采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯 Y病毒株系组成

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沈林林, 邹文超, 高芳銮, 詹家绥. 采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯 Y病毒株系组成[J]. , 2016, 49(20): 3918-3926 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.20.006
SHEN Lin-lin, ZOU Wen-chao, GAO Fang-luan, ZHAN Jia-sui. Strain Composition of Potato virus Y in Fujian Province Detected with the Concatenated Sequence Approach[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2016, 49(20): 3918-3926 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.20.006

0 引言

【研究意义】马铃薯是仅次于水稻和小麦的全球第三大粮食作物^[1],也是世界上种植较为广泛的经济作物之一。中国是世界上马铃薯生产第一大国^[2],病毒病是制约马铃薯可持续发展的主要因素之一,它不仅使得马铃薯大幅减产^[3],而且还严重影响种薯质量^[4]。其中,马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是分布最为广泛且危害最为严重的病毒之一^[5-6]。因此,及时、准确地鉴定出PVY株系,有助于了解PVY的发生、分布情况及株系组成,可以为综合防控研究提供理论依据。【前人研究进展】PVY是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的代表成员^[7],其基因组由正单链RNA分子组成,大小约10 kb,包含一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,成熟后最终生成11个多功能蛋白^[7-8]。其中,P1蛋白的编码区位于PVY基因组的起始端,编码丝氨基酸蛋白酶（P1 peptidase）。该蛋白酶与RNA结合活力密切有关,并且影响病毒在细胞之间的传播^[9];VPg蛋白是一个无序的多功能蛋白,具有稳定病毒基因组结构的功能^[10];而CP蛋白在病毒RNA的衣壳过程中起着重要作用,且其序列具有高度的保守性,是检测PVY常用的分子标记之一^[4,10]。根据基因组内是否存在重组位点,PVY可以分为PVY^C、PVY^O、PVY^N等非重组株系以及在PVY^O和PVY^N株系之间不同基因区段重组而成的PVY^NTN、PVY^N-Wi、PVY^N:O等重组株系^[11]。除此之外,还有一些不常见的株系,如PVY^E[12-13]。其中,PVY^N-Wi株系含有两个重组位点,分别位于P1和HC-Pro/P3基因区域;而PVY^NTN-NW株系是近年来在研究叙利亚和中国分离物中新发现的重组株系,具有明显的PVY^NTN和PVY^N-Wi重组株系进一步重组的特征,并且含有SYR-I和SYR-II型两种基因组结构^[14-15]。目前,用于马铃薯病毒病检测的方法有传统生物学检测法、电镜观察、血清学检测及分子生物学等,但单独使用以上的任何一种方法均无法实现PVY株系的准确鉴定,因此,实践中需要综合应用多种方法进行分析。近年来,联合多基因系统发育被广泛用于细菌、真菌等的鉴定^[16-19]。在PVY株系鉴定中,杨庆东等通过P1和CP基因联合系统发育分析,可以将PVY^N:O、PVY^N-Wi、PVY^O、PVY^N和PVY^NTN准确区分开,但却无法准确区别PVY^N:O与PVY^NTN-NW（SYR-I 型）及PVY^N-Wi与PVY^NTN-NW（SYR-II 型）^[20-21]。高芳銮^[22]通过系统发育分析与性状关联分析,表明仅联合P1、VPg和CP基因分析可以将PVY的常见株系区分开来。【本研究切入点】福建省具有独特的地理气候优势,属于中国马铃薯南方冬作区。近年来,随着国家马铃薯主粮化战略的实施,福建省种植马铃薯的面积正呈逐年上升的趋势,在春粮作物中占有越来越重要的地位。为及时了解福建省PVY变异株系的分布情况,生产上迫切需要实现PVY的快速检测并准确鉴定出PVY株系。【拟解决的关键问题】通过RT-PCR扩增、基因克隆获得福建省长乐市、福清市两个马铃薯产区PVY样品的P1、VPg和CP 3个基因序列,结合序列特征,采用多基因联合方法实现PVY株系的快速、准确鉴定,为该病毒的流行、变异趋势及有效防控打下基础。

1 材料与方法

试验于2015年在福建农林大学植物病毒研究所完成。

1.1 毒源

2015年利用随机采样法在福建省长乐市、福清市马铃薯种植区采集17份带有重型花叶、叶脉坏死和垂叶条斑坏死症状等典型PVY症状的马铃薯病叶,将新鲜病叶分别放置在不同密封袋中并标记采样时间、地点及编号,置于-80℃超低温冰箱保存待用。

1.2 试剂

DNA聚合酶（TransTaq DNA Polymerase HiFi）、DNA Marker和连接载体试剂盒（pEASY-T5 Zero Cloning Kit）均购自北京全式金（TransGen）公司;ELISA检测试剂盒购自美国Agdia公司;植物总RNA提取试剂盒（RNAsimple Total RNA Kit）和DNA回收试剂盒（Gel Purification Kit）均购自天根（TianGen）生化科技公司;反转录试剂盒（ReverTra Ace qPCR RT Kit）购自TaKaRa公司。

1.3 血清学检测

按照ELISA检测试剂盒说明书进行操作,先将待测样品加入预包被抗体的酶标板中,放置在4℃冰箱孵育过夜,接着用PBST洗涤,之后将酶标抗体加入并对抗体进行检测,在室温下孵育2 h,再用PBST洗涤,再将底物（pNPP）加入以显色,使用Thermo Multiskan MK3酶标仪读取405 nm处的OD值,通过比较405 nm处的OD值并判断阴性、阳性。试验检测了17份样品,并且每份样品做3个重复试验,同时设计了3组对照,分别为阴性对照、阳性对照及空白对照。

1.4 RNA提取及基因克隆

根据植物总RNA提取试剂盒（RNA Simple Total RNA）说明书提取17份疑似受PVY感染的马铃薯叶片的总RNA。参照反转录试剂盒（ReverTra Ace qPCR RT Kit）说明书,使用引物oligo(dT)18进行反转录试验扩增双链PVY全基因组的cDNA。由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成3对简并引物,该引物序列分别为： P1-F（5′-CVATGGCAAYYTACAYGTCAAC- 3′）和 P1-R（5′-AGGRTATCTCADYHGTGCCC-3′）,KV-F（5′-TAATATTGGTGGAGAGAYTGCTTG-3′）和 KV-R（5′-GCTTCATGCTCYACYTCCTG-3′）,CP-F（5′-GSAAAYGAYACAATYGATGC-3′）和 CP-R（5′-CACATGTTYTTVACTCCAAG-3′）^[15]。利用合成的3对简并引物,分别对P1、VPg及CP基因进行PCR扩增,其预期的片段大小分别为915、737和803 bp。试验中PCR反应体系为25 μL,包括2.5 μL 10×TransTaq HiFi Buffer II,2 μL dNTPs（2.5 mmol·L^-1）,正向引物和反向引物（10 μmol·L^-1）各1 μL,0.25 μL TransTaq HiFi Polymerase（5 U·μL^-1）,1 μL cDNA和17.25 μL ddH₂O。PCR反应程序：首先在94℃下预变性处理4 min,随后在94℃下变性处理30 s,在53—55℃温度下退火30 s（P1、VPg和CP基因的退火温度分别为53、55和55℃）,再在72℃下延伸若干分钟（延伸时间按照1 min·kb^-1计算）,其中变性、退火和延伸这3个过程各进行30个循环,最后在72℃下终延伸5 min。取5 μL的PCR产物,加入到1 μL的6倍上样缓冲液（6×DNA Loading Buffer）,混匀后滴至1%琼脂糖凝胶的泳道中,采用110 V电压电泳30 min检测PCR产物。检测成功的PCR产物利用DNA回收试剂盒回收纯化,根据连接载体试剂盒（pEASY-T5 Zero Cloning Kit）的说明书,将回收产物与T5 Vector连接载体25℃连接15 min,连接后转化到DH5α感受态细胞中,最后通过菌落的重组子鉴定得到阳性克隆,并从阳性克隆中随机选择3—6个送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.5 序列分析及重组检测

利用DNAMAN 9（Lynnon BioSoft,Canada）软件对测序获得的序列进行拼接。通过NCBI上的BLASTn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在线工具分析序列一致性。使用重组分析软件RDP4对可能的重组事件进行检测,并通过Simplot 3.5分析潜在重组相似性作图（Similarity plot）。以PVY^N株系的Mont分离物（GenBank登录号：AY884983）和PVY^O株系的Oz分离物（GenBank登录号：EF026074）为参考亲本序列^[23]。

1.6 多基因联合系统发育分析

从GenBank中选择32个其他已知株系的PVY分离物作为参考（表1）。建树前,使用MEGA 5^[24]中的MUSCLE算法^[25]分别对建树的P1、VPg和CP基因序列进行多重序列比对后,应用SequenceMatrix^[26]进行序列串联,获得的合并序列采用邻接法（neighbor- joining,NJ）重建系统发育关系,最后应用自举法（Bootstrap）重复抽样1 000次以评估各分支节点的可靠性。
Table 1
表1
表1本研究采用到的PVY参考分离物的名称、株系分类及GenBank登录号
Table 1Name, accession number and classification of reference isolates downloaded from GenBank in this study

株系 Strain	分离物 Isolate	寄主 Host origin	GenBank登录号 GenBank accession number
PVY^C	SON41	龙葵 Nightshade	AJ439544
	LYE84.2	番茄 Tomato	AJ439545
	Adgen	马铃薯 Potato	AJ890348
PVY^O	SASA-110	马铃薯 Potato	AJ585195
	Oz	马铃薯 Potato	EF026074
	O-139	马铃薯 Potato	U09509
PVY^N	SCRI-N	马铃薯 Potato	AJ585197
	Mont	马铃薯 Potato	AY884983
	N-605	马铃薯 Potato	X97895
PVY^N(NA)	Tu660	马铃薯 Potato	AY166866
	RRA-1	马铃薯 Potato	AY884984
	SASA-61	马铃薯 Potato	AJ585198
PVY^NTN(a)	Hun-NTN	马铃薯 Potato	M95491
	PB312	马铃薯 Potato	EF026075
	PVY-AST	马铃薯 Potato	JF928460
PVY^NTN(b)	12-94	马铃薯 Potato	AJ889866
	34/01	烟草 Tobacco	AJ890342
	Gr99	烟草 Tobacco	AJ890343
PVY^N:O	Mb112	马铃薯 Potato	AY745491
	L56	马铃薯 Potato	AY745492
	PB209	马铃薯 Potato	EF026076
PVY^N-Wi	Wilga5	马铃薯 Potato	AJ890350
	PN10A	马铃薯 Potato	DQ008213
	N1	马铃薯 Potato	HQ912863
PVY^NTN-NW(SYR-I)	HN2	马铃薯 Potato	GQ200836
PVY^NTN-NW(SYR-I)	ShX14	马铃薯 Potato	KJ634024
	SYR-NB-16	烟草 Tobacco	AB270705
PVY^NTN-NW(SYR-II)	SYR-II-2-8	烟草 Tobacco	AB461451
PVY^NTN-NW(SYR-II)	SYR-II-Be1	烟草 Tobacco	AB461452
	SYR-II-DrH	烟草 Tobacco	AB461453
PVY^E	PVY-AGA	马铃薯 Potato	JF928459
	PVY-MON	马铃薯 Potato	JF928458

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2 结果

2.1 ELISA检测

在检测的17份样品中,共有13份样品与PVY抗体呈阳性反应,其余4份样品均呈阴性反应,检出率为76.47%（表2）,其中采自福建长乐的样本阳性检出率为83.33%,而采自福建福清的样本阳性检出率略低,为72.73%,两者相差10.60%。
Table 2
表2
表217份疑似PVY感染的马铃薯叶片的ELISA检测
Table 2ELISA detection of the 17 potato leaves with PVY-alike symptoms sampled

采样地点 Location	采样数 Sample size	检测数 Tested sample	阳性数 Positive sample	检出率 Positive rate (%)
长乐 Changle	6	6	5	83.33
福清 Fuqing	11	11	8	72.73
总计 Total	17	17	13	76.47

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2.2 目的基因的PCR扩增

利用简并引物P1-F/P1-R、KV-F/KV-R、CP-F/CP- R扩增到的PCR产物与预期的目的片段大小相一致,分别约为915、737和803 bp。福建长乐和福清两个产区的13个分离物以及阳性对照均可扩增到目的片段,阴性（健康马铃薯叶片）和空白对照都未扩增到相应的片段。
RT-PCR扩增获得的基因片段裁去冗余序列和载体序列后,经DNAMAN、BLAST等分析,确定P1、VPg和CP基因编码区大小分别825 bp（GenBank登录号KX376914-KX376918、KX376921、KX376922、KX376925、KX376927-KX376931）、564 bp（GenBank登录号KX376932-KX376936、KX376939、KX376940、KX376943、KX376945、KX376946-KX376949）和801 bp（GenBank登录号KX376950-KX376954、KX376957、KX376958、KX376961、KX376963-KX376967）。

2.3 目的基因的序列特征

序列一致性分析显示,福建13个PVY分离物的P1基因与8个参考株系的核苷酸序列一致性为72%—99%（表3）,其中分离物CL01、CL02、CL05、FQ08、FQ13与Oz的序列一致性最低,为72%—73%,与Wilga5、34/1、SYR-II-2-8的序列一致性最高,为88%—99%。而VPg和CP基因与8个PVY参考株系核苷酸序列一致性都比较高,分别为85%—99%和88%—99%（表3）。其中,VPg基因中分离物FQ01与Mont的核苷酸序列一致性最低,为85%,与Oz、PB209、Wilga5和HN2的序列一致性最高,为99%;CP基因中分离物FQ08与PB209、Wliga5、SYR-II-2-8、Oz、HN2的序列一致性最低,为88%—89%,与Mont、PB312、34/1的序列一致性最高,为93%—95%。结合3个基因的序列一致性分析结果表明,CL01、CL02、CL05和CL13 4个分离物与PVY^NTN-NW株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7个分离物与PVY^NTN-NW株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高,而FQ01分离物与PVY^N-Wi株系的核苷酸序列一致性最高,FQ08分离物与PVY^E株系的核苷酸序列高度同源。
Table 3
表3
表3PVY福建分离物和GenBank下载参考分离物之间的P1（单元格中第一个数据）、VPg（单元格中第二个数据）和CP（单元格中第三个数据）基因序列一致性
Table 3Nucleotide identity in the P1 (1st value in the cells), VPg (2nd value in the cells) and CP (3rd value in the cells) sequences between PVY isolates from Fujian and reference isolates downloaded from GenBank (%)

分离物 Isolate	Oz	Mont	PB209	Wliga5	PB312	34/1	HN2	SYR-II-2-8
CL01	73/88/99	99/96/90	99/88/99	89/88/99	98/99/92	89/99/91	99/99/99	89/99/99
CL02	73/88/99	98/96/90	99/88/99	89/88/99	98/99/92	89/99/91	99/99/99	89/99/99
CL03	83/88/99	89/96/90	89/88/99	99/88/99	89/99/92	99/99/92	88/99/99	99/98/99
CL04	82/88/99	89/96/90	89/88/99	99/88/99	89/99/91	99/99/91	88/99/99	99/99/99
CL05	73/88/99	99/96/90	99/88/99	90/88/99	98/99/92	89/99/91	99/99/99	89/99/99
FQ01	83/99/99	89/85/90	89/99/99	99/99/99	89/88/92	99/88/92	88/99/99	99/88/99
FQ02	83/88/99	90/96/99	90/88/99	99/88/99	89/99/92	99/99/91	88/88/99	99/99/99
FQ06	89/96/90	89/88/99	99/88/99	89/99/92	99/99/92	99/99/99	83/88/99	88/99/99
FQ08	72/87/88	98/95/95	98/87/88	88/87/88	97/97/94	88/97/93	89/97/88	88/97/89
FQ09	83/88/99	89/96/90	90/88/99	99/88/99	89/99/92	99/99/91	89/99/99	99/99/99
FQ11	83/88/99	90/96/90	90/88/99	99/88/99	89/99/92	99/99/91	88/99/99	99/99/99
FQ12	83/88/99	89/96/90	90/88/99	99/88/99	89/99/92	99/99/91	89/99/99	99/99/99
FQ13	73/88/99	98/96/90	99/88/99	89/88/99	98/99/92	89/99/91	99/99/99	89/99/99

Oz, Mont, PB209, Wilga5, PB312, 34/1, HN2, SYR-II-2-8 represented PVY^O, PVY^N, PVY^N:O, PVY^N-Wi, PVY^NTN(a), PVY^NTN(b), PVY^NTN-NW(SYR-I), PVY^NTN-NW(SYR-II), respectively. Their corresponding GenBank accession numbers were EF026074, AY884983, EF026076, AJ890350, EF026075, AJ890342, AB461451, GQ200863 and SYR-II-2-8, respectivelyOz、Mont、PB209、Wilga5、PB312、34/1、HN2、SYR-II-2-8分别为PVY^O、PVY^N、PVY^N:O、PVY^N-Wi、PVY^NTN(a)、PVY^NTN(b)、PVY^NTN-NW（SYR-I型）、PVY^NTN-NW（SYR-II型）株系,其对应GenBank登录号分别为EF026074、AY884983、EF026076、AJ890350、EF026075、AJ890342、AB461451、GQ200863、SYR-II-2-8

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Simplot分析显示,在长乐、福清两个产区的PVY分离物中,除了CP基因未检测到重组信号外,P1和VPg基因中均检测到潜在的重组信号（图1为FQ09分离物的Simplot分析图）,重组位点分别位于P1和VPg 基因区域内的第291和第128核苷酸位置,表明这些分离物均为重组型。

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图1PVY福建分离物重组位点检测
-->Fig. 1Detection of recombination breakpoints in the PVY isolates from Fujian Province
-->

进一步统计分析结果显示,长乐产区的P1基因为N型（60%）和N×O重组型（40%）,VPg基因均为N×O重组型,CP基因均为O型;福清产区的P1基因为N型（25%）和N×O重组型（75%）,VPg基因为N×O重组型（87.5%）和O型（12.5%）,CP基因除了一个分离物为N型外,其他均为O型（表4）。
Table 4
表4
表4福建长乐、福清产区PVY株系组成
Table 4Strain composition of PVY isolates sampled from Changle and Fuqing of Fujian Province

产区 Area	基因型 Genotype	基因Gene
产区 Area	基因型 Genotype	P1	VPg	CP
长乐 Changle	N	3	0	0
	O	0	0	5
	N×O	2	5	0
福清 Fuqing	N	2	0	1
	O	0	1	7
	N×O	6	7	0
合计 Total	N	5	0	1
	O	0	1	12
	N×O	8	12	0

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2.4 多基因联合系统发育分析

使用 NJ 法构建的系统发育树如图2所示,所有的PVY分离物共形成了11个簇,其中来自同一株系的分离物以较高的置信度相聚在一起,表明PVY具有显著的株系特异性。本研究获得的4个分离物CL01、CL02、CL05和FQ13与PVY^NTN-NW株系SYR-I型的3个分离物以较高的自举值（BP=97）聚为一簇,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和FQ12 7个分离物与PVY^NTN-NW株系SYR-II型的3个分离物也以较高自举值（BP=97）聚为一簇,但FQ01分离物与PVY^N-Wi株系的3个分离物以较高的自举值（BP=97）聚为一簇,FQ08分离物与PVY^E株系的两个分离物以较高的自举值（BP=97）聚为一簇。系统发育分析表明,在进化关系上CL01等4个分离物与PVY^NTN-NW株系SYR-I型最近,CL03等7个分离物与PVY^NTN-NW株系SYR-II型最近,而FQ01分离物与 PVY^N-Wi株系最近,FQ08分离物与PVY^E株系最近。

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图2基于NJ法重建的PVY P1、VPg和CP联合基因系统发育树
-->Fig. 2Phylogenetic tree reconstructed from the concatenated sequences of P1, VPg and CP genes using neighbor-joining method
-->

3 讨论

PVY可以由40种多种蚜虫频繁传播,从而加快了流行速度^[10]。农产品全球化销售及其本身快速变异的特点,也增加了PVY准确鉴定的难度。福建省是重要的南方马铃薯冬作区,鉴定并了解福建省PVY株系的分布情况和组成,对该省PVY防控和发展中国马铃薯产业至关重要。ELISA是PVY检测上最为常用的血清学方法之一,虽然可以快速、简便地检测大量的疑似样品,但灵敏度低于以核苷酸为基础的PCR方法,因而对于PVY含量低的材料容易漏检。例如,高芳銮等^[4]分别用ELISA分析了采自重庆的28份感染PVY的马铃薯叶片,阳性检出率仅为43%（12/28）,而改用RT-PCR方法时,阳性检出率则是100%。本试验通过ELISA检测了17份疑似PVY样品,其中4份样品呈阴性反应,并经CP基因的PCR扩增确定不含有PVY。17份样品中有13份呈阳性反应,检出率为76.47%,相比2011年福建长乐和福建福清的PVY检出率（75.00%）略高一些^[4],说明PVY在福建省马铃薯主要种植生产区长乐和福清普遍发生,且发生频率稍有提高。究其原因,可能归因于福建省农产品贸易发达,马铃薯种薯和产品的调运,加快了PVY的传播。
由于PVY株系分化现象明显,传统上普遍采用的以CP单一基因为基础的分子分类方法无法满足PVY株系的快速、准确鉴定需求。采用CP单基因系统发育分析,可以将PVY^O外的其他株系很好地区分开来,但无法正确识别PVY^N:O、PVY^N-Wi和PVY^NTN-NW3种株系,因为它们的CP基因都是O型。通过全基因组序列分析可以获得不同分离物的株系结构类型^[27],但试验成本较高,且实用性较差^[28]。而多基因联合分析弥补了这些不足,为准确、快速地鉴定PVY常见株系提供了可能。在PVY基因组中,P1、HC-pro、VPg和CP基因是重组热点的区域^[23]。为实现PVY的快速检测和鉴定,高芳銮^[22]以这4个基因为研究对象,采用不同基因组合分别进行系统发育分析,并通过系统发育与性状关联分析进一步验证各种组合中代表分离物与株系的关联系数及相关参数,结果表明联合P1、VPg和CP 3个基因即可将PVY的常见株系区分开。利用此联合多基因方法,笔者实验室鉴定到PVY一株新的重组分离物GF_YL21^[22,29],表明该方法不仅可以实现对PVY常见株系的准确鉴定,还可以实现对新重组分离物的预判。本文对福建省马铃薯主栽区PVY分离物P1、VPg和CP基因进行RT-PCR扩增,并联合PVY基因组重组热点所在的3个基因进行系统发育分析,表明PVY在福建省长乐市、福清市两个马铃薯种植区普遍发生,重组株系已成为田间的主流株系,且PVY^NTN-NW是优势株系。梁五生等^[30]通过统计分析发现中国的PVY群体主要以PVY^N株系为主,但高芳銮等^[4]通过对中国14个省PVY分离物的检测鉴定,表明PVY在马铃薯主要种植区普遍发生的多为重组株系。导致两种不同结论的可能原因主要在于PVY基因组中P1、HC-pro、CP等基因区段重组频繁,仅通过一个或两个基因进行分析,无法获得PVY株系的准确鉴定。本研究的多基因联合分析结果显示,重组株系已经成为了田间的主流株系（100%）,包括PVY^NTN-NW株系SYR-I型、PVY^NTN-NW株系SYR-II型、PVY^N-Wi株系和PVY^E,进一步支持高芳銮等的鉴定结果^[4]。重组株系被认为可能比非重组株系具有更强的致病力^[11],并已在世界各马铃薯种植区越来越流行,因此生产上需要密切关注这些重组株系的发展动态。

4 结论

通过ELISA方法对采自福建省马铃薯产区的17份疑似PVY样品进行检测,阳性检出率平均为76.47%,表明PVY在福建省马铃薯长乐市、福清市两地普遍发生;通过P1、VPg和CP 3个基因的序列特征及联合多基因系统发育分析,表明PVY重组株系已成为田间的主流株系,尤其是PVY^NTN-NW株系。
（责任编辑岳梅）
The authors have declared that no competing interests exist.