位置功能候选基因HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160 与猪肢蹄结实度的关联性

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本站小编 Free考研考试/2021-12-26

张徐非, 候利娟, 邱恒清, 黄路生, 郭源梅. 位置功能候选基因HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160 与猪肢蹄结实度的关联性[J]. , 2016, 49(20): 4030-4039 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.20.016
ZHANG Xu-fei, HOU Li-juan, QIU Heng-qing, HUANG Lu-sheng, GUO Yuan-mei. An Association Study of Positional and Functional Candidate Genes HMGA1, C6orf106 and ENSSSCG00000023160 with Leg Soundness in Pigs[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2016, 49(20): 4030-4039 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.20.016

0 引言

【研究意义】肢蹄结实度反映猪前后肢蹄的结实程度,一般通过外在的肢蹄评分和步态评分来度量^[1]。不结实的肢蹄是一种病,称为肢蹄软弱（leg weakness）。猪肢蹄软弱发病率高,病因复杂,且难以治愈,导致大量种猪和生产母猪被动淘汰。据报道：在通过了生产性能测定的后备公猪中,有20%—50%的后备公猪因肢蹄软弱而被淘汰^[2-3];在生产母猪中,也有6.1%—15%的母猪因肢蹄软弱而被淘汰^[4]。肢蹄结实度作为一个复杂性状,它受遗传和环境因素的共同影响。猪肢蹄结实度具有中等遗传力,其遗传力为0.1—0.5^{[3, 5-7]}。ROTHSCHILD等在一个杜洛克群体中对肢蹄结实度进行5个世代的歧化选择后,正向选择群体的肢蹄结实度显著高于反向选择群体^[7]。因此,对肢蹄结实度的遗传解析可以为它的遗传改良奠定基础。【前人研究进展】利用全基组连锁分析,定位了很多肢蹄结实度的数量性状基因座（quantitative trait locus, QTL）;通过全基因组关联分析（genome- wide association analysis,GWAS）,鉴别了一些与肢蹄结实度关联的单核苷多态（single nucleotide polymorphism,SNP）。在猪的QTL数据库中,一共收录了278个控制肢蹄结实度的QTL或与之关联的SNP^[8]。本研究小组在白色杜洛克×二花脸的F₂资源家系中,利用183个微卫星标记,通过全基因组扫描,一共定位到42个影响肢蹄结实度的QTL,其中7号染色体SW1856—S0102区间内的QTL效应最大、置信区间最小（只有6 cM）^[9]。利用Illumina公司猪60K SNP芯片,在该F₂资源群体和苏太群体中,通过GWAS,将影响前后肢步态评分的基因位点定位在7号染色体上一个2.15 Mb的连锁不平衡框内,其最强关联的SNP为35.18 Mb的MARC0033464^[10]。【本研究切入点】目前,对肢蹄结实度的测定仅停留在外观上,缺乏一种内在的评估方法。另外,7号染色体最强关联区域内的基因与肢蹄结实之间度的关联也没有报道。【拟解决的关键问题】建立一种通过内在的关节评分来度量肢蹄结实度的方法,并与现有方法作比较,评估该方法的必要性。另外,在7号染色体最强关联区域内筛选3个位置功能候选基因,并对其多态位点进行搜寻,然后在每个候选基因中筛选3个保守的多态位点,在F₂、苏太、莱芜、二花脸和杜长大5个群体中进行关联分析,寻找与肢蹄结实度显著关联的多态位点,为肢蹄结实度的标记辅助选择奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验群体本研究一共用了5个试验猪群,即F₂资源群体、苏太猪、二花脸、莱芜猪和杜长大群体。F₂资源群体以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为亲本,杂交产生F₂代^[11]。苏太猪是杜洛克公猪和太湖母猪杂交,经19个世代对繁殖和生长性状的选育,培育而成的母系品种^[10]。331头二花脸和314头莱芜猪分别购自江苏省焦西二花脸合作社和山东省莱芜原种猪场。在4—5月龄从购买猪场运至江西省南昌市国鸿生态园猪场进行肥育。二花脸公母猪均进行了阉割,莱芜猪只对公猪进行阉割。这4个群体在肥育期间均饲喂含3 100 kJ可消化能、16%粗蛋白和0.78%赖氨酸的全价配合饲料,自由采食和饮水,且采用相同的饲养管理方式,自由采食和饮水。F₂资源群体和苏太猪在240日龄左右屠宰,二花脸和莱芜猪在300日龄左右屠宰。610头杜长大来自江西国鸿集团修水商品猪场。公猪在出生时阉割,母猪不阉割。分阶段饲喂相应的配合饲料,自由采食和饮水,体重在110 kg左右屠宰。
1.1.2 表型测定各个表型的测定,分别由同一人根据相同的标准在江西省南昌市进行测定。肢蹄评分和步态评分采用GUO等建立的方法在饲养场地进行测定^[9]。在F₂资源群体（2002—2006年）和苏太猪（2010—2011年）和莱芜猪（2012—2014年）群体中,肢蹄评分和步态评分都在220日龄左右进行测定,莱芜猪（2012—2014年）群体在300日龄左右进行评定。屠宰后,前后蹄从屠体上分割下来,根据蹄子的大小、均匀度、受损程度等进行评分。蹄子大、均匀且没有损伤评5分;蹄子很小、非常不均匀或损伤严重评1分。左侧的肱二头肌完整地从前肢剥离下来,用电子天平和游标卡尺分别测定其重量和长度。前后肢四肢骨的主要关节面,根据表1的评分标准进行评分。
Table 1
表1
表1猪关节面评分标准
Table 1The criteria for joint surface score

得分 Score	1	2	3	4	5
示意图 Schematic diagram
评分标准 Criterion	大面积的裂痕,且裂痕很深;或有大面积的损伤,且损伤很严重 Very large and deep rip, or very large and serious damage	中等面积的裂痕,且裂痕较浅;或有中等面积的损伤,且损伤较严重 Moderate and shallow rip, or moderat and serious damage	小面积的裂痕,且裂痕较浅;或有小面积的损伤,且损伤较轻 Small and shallow rip, or small and slight damage	很小面积的裂痕,且裂痕很浅;或有很小面积的损伤,且损伤很轻 Very small and shallow rip, or very small and slight damage	没有裂痕,也没有损伤 No rip and no damage

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1.1.3 基因DNA的提取个体屠宰后,用剪刀剪取适量的耳组织或脾脏,贮存于装有75%的酒精溶液的EP管中备用。采用常规酚氯仿法从耳组织或脾脏中提取
基因组DNA,经质量检测和浓度测定后稀释成50 ng·μL^-1的工作液备用。

1.2 试验方法

1.2.1 位置功能候选基因的筛选及其SNP的搜寻在7号染色体上,以最强关联SNP为中心的0.4 Mb范围内一共有6个基因。HMGA1编码一种影响软骨细胞生长和分化的非组蛋白^[12];C6orf06基因可能与骨骼生长相关,因为在C6orf06和HMGA1区域内鉴别到与人类身高显著关联的SNP^[13-15];ENSSSCG00000023160的功能未知;这3个基因可能会影响肢蹄结实度,因此把它们作为肢蹄结实度的候选基因。RPS10编码一种核糖体蛋白S10,与人的先天性纯红细胞再生障碍性贫血关联^[16];SPDEF编码上皮特异性ETs转录因子,与小肠杯状细胞的分化和成熟有关^[17];PACSIN1编码神经元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物1,调节神经元轴突的延伸和分支^[18];这3个基因的功能均与肢蹄结实度不相关,因此可以排除。
从Ensembl网站上（http://www.ensembl.org/index. html）获取猪HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160 3个候选基因的基因组序列。根据其基因组序列,使用在线引物设计软件Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/）分别设计16、50和5对引物对这3个基因的多态位点进行搜寻。
HMGA1和C6orf106 SNP基因多态位点搜寻的模板为3头F₁公猪（耳号分别为17、29和41号）组成的DNA池。ENSSSCG00000023160则对所有的F₀代个体单独进行测序,搜寻多态位点。PCR扩增后产物用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的有效性,合格的DNA样品经QIAquick DNA纯化试剂盒纯化后,送上海生工进行双向测序,获得所需序列。用DNAStar软件包的Seqman程序进行序列分析,鉴别多态位点。
1.2.2 多态位点的筛选及基因型判定用Clustal W软件,选取猪、狗、奶牛、人、鼠和兔子6种哺乳动物DNA序列,对C6orf106进行保守性分析^[19]。选取3个在这6种动物间保守且具有代表性的SNP用于基因判型,并利用相应限制性内切酶进行酶切验证其多态性。设计3对探针和引物,使用7900HT Fast Real-time PCR System分别对g.2054T>C、g.6953T>C和g34542A>T进行基因分型^[20]。
沈虎群对HMGA1进行测序,搜寻到9个SNP,并在F₂资源群体中对其中的g.1149C>T、g.2029C>T和g.3155A>G进行基因型检测^[21]。在F₂资源群体中,本研究直接使用他的分型结果。在另外的4个群体中,对这3个位点进行基因分型。
ENSSSCG00000023160基因采用基因型填补法（genotype imputation）来获取F₂个体所有多态位点的基因型^[22]。首先对全部的F₀代和F₁代个体的测序,获取F₀和F₁代个体该基因所有多态位点的基因型。然后在该基因两侧翼临近区域内选取15个多态性好的60K SNP芯片上的SNP位点（F₀、F₁和F₂个体的基因型都已知）,与该基因的基因型进行整合（F₂代个体的基因型均为缺失）,利用SimWalk2.9软件,构建所有个体的单倍型^[23]。最后根据个体的单倍型来重建 F₂个体的基因型。为了评估基因型填补法的准确性,在60K SNP芯片中,选取5个位于该基因两侧翼、且F₀和F₁代个体的基因型分别与该基因5个多态位点相类似的SNP,保留F₀和F₁代个体的基因型,把F₂个体的基因型设为缺失,通过上述方法获取F₂个体的基因。芯片检测的基因型和基因填补获得的基因型之间吻合度可以用来评估基因填补的准确性。吻合度越高,基因型填补法获取的基因型就越准确。

1.3 统计分析方法

1.3.1 表型相关及性别差异检验表型简单统计量的计算及性别差异检验都在统计软件SAS9.0（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）上完成的。CORR过程用于计算表型之间的简单相关系数;TTEST过程检验表型在性别之间的差异。
1.3.2 关联分析利用R软件中的GenABEL软件包,使用下面模型对肢蹄结实度相关性状进行关联分析^[24]：
y = Xb + Zu + sa + e
其中,y是表型向量;b是固定效应向量,包括性别和批次,分析肱二头肌长度和重量是还包括胴体重;u是加性遗传效应向量,服从N(0, G σ²_α),G为基因组亲缘关系矩阵,利用猪60K芯片常染色体上SNP的计算得到^[25-26];σ²_α为加性方差;a为SNP等位基因的替代效应;X和Z分别为b和u的指示矩阵;s是a的指示向量;e是残差向量,服从N(0, Iσ²_e)。

2 结果

2.1 多态位点搜寻

设计了50对引物对C6orf106进行全基因多态位点的搜寻,一共搜寻到多态位点个SNP^[20]。用Clustal W软件对这174个多态位点进行保守性分析,有9个SNP在猪、狗、奶牛、人、鼠和兔子中是保守的^[20]。从这9个保守的SNP中,选取3个具有代表的SNP,即g.2054T>C、g.6953T>C和g34542A>T,在这5个群体进行基因分型。
设计了5对引物对ENSSSCG00000023160进行全基因多态位点的搜寻,一共搜寻得到5个多态位点,即g.1129G>C、g.2284C>G、g.2430C>T、g.2813G>A和g.3231AA>--。利用基因填补法获取F₂资源群体中F₂个体的基因型。根据两侧翼5个SNP的基因填补的模拟结果,基因填补的错误率分别为2.73%、0、0.2%、1.0%和0.4%。

2.2 多态位点判型

在资源家系F₂群体中,3个候选基因的11个多态位点的最小等位基因频率（MAF）均大于0.3。在其余4个群体中,只对C6orf106和HMGA1的6个多态位点进行了分型。在苏太和杜长大群体中,只有C6orf106前2个位点的MAF大于0.05;在二花脸群体中,只有HMGA1后2个位点的MAF大于0.05;在莱芜猪群体中,只有C6orf106第2个位点的MAF大于0.05。MAF大于0.05的位点用于后续的关联分析。

2.3 表型相关分析

在莱芜、二花脸和杜长大混合群体中,表型之间的简单相关系数见表2。肱二头肌长度和重量与前后蹄和前后肢肢蹄评分之间呈极显著正相关,而与关节评分之间呈显著负相关（除肱二头肌重量和前臂骨腕关节评分不显著之外）。肱二头肌长度与前肢步态评分呈显著负相关,与后肢步态评分不相关。肱二头肌重量与前肢步态评分不相关,与后肢步态评分呈显著正相关。前蹄评分除了与肱二头肌长度和重量以及后蹄评分呈正相关外,还与臂骨肩关节、前臂骨肘关节、前臂骨腕关节和股骨髋关节评分呈负相关,与其他性状不相关。后蹄评分除了与肱二头肌长度和重量以及前蹄评分呈正相关外,还与肩胛骨关节和臂骨肘关节评分呈显著的负相关,与肢蹄评分和步态评分呈显著正相关,与其他性状不相关。关节评分之间呈显著正相关（除肩胛骨关节与前臂骨肘关节评分以及前臂骨腕关节与肩胛骨关节、臂骨肘关节和小腿骨跗关节评分之间无相关外）,与肢蹄和步态评分之间无相关（除股骨膝关节评分与前肢肢蹄和步态评分呈正相关、前臂骨腕关节评分与后肢肢蹄和步态评分呈负相关以及臂骨肩关节评分和前肢步态评分呈正相关外）。肢蹄与步态之间呈极显著的正相关。后肢跗关节评分只在杜长大群体中进行了测量,它与前蹄评分（r = 0.0172,P = 0.6726）和后蹄评分（r = 0.0612,P = 0.1322）之间无相关。
Table 2
表2
表2性状之间的表型相关系数
Table 2The phenotypic correlation coefficients among the measured traits

	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
1 后蹄趾评分 Toe score of rear foot	0.49	-0.21	0.00	-0.08	-0.04	0.07	0.01	0.06	-0.04	0.20	0.27	0.14	0.07	0.13	0.01
2 前蹄趾评分 Toe score of front foot		-0.03	-0.10	-0.07	-0.21	-0.10	-0.10	0.00	0.00	0.19	0.30	0.09	0.08	0.00	-0.01
3 肩胛骨关节评分 Scapula joint score	643		0.18	0.21	-0.04	-0.07	0.11	0.11	0.26	-0.17	-0.24	-0.11	-0.05	-0.05	0.02
4 臂骨肩关节评分 Arm shoulder joint score	643	644		0.13	0.15	0.19	0.29	0.18	0.13	-0.12	-0.15	0.08	-0.07	0.14	-0.04
5 臂骨肘关节评分 Arm elbow joint score	643	644	644		0.17	0.05	0.08	0.09	0.11	-0.15	-0.10	0.10	0.07	0.05	0.07
6 前臂骨肘关节评分 Focile elbow joint score	643	644	644	644		0.32	0.18	0.15	0.09	-0.19	-0.23	0.10	-0.03	0.07	-0.09
7 前臂骨腕关节评分 Focile wrist joint score	643	644	644	644	644		0.11	0.21	-0.02	-0.12	-0.07	0.01	-0.14	-0.01	-0.19
8 股骨髋关节评分 Femora hip joint score	643	644	644	644	644	644		0.33	0.15	-0.11	-0.22	0.03	-0.03	0.03	-0.04
9 股骨膝关节评分 Femora knee joint score	643	644	644	644	644	644	644		0.16	-0.11	-0.14	0.23	-0.03	0.23	-0.08
10 小腿骨跗关节评分 Focile hock joint score	643	644	644	644	644	644	644	644		-0.17	-0.20	0.01	-0.08	0.07	-0.06
11 肱二头肌长度 Length of biceps brachii	636	637	637	637	637	637	637	637	637		0.62	0.28	0.29	-0.09	0.03
12 肱二头肌重量 Weight of biceps brachii	640	641	641	641	641	641	641	641	641	1463		0.29	0.39	-0.03	0.19
13 前肢肢蹄评分 Front leg score	248	248	248	248	248	248	248	248	248	1065	1067		0.54	0.33	0.19
14 后肢肢蹄评分 Rear leg score	248	248	248	248	248	248	248	248	248	1065	1067	1603		0.14	0.38
15 前肢步态评分 Gait score of front leg	248	248	248	248	248	248	248	248	248	1060	1062	1344	1344		0.39
16 后肢步态评分 Gait score of rear leg	248	248	248	248	248	248	248	248	248	1060	1062	1344	1344	1344

Numbers in the upper and lower triangle are phenotypic correlation coefficients between phenotypes (P<0.01 in bold font and P<0.05 in italic font) and observation numbers using to calculate the phenotypic correlation coefficients, respectively上三角为表型相关系数,加粗表示极显著（P<0.01）,倾斜表示显著（P<0.05）;下三角为计算表型相关系数使用的观测数

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2.4 性别差异检验

性别对表型的影响见表3。公猪的肩胛骨关节评分极显著低于母猪的肩胛骨关节评分,但是臂骨肩关节和后肢跗关节评分显著高于母猪的相应关节的评分,其余性状在性别之间没有显著差异。
Table 3
表3
表3不同性别对肢蹄结实度的影响
Table 3The effects of sexes on the measured traits

性状 Tratis	公猪 Male		母猪 Female		公猪 - 母猪 Male - Female
性状 Tratis	数量 N	均值±标准差 Mean±SE	数量 N	均值±标准差Mean±SE	均值±标准差 Mean±SE
肩胛骨关节评分 Scapula joint score	381	3.24 ± 0.064	263	3.52 ± 0.073	-0.28 ± 0.097^**
臂骨肩关节评分 Arm shoulder joint score	381	2.47 ± 0.043	263	2.34 ± 0.048	0.13 ± 0.065^*
臂骨肘关节评分 Arm elbow joint score	381	2.35 ± 0.047	263	2.44 ± 0.041	-0.10 ± 0.066
前臂骨肘关节评分 Focile elbow joint score	381	2.57 ± 0.033	263	2.53 ± 0.041	0.04 ± 0.053
前臂骨腕关节评分 Focile wrist joint score	381	3.01 ± 0.027	263	2.97 ± 0.032	0.04 ± 0.042
股骨髋关节评分 Femora hip joint score	381	3.05 ± 0.036	263	3.14 ± 0.044	-0.09 ± 0.057
股骨膝关节评分 Femora knee joint score	381	3.04 ± 0.030	263	3.10 ± 0.035	-0.07 ± 0.047
后肢跗关节评分 Joint score of Hind tarsal	304	3.00 ± 0.064	303	2.70 ± 0.059	0.30 ± 0.087^**
小腿骨跗关节评分 Focile hock joint score	381	1.63 ± 0.037	263	1.74 ± 0.044	-0.11 ± 0.058
肱二头肌长度 Length of biceps brachii	375	12.70 ± 0.043	264	12.70 ± 0.056	0.01 ± 0.07
肱二头肌重量 Weight of biceps brachii	379	42.80 ± 0.433	264	43.80 ± 0.473	-1.21 ± 0.651
前肢肢蹄评分 Front leg score	163	3.20 ± 0.041	87	3.32 ± 0.054	-0.11 ± 0.068
后肢肢蹄评分 Rear leg score	163	2.92 ± 0.043	87	2.97 ± 0.057	-0.05 ± 0.073
后蹄趾评分 Toe score of rear foot	685	3.09 ± 0.022	565	3.05 ± 0.023	0.04 ± 0.032
前蹄趾评分 Toe score of front foot	686	3.36 ± 0.021	565	3.38 ± 0.021	-0.02 ± 0.030
前肢步态评分 Gait score of front leg	163	3.37 ± 0.037	87	3.45 ± 0.044	-0.07 ± 0.059
后肢步态评分 Gait score of rear leg	163	3.07 ± 0.044	87	3.10 ± 0.048	-0.03 ± 0.069

^** and ^* indicates significance at P<0.01 and P<0.05, respectively^**表示差异极显著（P<0.01）,^*表示差异显著（P<0.05）,未标注表示差异不显著

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2.5 关联分析结果

在F₂资源群体中,11个多态位点与肢蹄结实度关联分析结果见表4。HMGA1基因的g.2029C>T和g.3155A>G位点与肱二头肌长度和重量、肢蹄评分和步态评分6个性状均显著关联,而g.1149C>T位点与肢蹄评分和前肢步态评分显著关联,与另外3个性状不关联。C6orf106基因的g.34542A>T位点与6个性状均显著关联,而另外2个位点与步态评分和前肢肢蹄评分显著关联,与另外3个性状不关联。ENSSSCG00000023160基因不与肱二头肌重量关联。在剩下的5个性状中,g.2430C>T和g.3231AA>--位点与它们显著关联,g.2284C>G和g.1129G>C位点分别与除前肢肢蹄评分和肱二头肌长度之外的4个性状显著关联,而另一个位点不与任何性状关联。在这11个多态位点中,HMGA1的g.3155A>G与前肢步态评分的关联程度最强。
Table 4
表4
表4F₂资源群体中11个多态位点与肢蹄结实度关联分析
Table 4The association analysis results between 11 loci and leg soundness in the F₂ population

多态位点 Locus	肱二头肌长度 Biceps brachii length	肱二头肌重量 Biceps brachii weight	后肢步态评分 Gait score of rear leg	后肢肢蹄评分 Rear leg score	前肢步态评分 Gait score of front leg	前肢肢蹄评分 Front leg score
HMGA1
g.1149C>T	0.1858	0.9946	0.1022	0.0160	0.0002	0.0193
g.2029C>T	6.5×10^-7	0.0123	1.4×10^-5	0.0088	3.1×10^-10	0.0434
g.3155A>G	7.3×10^-7	0.0180	1.6×10^-5	0.0078	1.5×10^-10	0.0387
C6orf106
g.2054T>C	0.1712	0.7156	0.0409	0.1130	0.0007	0.0121
g.6953T>C	0.2092	0.6994	0.0308	0.0722	0.0003	0.0086
g.34542A>T	6.5×10^-5	0.0084	0.0002	0.0396	5.9×10^-7	0.0090
ENSSSCG00000023160
g.1129G>C	0.1582	0.9843	0.0061	0.1042	0.0008	0.0123
g.2284C>G	0.0327	0.5206	0.0003	0.0164	1.6×10^-7	0.0751
g.2430C>T	0.0061	0.4782	0.0007	0.0499	1.8×10^-7	0.0371
g.2813G>A	0.8340	0.7966	0.2140	0.1737	0.2681	0.7365
g.3231AA>--	0.0065	0.2431	0.0002	0.0082	3.8×10^-7	0.0386

表中列的是P值 The numbers are P values of association analyses

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在其余4个群体中,HMGA1和C6orf106与肢蹄结实度关联分析结果见表5。在莱芜群体中,只有C6orf106的g.6953T>C位点的MAF大于0.05。该位点与臂骨肩关节、股骨膝关节、后肢步态和前臂骨肘关节评分显著关联,与其余性状之间不关联。在二花脸群体中,只有HMGA1的g.2029C>T和g.3155A>G位点的MAF大于0.05。前者与股骨髋关节评分极显著关联,后者与股骨髋关节和臂骨肘关节评分极显著关联,与其余性状不关联。在苏太和杜长大群体中,只有C6orf106的g.2054T>C和g.6953T>C位点的MAF大于0.05,但它们均与肢蹄结实度性状之间不关联。
Table 5
表5
表5HMGA1和C6orf106 的4个SNP与肢蹄结实度关联分析
Table 5The association analysis results between 4 SNPs of HMGA1 and C6orf106 and leg soundness

性状 Trait	莱芜 Laiwu	二花脸 Erhualian		苏太 Sutai		杜长大 DLY
	C6orf106	HMGA1		C6orf106		C6orf106
	g.6953T>C	g.2029C>T	g.3155A>G	g.2054T>C	g.6953T>C	g.2054T>C	g.6953T>C
臂骨肩关节评分 Arm shoulder joint score	0.0463	0.6876	0.7026	—	—	—	—
臂骨肘关节评分 Arm elbow joint score	0.4270	0.2808	0.0073	—	—	—	—
肱二头肌长度 Length of biceps brachii	0.1427	0.7964	0.8285	0.9528	0.3669	—	—
肱二头肌重量 Weight of biceps brachii	0.1740	0.2559	0.0928	0.4257	0.7628	—	—
股骨髋关节评分 Femora hip joint score	0.2594	0.0010	0.0040	—	—	—	—
股骨膝关节评分 Femora knee joint score	0.0348	0.9057	0.4597	—	—	—	—
后蹄趾评分 Toe score of rear leg	0.2917	0.3646	0.7757	—	—	0.8610	0.1271
后肢步态评分 Gait score of rear leg	0.0406	—	—	0.8825	0.8448	—	—
后肢跗关节评分 Joint score of Hind tarsal	—	—	—	—	—	0.3835	0.7579
后肢肢蹄评分 Rear leg score	0.2438	—	—	0.6778	0.5435	—	—
肩胛骨关节评分 Scapula joint score	0.9086	0.5262	0.6443	—	—	—	—
前臂骨腕关节评分 Focile wrist joint score	0.0802	0.9776	0.8466	—	—	—	—
前臂骨肘关节评分 Focile elbow joint score	0.0317	0.3132	0.5758	—	—	0.2559	0.1663
前蹄趾评分 Toe score of front leg	0.7365	0.5089	0.0639	—	—	—	—
前肢步态评分 Gait score of front leg	0.8928	—	—	0.4385	0.5013	—	—
前肢肢蹄评分 Front leg score	0.5090	—	—	0.4491	0.6682	—	—
小腿骨跗关节评分 Focile hock joint score	0.0940	0.8979	0.5776	—	—	—	—

表中列的是P值,—表示无表型数据 The numbers are P values of association analyses, and “-” means the phenotype unrecorded

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3 讨论

本研究一共使用了5个试验猪群。选择了F₂群体是因为7号染色体上的QTL是在F₂资源群体中鉴别到的。因此,只有在这群体中显著关联的位点,才有可能是因果突变位点。苏太猪与F₂资源群体有相似的来源,他们的祖代都是杜洛克和二花脸。但是苏太猪经历了18个世代的重组,连锁不平衡区域会显著的小于F₂群体,因此选择这个群体有利于区分因果位点和连锁不平衡位点。二花脸是F₂资源群体的祖代之一,使用这个品种有利于了解这个QTL的起源。莱芜猪是中国著名地方品种之一,对莱芜猪肢蹄结实度的研究,有利于该地方品种的开发和利用。杜长大是目前中国商品猪生产的主要杂交模式,在杜长大群体中开展肢蹄结实度的研究,可以为商品猪肢蹄结实度的分子育种奠定基础。
群体对肢蹄结实度的影响是极显著的（数据没有展示）。杜长大群体的蹄趾评分显著高于两个地方品种,二花脸的前蹄趾评分比莱芜猪的要高,但是后蹄趾评分比莱芜猪要低。苏太猪的前后肢的肢蹄评分和步态评分均极显著高于莱芜猪。总体来说二花脸的关节评分比莱芜猪要高,如肩胛骨关节评分、臂骨肘关节评分、股骨膝关节评分和小腿骨跗关节评分,但莱芜猪的前臂骨腕关节评分比二花脸的高。
DRAPER等报道在肢蹄软弱品系中,肱二头肌的长度和重量显著大于肢蹄正常和结实的品系^[27]。在F₂群体中,前肢步态评分与肱二头肌的长度和重量呈显著的负相关,而肢蹄评分与它们呈显著正相关^[9]。在苏太群体中,肱二头肌的长度和重量与步态和肢蹄评分不相关^[10]。在莱芜、二花脸和杜长大混合群体中,前肢步态评分与肱二头肌长度呈显著的负相关,这重复了前人的结果。外观的蹄趾、肢蹄和步态评分与关节评分之间不相关,因此,它们不能替代关节评分。
在F₂群体和苏太群体中,母猪的肢蹄结实度高于公猪^[10]。在莱芜、二花脸和杜长大混合群体中,公猪的肢蹄和步态评分以及肱二头肌长度显著小于母猪的,但是都没有达到显著水平,这和前人的结果相似^[10]。
在F₂群体中,ENSSSCG00000023160 的g.2284C>G、g.2430C>T和g.3231AA>--与前肢步态评分相关联,但关联显著水平不如HMGA1的两个位点（表4）。其余位点在不同群体中与肢蹄软弱的表型性状关联性不强,未达到统计学显著水平。虽然基因填补存在一定的错误,导致检测效率的下降,但是模拟结果显示错误在3%以下（与前人的结果类似^[22]）,对关联分析的结果影响不会很大。基于上述结果,可以排除该基因为肢蹄结实度的因果基因。因此,在其余的4个群体中,没有必要对该基因进行相关的研究。
HMGA1能提高软骨细胞增殖活性^[12],并通过调控透明软骨细胞增殖和分化来影响软骨组织的修复^[28]。在关节炎患者体内,HMGA1和IGFBP-3蛋白表达量均上调^[29]。在F₂和二花脸群体中,该基因均与肢蹄结实度相关性状显著关联,在其他3个群体中,该的3个体位点的MAF小于0.05,没有足够的检测效率,因此没有进行关联分析。因此,它仍有可能是肢蹄结实度因果基因。
在F₂群体和莱芜群体中,C6orf106与肢体结实度性状显著地关联。在二花脸群体中,3个SNP的MAF均小于0.05。在苏太和杜长大群体中,g.34542A>T位点的MAF小于0.05,另外2个SNP的MAF虽然大于0.05,但是它们与已测的肢蹄结实度不关联。考虑到这个基因还有100多个多态位点没有检测,因此,不能排除其为因果基因的可能性。

4 结论

本研究建立了一种通过内在的关节评分来评估肢蹄结实度的方法。相关分析结果表明外观的蹄趾、肢蹄和步态评分与关节评分之间无显著相关性,因此,关节评分是对现有肢蹄结实度度量方法的重要补充。性别对肢蹄结实度有显著的影响,在进行肢蹄结实度的遗传解析中,需要考虑性别效应。关联分析结果排除了ENSSSCG00000023160是肢蹄结实度因果基因的可能性,但是HMGA1和C6orf106的可能性没有排除,有必要对这两个基因进行更深入的研究。
责任编辑林鉴非）
The authors have declared that no competing interests exist.