引物BlShV-2(10 μmol·L-1)1 μL,2×Taq PCR mix 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反应条件:94℃ 3 min;94℃ 30 s,52℃ 45 s,72℃ 1 min,共30个循环,最后一轮循环后72℃延伸10 min。

1.7 IC-RT-nested PCR特异性测定

分别以BlShV、BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓的叶片提取液为材料,进行IC-RT-nested PCR,测定特异性。

1.8 IC-RT-nested PCR灵敏度测定

将感染BlShV蓝莓病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液进行10倍梯度稀释,依次稀释101、102、103、104、105和106倍,以健康蓝莓叶片提取液作为阴性对照,进行IC-RT-nested PCR和DAS-ELISA,测定灵敏度。

1.9 PCR产物的克隆和测序

PCR扩增产物经回收试剂盒回收后,连接到pMD18- T载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α,然后涂布含氨苄青霉素的LB培养基,筛选阳性克隆,送上海生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.10 蓝莓样品的IC-RT-nested PCR检测

应用IC-RT-nested PCR技术对收集的中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品和进境美国蓝莓叶片样品进行实际检测,同时利用普通RT-PCR方法进行测定。

2 结果

2.1 IC-RT-nested PCR扩增

设计的两对特异性引物对,外侧引物对(BlShV- F/BlShV-R)预期扩增片段大小为746 bp,内侧引物对(BlShV-1/BlShV-2)预期扩增片段大小为486 bp。利用蓝莓叶片提取液进行IC-RT-nested PCR,结果从感染BlShV病叶提取液中第1轮PCR扩增出约746 bp大小的目的片段,第2轮PCR扩增出约486 bp大小的目的片段,而健康蓝莓叶片提取液和空白对照经两轮PCR,未扩增出相应的目的片段(图1)。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图1IC-RT-nested PCR扩增
M:DNA分子量标准(100 bp) DNA Marker (100 bp);1、4:BlShV样品 BlShV sample;2、5:阴性对照 Negative control;3、6:空白对照 Blank control

-->Fig. 1Amplification of IC-RT-nested PCR
-->

2.2 IC-RT-nested PCR特异性测定

应用建立的IC-RT-nested PCR方法分别对BlShV、BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓叶片提取液进行检测,结果除BlShV第1轮、第2轮PCR扩增出特异性目的片段外,其余BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV及健康蓝莓叶片两轮PCR均未扩增出目的片段(图2),表明建立的IC-RT-nested PCR方法具有很强的特异性。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图2IC-RT-nested PCR的特异性
M:DNA分子量标准(100 bp) DNA Marker (100 bp);1:BlShV样品 BlShV sample;2:BlScV样品 BlScV sample;3:BSSV样品 BSSV sample;4:BLMoV样品 BLMoV sample;5:TRSV样品 TRSV sample;6:ToRSV样品 ToRSV sample;7:阴性对照Negative control

-->Fig. 2Specificity of IC-RT-nested PCR
-->

2.3 PCR产物序列分析

将IC-RT-nested PCR获得的BlShV第1轮、第2轮PCR产物分别回收纯化后,进行克隆测序。序列测定结果表明,BlShV的第1轮、第2轮PCR产物的序列全长为746、486 bp,与预先设计的片段大小完全相同。Blast比对发现,两轮PCR产物的序列与GenBank已报道的BlShV病毒基因序列高度一致,一致性达99%。序列测定结果表明,扩增到的目的片段为BlShV特异性产物,进一步验证了IC-RT-nested PCR扩增结果的准确性。

2.4 IC-RT-nested PCR灵敏度测定

将感染BlShV病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液按10倍梯度稀释后,分别进行IC-RT-nested PCR和DAS-ELISA,比较两种方法的灵敏度。测定结果表明,IC-RT-nested PCR灵敏度较高,第1轮PCR能够检测到稀释102倍的BlShV病叶提取液,经nested PCR,灵敏度提高100倍,能够检测到稀释104倍的BlShV病叶提取液(图3);DAS-ELISA灵敏度与IC-RT-nested PCR的第1轮PCR相当,为稀释102倍的BlShV病叶提取液,当BlShV病叶提取液稀释103倍以及更高倍数时,P/N值都<2(表2)。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图3IC-RT-nested PCR的灵敏度
A:第1轮PCR The first round PCR;B:第2轮PCR The second round PCR。M:DNA分子量标准(100 bp) DNA Marker (100 bp); 1:BlShV提取液(100) Crude extract of BlShV (100);2:101稀释101 dilution;3:102稀释 102 dilution;4:103稀释 103 dilution;5:104稀释 104 dilution;6:105稀释 105 dilution;7:106稀释 106 dilution;8:阴性对照 Negative control

-->Fig. 3Sensitivity of IC-RT-nested PCR
-->

Table 2
表2
表2DAS-ELISA检测灵敏度
Table 2Sensitivity of DAS-ELISA
稀释倍数 Dilution ratioP/N值 P/N value结果 Result
1006.86+
1015.24+
1022.44+
1031.31-
1041.12-
1051.08-
1061.06-

P/N:样品OD405 nm /阴性对照OD405 nm OD405 nm of sample/OD405 nm of negative control;+:阳性Positive;-:阴性Negative
新窗口打开

2.5 不同来源蓝莓样品检测

应用建立的IC-RT-nested PCR对中国福建、吉林、辽宁省蓝莓样品和进境美国蓝莓样品进行检测,结果从进境美国蓝莓2份疑似带毒样品上扩增出大小约486 bp的目的片段(图4),BlShV检出率为13.3%,而从53份中国福建、吉林、辽宁省蓝莓样品上未扩增出目的片段(表3),该结果与普通RT-PCR的验证结果完全相符,表明IC-RT-nested PCR能够有效用于田间及进出境样品上BlShV的检测。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图4美国进境蓝莓样品的IC-RT-nested PCR检测
M:DNA分子量标准(100 bp)DNA Marker (100 bp);1—15:蓝莓样品 Blueberry sample;16:阴性对照Negative control

-->Fig. 4IC-RT-nested PCR detection of blueberry samples from America
-->

Table 3
表3
表3不同地区蓝莓样品上BlShV的IC-RT-nested PCR、普通RT-PCR检测
Table 3IC-RT-nested PCR and conventional RT-PCR detection of BlShV of blueberry samples from different regions
来源
Source
数量
Number
检出率 Detection rate (%)
IC-RT-nested PCR普通RT-PCR Conventional RT-PCR
中国福建 Fujian, China2000
中国吉林 Jilin, China1800
中国辽宁Liaoning, China1500
美国 America1513.3%13.3%


新窗口打开

3 讨论

蓝莓休克病毒(BlShV)是危害蓝莓生产安全的一种重要病毒,发生严重时对蓝莓产量造成较大的损失。鉴于BlShV的危害性,加强该病毒检测技术的研究,建立快速、准确、灵敏的检测方法,提高早期病毒检出率,对于蓝莓无毒苗的筛选和最大程度地预防该病毒的发生有着重要意义。BlShV侵染蓝莓后引起的症状与蓝莓上另一种病毒蓝莓焦枯病毒(BlScV)极其相似,单从症状上难以区分,BlShV曾被误认为BlScV[17]。近年来,关于BlShV检测技术的研究较少,已报道的检测技术主要为血清学ELISA和普通RT-PCR两种。利用ELISA检测存在灵敏度低,易造成漏检的问题,而RT-PCR检测需要相对较为繁杂的RNA提取步骤,且对操作人员的技术要求较高,因此生产上有必要建立一种灵敏度高、操作简便的BlShV检测技术,以满足常规检测的需求。本研究以蓝莓叶片提取液为材料,利用IC-RT-PCR和Nested PCR技术,建立了用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR分子检测技术,该技术首先以病毒抗体特异性吸附病毒粒体,再进行反转录和巢式PCR,能够对BlShV进行有效检测。
应用IC-RT-PCR检测植物病毒的突出优点在于省去了RNA提取步骤,可以避免因某些植物组织成分的影响造成无法提取高质量的RNA。此外,还可以去除样品中PCR抑制因子,有利于植株体内低浓度病毒的检测[18]。本研究利用BlShV抗体在PCR管中免疫捕捉病毒粒体后,以设计的特异性外侧引物对(BlShV-F/BlShV-R)进行IC-RT-PCR,结果证实该方法能够从BlShV成功扩增出大小约746 bp的特异性目的片段。方法的特异性对于病毒的检测至关重要,直接影响到检测结果的准确性。本研究根据BlShV基因序列设计的引物具有较好的特异性,第1轮PCR外侧引物对、第2轮PCR内侧引物对,结果都仅从BlShV扩增出特异性目的片段,未从其他5种蓝莓RNA病毒(BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV)和健康蓝莓叶片上扩增出目的片段。实际上,因内侧引物对的扩增片段位于外侧引物对的扩增片段内部,非特异性目的片段同时包含两对引物结合位点的可能性极小,因此内、外侧两对引物组成的巢式引物,大大提高了检测方法的特异性。除巢式引物的特异性外,BlShV抗体对病毒粒体的特异吸附可能也有助于进一步提高检测的特异性。在病毒的分子检测中,通常需要对PCR产物进行测序验证,以明确PCR产物是否为特异性产物。本研究针对第1轮PCR(IC-RT-PCR)产物及第2轮PCR(巢式PCR)产物分别进行了克隆测序,序列结果证实两轮PCR产物都为BlShV特异性产物,大小分别与预期完全相符,并且与已报道的BlShV序列高度一致,一致性均达99%。
除特异性外,灵敏度是病毒检测方法的另一项重要评价指标。在病毒侵染寄主早期,寄主体内的病毒含量往往很低,因此建立的检测方法灵敏度必须达到一定的水平,才能准确检测到病毒的存在。前人研究表明,IC-RT-PCR的灵敏度比常规血清学ELISA具有更高的灵敏度[19-20]。WU等[21]利用制备的水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)单克隆抗体,建立了PTA-ELISA、dot-ELISA和IC-RT-PCR检测方法,灵敏度测定结果表明IC-RT-PCR的灵敏度最高,在检测水稻组织内RDV时分别是PTA-ELISA、dot-ELISA的8倍和64倍;闻伟刚等[22]报道,IC-RT-PCR检测齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)的灵敏度比DAS-ELISA高10倍,检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)的灵敏度比TAS-ELISA高100倍。但在本研究中,IC-RT-PCR(第1轮PCR)的灵敏度仅与DAS-ELISA相同,为稀释102倍BlShV病叶提取液,当稀释倍数达103倍或更高时,两种方法均无法检测到BlShV。Nested PCR能够显著提高检测方法的灵敏度,可比普通RT-PCR方法高100倍以上,如宋震等[23]在柑橘碎叶病毒(Citrus tatterle virus,CTLV)一步法RT-PCR检测体系基础上建立的巢式RT-PCR检测方法,灵敏度比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸最低浓度约1.27 μg·L-1;MORRIS等[24]建立的甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus,BNYVV)巢式RT-PCR,检测灵敏度比普通RT-PCR高103倍;闻伟刚等[25]报道的烟草环斑病毒(TRSV)和番茄环斑病毒(ToRSV)半巢式RT-PCR检测法也比普通RT-PCR提高103倍以上。本研究为提高IC-RT-PCR方法的检测灵敏度,在外侧引物对扩增区域内设计一对内侧引物,通过反应条件和程序优化,建立了IC-RT-nested PCR。经nested PCR,IC-RT-PCR的灵敏度提高了100倍,即通过第2轮PCR,灵敏度达到稀释104倍BlShV病叶提取液,这与前人报道的结果相吻合。
本研究建立的IC-RT-nested PCR快速检测技术具有较好的特异性和灵敏度,利用该技术对来自不同国家和地区的68份蓝莓叶片样品进行BlShV检测,检出的阳性样品及数量与普通RT-PCR方法验证的结果完全一致,表明该体系在实际检测应用中具有很强的可行性。然而,与普通RT-PCR检测相比,IC-RT-nested PCR虽然简化了操作步骤,但整个检测时间相对较长,特别是抗原需要包被较长时间才能进行RT-nested PCR,因此,在后期检测应用中,抗原的包被时间以及病毒粒体释放条件仍需进一步优化,以缩短检测时间,进一步提高检测效率。

4 结论

针对蓝莓上的蓝莓休克病毒(BlShV),建立了IC-RT-nested PCR快速检测技术。该技术特异性强、准确性好、灵敏度高,在蓝莓生产和进出境口岸上对BlShV的检测具有较好的应用价值,尤其是对低浓度病毒蓝莓样品的检测鉴定。
The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閻戣姤鍤勯柛顐f礀缁犵娀鏌熼崜褏甯涢柛瀣ㄥ€濋弻鏇熺箾閻愵剚鐝旂紓浣插亾濠㈣埖鍔栭悡娆撴煟閹寸倖鎴﹀煕閹扮増鍊垫慨姗嗗墻閻撳ジ鏌″畝瀣М鐎殿噮鍣e畷鎺戭潩椤掆偓椤棝姊虹拠鎻掝劉缁炬澘绉撮悾婵嬪箹娴f瓕鎽曞┑鐐村灦鑿ら柡瀣捣閳ь剙绠嶉崕閬嶅箠鎼淬垺鍙忛幖娣妽閳锋垿寮堕悙鏉戭€滄い鏂款樀閺岋繝宕ㄩ姘f瀰濡ょ姷鍋涢崯浼村箲閸曨厽鍋橀柍鈺佸枤濞兼棃姊洪崫鍕垫Ц闁绘鍟村鎻掆槈濮橆厽娈伴梺闈浤涢崨顖ょ闯濠电偠鎻徊鑲╁垝濞嗘挸浼犻柧蹇撴贡绾惧ジ鎮归崶顏勭毢濠⒀勬礋閺岋綁鏁愰崨顓熜╁銈庡亝缁诲嫰骞戦崟顖氫紶闁告洦鍠掗崑鎾诲锤濡や讲鎷洪梺鍛婄箓鐎氼參宕掗妸鈺傜厱闁靛ǹ鍎洪悡鑲┾偓瑙勬穿缂嶄線鐛崶顒佸亱闁割偁鍨归獮妤呮⒒娴h櫣甯涢柨姘扁偓娈垮枛閻栧ジ鐛弽顓炵疀妞ゆ帒顦遍崬鐢告偡濠婂啰鐏遍柛鎺撳笒閳诲酣骞橀搹顐P氶梻渚€娼х换鍫ュ磹閺嶎厼鍚归柛鎰靛枟閻撳啴鏌涘┑鍡楊仼闁逞屽墯閹倿骞嗛崘顕呮晝闁挎棁袙閹锋椽姊洪崨濠勨槈闁挎洏鍎插鍕礋椤栨稓鍘遍梺鍦亾濞兼瑩宕ú顏呯厵妞ゆ梹鏋婚懓鎸庮殽閻愬弶鍠橀柟顔ㄥ洤閱囨慨姗嗗幖椤忓綊姊婚崒娆戭槮闁硅绻濋獮鎰板幢濞戞ḿ顦ㄩ悷婊冪Ч钘熸慨妯垮煐閳锋垶鎱ㄩ悷鐗堟悙闁绘帗妞介弻娑㈠Ω閵堝懎绁銈冨灪瀹€鎼併€佸鈧幃銏$瑹椤栨盯鏁滈梻鍌欑閹诧紕绮欓幋锔芥櫇闁靛/鍛槸闂佹悶鍎崝濠冪濠婂牊鐓欓柟浣冩珪濞呭懘鏌h箛濠冩珕妞ゃ劊鍎甸幃娆忣啅椤旂厧澹庢繝娈垮枛閿曘儱顪冮挊澶屾殾婵°倕鎳忛崑鍌炲箹缁厜鍋撻幍鎸庡灴濮婄粯鎷呯憴鍕哗闂佹悶鍔忛崑鎰閹间緡鏁傞柛顐f儕閿曞倹鐓欓柟娈垮枛椤eジ鏌¢崨顔藉€愰柡灞诲姂閹倝宕掑☉姗嗕紦40%闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹妞嬪海鐭嗗ù锝夋交閼板潡寮堕崼姘珔闁搞劍绻冮妵鍕冀椤愵澀绮剁紓浣插亾濠㈣埖鍔栭悡娑氣偓骞垮劚妤犳悂鐛弽顓熺厱闁靛ǹ鍎遍埀顒€缍婇獮鍫ュΩ閵夊海鍠栧畷绋课旈埀顒勫箺閻㈠憡鐓熼煫鍥ㄦ尵缁犱即鎮楀☉鎺撴珚妤犵偛鐗撴俊鎼佸Ψ鎼达絽鏋涚€规洖缍婇、娆撳箚瑜嶇紓姘舵⒒娴g瓔鍤欑紒缁樺姇闇夋慨姗嗗幘椤╁弶銇勮箛鎾跺闁藉啰鍠栭弻鏇熺箾閸喖濮夊┑鈩冨絻閻楁捇寮昏缁犳盯鏁愰崨顒傜泿婵$偑鍊曟蹇涘箯閿燂拷
闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹瀹勬噴褰掑炊椤掑﹦绋忔繝銏f硾椤戝洭銆呴幓鎹楀綊鎮╁顔煎壈缂備讲鍋撳璺哄閸嬫捇宕楁径濠佸闂備線鈧偛鑻晶浼存煕閹烘挸绗ч柟椋庡Т椤斿繘顢欓崗鐓庘偓顖炴⒒娴h鍋犻柛搴灦瀹曟繂鐣濋崟顒€鍓銈嗗姀閹冲洭寮ㄩ懞銉d簻闁哄啫娴傚ḿ锛勬喐閻楀牆绗掗柡鍕╁劦閺屸€愁吋鎼粹€茬暗闂佺粯甯掗敃銉╁Φ閸曨喚鐤€闁规崘娉涢·鈧梻浣虹帛閹歌崵绮欓幋锔光偓锔炬崉閵婏箑纾梺缁樼濞兼瑦瀵奸幇鐗堚拺闁告繂瀚ˉ鐘绘煕閻樺啿濮夐柟骞垮灩閳藉鈻庤箛鏇犵嵁婵犵妲呴崹浼村箹椤愩倗灏电€广儱妫涚弧鈧紒鍓у閿氬褎鐓¢弻鐔虹矙閸喗姣愰梺浼欑悼閸忔﹢鐛幒妤€绠i柡鍐e亾闁哄倵鍋撻梻鍌欑缂嶅﹪宕戞繝鍥х婵﹢顤傞弫濠囨煛閸モ晛浜归柡鈧禒瀣厽闁归偊鍓氶埢鏇㈡煕閵堝洤鏋庨柍瑙勫灴椤㈡稑顫濋悡搴㈩啀缂傚倷娴囨禍顒勫磻閵堝鏄ラ柍褜鍓氶妵鍕箳閹存繍浠鹃梺缁樻尭缁绘﹢寮诲☉銏犵労闁告劗鍋撻悾鍫曟⒑閸濆嫭锛旂紒鎻掓健閸┾偓妞ゆ帒鍠氬ḿ鎰箾濞村娅囩紒杈╁仦缁楃喖鍩€椤掑嫬违濞达絿纭跺Σ鍫ユ煏韫囧ň鍋撻弬銉ヤ壕闁绘垼濮ら悡鍐级閻愰潧顣兼い锕€鍢查…璺ㄦ喆閸曨剛顦ラ梺瀹狀潐閸ㄥ潡銆佸▎鎾村剹妞ゆ劦鍋傜花钘夘熆鐟欏嫭绀嬫い銏★耿閹晠宕楅崫銉ф喒闂傚倷绀侀幖顐ょ矙娓氣偓閹﹢骞囬悧鍫濅画闂佸綊娼ч崯鍧楁偋濮樿埖鈷戦柛娑橈攻婢跺嫰鏌涚€n亝顥㈡い銏$墵瀹曠喖顢楅崒婊庡晭闂佽娴烽弫鍛婄仚閻庢稒绻堝铏圭磼濮楀棙鐣剁紓浣虹帛鐢帒宓勯梺鍦濠㈡ḿ鐚惧澶嬬厱妞ゆ劧绲跨粻妯汇亜閹惧瓨銇濇慨濠呮缁辨帒螣韫囷絼閭柟顔矫~婵堟崉閾忓湱鏆伴梻浣瑰缁诲倿藝娴兼潙鐓曢柟鐑樺灟閳ь剚甯掗~婵嬵敆娴h鍊峰┑鐐茬摠缁秶鎹㈤崼銉ヨ摕闁挎稑瀚▽顏堟偣閸ャ劌绲绘い顒€顑呴埞鎴︽倷閸欏妫戦梺鎼炲妺缁瑩鐛崘銊㈡瀻闁瑰瓨鏌ㄦ禍楣冩煟閵忋垺鏆╅柕鍡楋躬閺岋紕鈧綆鍋嗘晶鍨叏婵犲懏顏犵紒杈ㄥ笒铻i柧蹇涒偓娑欘敇闂備浇妫勯崯瀛樼閸洖钃熼柣鏂垮悑閸嬵亝銇勯弽銊ф噧闁诡垰鐗忕槐鎾存媴娴犲鎽甸柣銏╁灙閳ь剚鍓氶崵鏇熴亜閺囨浜鹃梺绯曟杹閸嬫挸顪冮妶鍡楃瑨閻庢凹鍙冨畷鎴︽晸閻樺磭鍙嗛梺鍝勫暙閸婂憡绂嶆ィ鍐╃厸闁糕剝岣块惌宀勬煙閸欏鍊愰柟顔ㄥ洤閱囨繝闈涚墱閸庡矂鏌f惔銈庢綈闁规悂顥撳▎銏狀潩鐠洪缚鎽曞┑鐐村灍閹冲洭鍩€椤掑﹦鐣垫鐐差儏閳规垿宕堕埡浣芥嫬闂傚倸鍊风粈渚€骞夐敓鐘冲殞濡わ絽鍟粻鐘诲箹濞n剙濡界紒鐘冲浮濮婄粯鎷呯粙鎸庡€紓浣风劍閹稿啿顕i幓鎺嗘婵犙勫劤瑜版椽姊婚崒姘偓椋庢濮樿泛鐒垫い鎺戝€告禒婊堟煠濞茶鐏¢柡鍛埣椤㈡盯鎮欑划瑙勫闂備礁鍚嬫禍浠嬪磿闁秴鐓曞┑鍌涚箓閳规垿鎮╅崹顐f瘎闂佺ǹ顑囬崑娑樼幓閸喒鏋庨柟鎯х枃琚濋梺璇插嚱缂嶅棝宕板Δ鍛惞閻忕偠濞囬弮鍫熸櫜闁告侗鍘藉▓顓犵磽娴e搫啸闁哥姵鐗犲濠氭偄閻撳海鐣鹃梺缁橆殔閻楁粌螞閸曨垱鈷戦悹鍥皺缁犵儤绻涢崨顔界闁瑰箍鍨归埞鎴犫偓锝庝簻閻庮厼顪冮妶鍡楀Ё缂佽弓绮欏鍐参旈崘顏嗭紳婵炶揪绲捐ぐ鍐╃閻愵剛绡€闁靛骏绲介悡鎰版煕閺冣偓閻楃娀骞冮敓鐘冲亜闁稿繗鍋愰崢鎾绘偡濠婂嫮鐭掔€规洘绮岄埢搴ㄥ箛椤忓棛鐣惧┑鐐差嚟婵挳顢栭崱娑欏亗闁哄洢鍨洪悡鍐煕濠靛棗顏╅柍褜鍓濋褏鍙呴梺鍦檸閸犳鎮″☉銏″€堕柣鎰硾琚氶梺闈╃秬椤濡甸崟顖f晝闁挎繂娲ㄩ悾鐢告⒑娴兼瑧鎮奸柛蹇斆悾鐑藉醇閺囩偟鍘搁梺鍛婂姀閺呮粓鎯侀幒妤佲拻闁稿本鐟︾粊鎵偓瑙勬礀閻忔岸骞堥妸鈺佺骇闁圭偨鍔嶅鑺ヤ繆閸洖閱囨繛鎴烆殕閻繘姊绘担铏瑰笡闁告梹娲熼獮鏍敃閿旇棄娈濋柣鐔哥懃鐎氥劍绂嶅⿰鍫熺厵闁绘垶锚閻忋儵鏌嶈閸撴瑧绱炴繝鍌滄殾闁瑰瓨绻嶅ḿ銊╂煃瑜滈崜鐔奉嚕婵犳艾鍗抽柣鏃囨椤旀洟鎮峰⿰鍐ら柍褜鍓氶崙褰掑闯閿濆拋鍤曢柟鎯板Г閸嬫劗绱撴担楠ㄦ岸骞忓ú顏呪拺闁告稑锕﹂埥澶愭煥閺囨ê鈧鍒掗銏犵闁规崘灏欑粻姘渻閵堝棗濮х紒鏌ョ畺钘熼柛顐ゅ枍缁诲棙銇勯幇鈺佺仾闁搞倕娲弻娑㈠煛鐎n剛鐦堥悗瑙勬磸閸旀垿銆佸▎鎾崇畾鐟滃秹宕f繝鍥ㄢ拻闁稿本鐟ㄩ崗宀€绱掗鍛仸鐎规洘绻堥弫鍐磼濮橀硸妲舵繝鐢靛仜濡瑩宕濋弴鐘愁偨闁绘劗顣介崑鎾荤嵁閸喖濮庡銈忕細閸楁娊骞冮垾鏂ユ瀻闁圭偓娼欓埀顒€鐏氱换娑㈠箣閻愬灚鍠楃紓鍌氬€归懝楣冣€﹂懗顖f闂佸憡鎸鹃崰鏍ь嚕婵犳碍鍋勯柛蹇曞帶閸擃剟姊洪崨濠勭細闁稿骸鐤囬埅闈涒攽鎺抽崐妤佹叏閻戣棄纾绘繛鎴欏灪閻撯偓闂佹寧绻傚Λ鏃傛崲閸℃稒鐓熼柟杈剧稻椤ュ骞嗛悢鍏尖拺闂傚牊渚楀褍鈹戦垾铏缂佸倸绉撮悾锟犲箥閾忣偅鏉搁梻浣虹帛閸旀牕岣垮▎鎾村€堕柨鏃囧Г閸欏繐鈹戦悩鎻掝仾闁搞倐鍋撴俊鐐€ら崢濂告倶濠靛缍栨繝濠傜墕閻掑灚銇勯幒鎴濐伀鐎规挷绶氶弻娑㈠箛閳轰礁顥嬮梺鍝勫暙閻楀棗顔忓┑鍥ヤ簻闁哄啫娲よ闂佺粯绻嶉崑濠囧蓟閿濆棙鍎熼柍銉ュ暱鏉堝懘姊虹粙娆惧剱闁圭懓娲璇测槈閵忕姷鐤€濡炪倖鎸鹃崑娑欐叏閵忕姭鏀介柣鎰皺婢с垽鏌涚€n偅灏甸柟骞垮灩閳藉顫濋敐鍛闂佹眹鍨诲▍銉ㄣ亹閹烘繃鏅涢梺瑙勫劤婢у海澹曢悾灞稿亾楠炲灝鍔欑紒鈧担鍦洸濡わ絽鍟埛鎺戙€掑锝呬壕濠电偘鍖犻崗鐐☉铻栭柛娑卞幘閺屽牓姊洪崷顓℃闁哥姵鐗滅划濠氭偐缂佹ḿ鍘棅顐㈡处濞叉牕鏆╅梻浣告惈濡顢栨径鎰摕闁斥晛鍟欢鐐哄箹濞n剙鐏柕鍡楋躬濮婅櫣鎷犻垾铏彲闂佺懓鍤栭幏锟�40%闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹妞嬪海鐭嗗ù锝夋交閼板潡寮堕崼姘珔闁搞劍绻冮妵鍕冀椤愵澀绮剁紓浣插亾濠㈣埖鍔栭悡娑氣偓骞垮劚妤犳悂鐛弽顓熺厱闁靛ǹ鍎遍埀顒€缍婇獮鍫ュΩ閵夊海鍠栭獮鎰償閿濆啠鍋撻幇鏉跨骇闁冲搫鍊荤粻鐐存叏婵犲懏顏犵紒顔界懇楠炴劖鎯旈姀鈥愁伆缂傚倸鍊峰ù鍥敋瑜忕划鏃堟偡閹殿喗娈鹃梺姹囧灩閹诧繝寮插┑瀣厓鐟滄粓宕滈悢鍑よ€垮〒姘e亾婵﹨娅g槐鎺懳熼崗鐓庢珣闂備胶顢婂▍鏇㈠礉濡ゅ啫鍨濋柡鍐ㄧ墱閺佸棝鏌涢弴銊ュ闁告﹩浜铏瑰寲閺囩偛鈷夊銈冨妼閹虫ê顕i幎鑺ュ亜闁稿繗鍋愰崢鐢告倵閻熸澘顏鐟版缁棃鎮滃Ο闀愮盎闂侀潧绻嗛崺妤咁敂閸繄鍘撮梺纭呮彧缁犳垿鎮欐繝鍕枑婵犲﹤瀚閬嶆煕閳╁啰鈯曢柍閿嬪笒闇夐柨婵嗘噺閸熺偤鏌熼姘卞ⅵ闁哄矉绲借灃濞达綀娅i悡澶愭倵鐟欏嫭绀冪紒顔肩焸閸┿儲寰勯幇顒夋綂闂佺偨鍎遍崢鏍箣闁垮绻嗛柣鎰典簻閳ь剚鐗犻幃褍螖閸愵亞鐓撻梺鍦亾閻綊鍩€椤掆偓閹虫﹢骞冨⿰鍫熷殟闁靛鍎伴崠鏍р攽閻愯埖褰х紒韫矙楠炴饪伴崼鐔告珫閻庡箍鍎卞ú銊у閻撳寒鐔嗛悹铏瑰皑閸旂喎霉閻橆喖鐏叉俊顐$劍瀵板嫮鈧綆鍓涢惁鍫ユ偡濠婂啰绠查柟渚垮姂楠炴﹢顢欓懖鈺傜劸婵$偑鍊栭悧婊堝磻濞戞氨涓嶆慨妯垮煐閻撴洜鈧厜鍋撻柍褜鍓熷畷鎴︽倷閻戞ê浜楅梺闈涱檧婵″洨绮绘ィ鍐╃厵閻庣數枪閳ь剚鍨垮畷鐑筋敇濞戞ü澹曞┑顔矫畷顒勩€傞懖鈺冪<缂備焦岣垮ú鎾煙椤旂懓澧查柟顖涙閸┿儵宕卞Δ鈧敮缂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓瀹曟劙宕妷褏鐓嬮悷婊呭鐢洭鍩€椤戣法绐旂€殿喗鎸虫慨鈧柣娆屽亾婵炵厧锕铏圭磼濡墎绱伴梺杞扮劍閻℃洟鍩呴敓锟�9闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閻戣姤鍤勯柛顐f磸閳ь兛鐒︾换婵嬪炊瑜庡Σ顒勬⒑閸濆嫮鈻夐柛鎾寸懅缁辩偛顫滈埀顒€顫忕紒妯肩懝闁逞屽墴閸┾偓妞ゆ帒鍊告禒婊堟煠濞茶鐏¢柡鍛埣椤㈡岸鍩€椤掑嫬钃熸繛鎴炵懅缁♀偓闂佸憡鍔忛弲娑㈠焵椤掍礁濮嶉柡宀€鍠栭、娑橆潩椤掍焦顔掑┑鐘愁問閸犳帡宕戦幘缁樷拺闂傚牊绋撴晶鏇㈡煙閾忣偄濮嶉挊婵囥亜閹板爼妾柍閿嬪灩缁辨帡顢涘☉娆戭槬婵犫拃鍐ㄧ骇缂佺粯鐩幊鐘活敆閳ь剟寮稿☉銏$厵妞ゆ洖妫涚弧鈧梺绯曟櫔缁绘繂鐣烽妸鈺婃晩閻熸瑥瀚褰掓⒒閸屾瑧顦﹂柟璇х節楠炴劙宕卞☉妯碱槰閻熸粌绉硅棢婵ǹ鍩栭埛鎴炴叏閻熺増鎼愰柣鎺撴そ閺屾盯濡搁埡鈧幉鐐殽閻愭潙濮嶉柟鐓庣秺椤㈡洟鏁嶉崟顓犳毎闂備浇顕х€涒晝绮欓幒鏇熸噷濠电姵顔栭崹閬嶅箰閹惰棄绠栫€瑰嫭澹嬮弸搴ㄧ叓閸ャ劍鎯勫ù鐘层偢濮婂宕掑顑跨敖闂佹悶鍔忓▔娑綖韫囨稒鎯為悷娆忓閸樺綊姊洪崨濠佺繁闁搞劋鍗抽幃褍顫濋懜纰樻嫼缂備礁顑呭ḿ锟狀敁濡ゅ啠鍋撶憴鍕闁告挾鍠庨敃銏℃媴缁洘鏂€濡炪倖鏌ㄩ~鏇熺濠婂牊鐓曢悗锝庡亝瀹曞矂鏌″畝鈧崰鏍€佸▎鎾澄╅柕澶涢檮閹瑩姊虹紒妯哄闁挎洦浜璇差吋婢跺﹣绱堕梺鍛婃处閸嬪懎鈻撻弻銉︹拺閻犲洠鈧磭浼堢紓鍌氱С缁€渚€锝炶箛鎾佹椽顢旈崟顓у敹闂佺澹堥幓顏嗗緤閸濆嫀锝夊醇閵夛腹鎷洪梺绋跨箰閸氬濡甸悢鍏肩厱闁靛ě鍕瘓婵犵绱曢弫濠氱嵁閸ヮ剙绾ч悹渚厜缁辨煡姊绘担铏瑰笡闁告梹岣挎禍绋库枎閹惧秴娲、鏇㈡晜鐟欙絾瀚奸梻浣告啞缁诲倻鈧艾鍢插嵄閻熸瑥瀚ㄦ禍婊堟煙鐎电ǹ浠ч柟鍐叉川閳ь剝顫夊ú妯兼崲閸繄鏆﹂柕濞р偓閸嬫挸鈽夊▎瀣窗闂佸憡蓱閹倿骞冨Δ鍐╁枂闁告洦鍓欓棄宥夋⒑閸涘﹦绠撻梺甯到閻g兘骞囬弶璇狙冾熆鐠虹尨鍔熼柡灞界墦濮婃椽宕滈幓鎺嶇按闂佺ǹ瀛╅悡锟犲箖閿熺姴鍗抽柣妯哄暱閺嬫垿鏌熼懝鐗堝涧缂佹彃娼¢幆灞解枎閹捐泛褰勯梺鎼炲劘閸斿酣鍩ユ径鎰厽闁圭儤鍨规禒娑㈡煏閸パ冾伃妤犵偛顑夐弫鎰板川椤撶倫銉╂⒒娴e懙鍦崲閹版澘瀚夋い鎺戝€瑰畷鍙夌箾閹存瑥鐏╃€瑰憡绻冮妵鍕箛閳轰胶浠煎銈庡墮椤﹂潧顫忛搹瑙勫珰闁炽儱纾禒顓炩攽閳藉棗浜滈柛鐔告綑椤曪綁顢曢敃鈧粈鍐煃閸濆嫬鈧悂顢撻幘鍓佺=濞达絽澹婇崕鎾寸箾婢跺绀冪紒鍌涘浮椤㈡﹢濮€閳锯偓閹风粯绻涙潏鍓у埌闁硅绻濆畷顖炴倷閻戞ḿ鍘介梺闈涒康婵″洭鎯岀€n喗鐓欑€瑰嫮澧楅崵鍥殽閻愬瓨宕屾鐐村笒椤撳ジ宕担璇℃%婵犵數濮烽弫鎼佸磻閻樿绠垫い蹇撴缁€濠傘€掑锝呬壕閻庢鍠楅悡锟犲箠閻樻椿鏁嗛柛鎰╁壉閿熺姵鈷戦悷娆忓閸旇泛鈹戦鍝勨偓婵嬪箖閿熺姴鍗抽柣鏂垮缁犳岸姊洪棃娑氬閻庢凹鍣h棟闁挎洖鍊归悡娆撴煕韫囨挸鎮戦柛濠冨姍閺岋紕浠﹂悾灞濄儲銇勮缁舵岸寮诲☉婊呯杸闁哄啫鍊堕埀顒佸笧缁辨帡顢欓懖鈺侇杸闂佺懓鍢查幊妯虹暦閻戠瓔鏁囩憸搴ㄦ煥閵堝鈷掑ù锝呮啞閹牊绻涚仦鍌氬鐎规洑鍗抽獮妯兼嫚閼碱剙骞嬮柣搴$畭閸庨亶藝椤栨粎涓嶉柟鎯板Г閻撴瑩鏌熼婊冾暭妞ゃ儱顦甸弻锝夊箳閹寸姳绮甸梺闈涙搐鐎氫即鐛€n亖鏀介柛顐g矎濡炬悂姊绘担鍛靛綊鏁冮妷銉庯絿鈧綆鍓涚壕浠嬫煕鐏炴崘澹橀柍褜鍓熼ˉ鎾跺垝閸喓鐟归柍褜鍓欓锝夋偨閸撳弶鏅㈤梺閫炲苯澧撮柍銉︽瀹曟﹢顢欓挊澶屾濠电姰鍨归崢婊堝疾濠婂牊鍎庢い鏍ㄦ皑閺嗭妇绱掔€n収鍤﹂柡鍐ㄧ墕閻掑灚銇勯幒鎴濇殶缂佺姾濮ょ换婵嬫偨闂堟稐鍝楅梺瑙勬た娴滅偟妲愰悙鍝勭劦妞ゆ帊鑳剁粻楣冩煕濠婂啫鏆熺紒澶樺枤閳ь剝顫夊ú鈺冪礊娓氣偓瀹曟椽鍩€椤掍降浜滈柟鍝勭Х閸忓瞼绱掗悩鑽ょ暫闁哄瞼鍠撻埀顒傛暩鏋ù鐙呯畵閺岋綁骞橀崡鐐插Б缂備浇椴哥敮鈩冧繆閹间焦鏅滃┑顔藉姃閾忓酣姊绘担铏广€婇柡鍌欑窔瀹曟垿骞橀幇浣瑰瘜闂侀潧鐗嗗Λ妤呮倶閿曞倹鍊电紒妤佺☉閹虫劙鎯岄崼婢濆綊鎮℃惔锝嗘喖闂佺粯鎸鹃崰鎰板Φ閸曨喚鐤€闁圭偓娼欏▍銈夋煟韫囨捇鐛滅紒鐘虫崌瀵鎮㈢喊杈ㄦ櫓闂佸吋浜介崕顖涚閵忋倖鈷戦弶鐐村閸斿秹鏌涢弮鈧悷銉╂偩閻戣棄閱囬柡鍥╁仧閸樻悂姊虹粙鎸庢拱缂佸鍨垮畷婵嗩潨閳ь剙顫忔繝姘<婵炲棙鍩堝Σ顕€姊虹涵鍜佸殝缂佺粯绻堥獮濠傗攽鐎n亞顦悷婊冾樀瀹曟垿骞橀幇浣瑰兊闂佺粯鎸告鎼佸煕鐎n偆绡€缁炬澘顦辩壕鍧楁煛娴g瓔鍤欓柣锝囧厴瀹曞ジ寮撮妸锔芥珜闂備胶枪閺堫剙顫濋妸鈺佄ч柨鏇炲€归埛鎺懨归敐鍛暈闁哥喓鍋ら弻娑㈠籍閳ь剟鎮ч悙鍝勎﹂柟鐗堟緲缁€鍐┿亜閺冨倹娅曢柛妯诲姍濮婄粯绗熼崶褍顫╃紓浣割槺閺佸骞冮檱缁犳稑鈽夊▎鎴濆箞闂備礁鐤囧Λ鍕涘Δ鍛祦婵°倕鎳忛崐鍨叏濡厧浜鹃悗姘炬嫹
相关话题/病毒 序列 技术 设计 健康