0 引言
【研究意义】蜜蜂转地饲养是一种流动型的养蜂方式。中国地域辽阔,蜜粉源植物丰富,不同季节花期交错,养蜂人员为了充分利用各地蜜粉源植物繁殖蜂群,扩大养蜂生产,增加蜂产品产量,每年都会进行转地放蜂饲养[1]。中国是世界上最大的养蜂国之一,200万群东方蜜蜂饲养量和600万群的西方蜜蜂饲养量均居世界首位,为农业生产创造了巨大的经济价值[2]。转地养蜂是中国主要的养蜂方式之一,但有研究表明,转地养蜂会影响蜜蜂的健康[3],其中蜜蜂病毒和寄生虫在转地过程中的广泛传播是主要影响因素之一[3-4]。另一方面,蜜蜂肠道内有着数量众多的共生菌群,它们在营养吸收、抵抗病原物侵染、增强机体免疫力等方面均发挥着积极作用[5-7]。因此,探究转地养蜂过程中蜜蜂病原微生物与肠道共生菌群的变化,对于蜜蜂疾病的防控以及养蜂业的发展具有重要意义。【前人研究进展】蜜蜂病毒传播广泛,可以感染不同生长阶段和不同级型的蜜蜂,且在蜂箱、蜂粮及蜜蜂寄生虫体内都可检测到[8-11]。但大多数病毒在蜜蜂表现症状之前都存在着隐形感染现象[12-13],当受到特定的外界压力如寄生虫感染、周围环境变化时,蜜蜂病毒被激活并快速增殖,表现出强致病性并导致宿主的快速死亡[14]。另一方面,9大类蜜蜂肠道微生物却与蜂群的健康密切相关[15],有研究表明它们和宿主相互协作从而增加整个机体的适应性[16],其中β-变形菌纲的Snodgrassella alvi和γ-变形菌纲的Gilliamella apicola是蜜蜂肠道中的优势菌,占成年工蜂回肠和中肠中菌群总数的50%以上,Gilliamella为中肠内的优势菌群,Snodgrassella为回肠中的优势菌群[17]。此外有关中国不同地区蜜蜂病原物及共生菌的研究也有着许多报道,LI等[18]对中国19个省（市、地区）的中华蜜蜂（Apis cerana cerana）病原物感染和共生菌的数量变化情况进行了详细报道;AI等[19]对中国18个省（市、地区）的意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）蜂场常见7种蜜蜂病毒感染情况进行调查;YANG等[20]对中国7个省（市、地区）的意大利蜜蜂蜂场常见10 种病原体的感染率进行了系统研究;贾慧茹等[21]对北京地区6种蜜蜂病毒的感染情况进行普查等,但目前仍缺乏转地蜜蜂饲养流行病学和共生菌方面的研究。【本研究切入点】近年来关于蜜蜂流行病学的研究大多是从各个省区采集大量蜜蜂样品进行检测。而对于转地放蜂的过程中,同一蜂场内在不同季节及不同蜜源条件下,蜜蜂病原微生物流行规律和共生菌变化情况尚缺乏研究。【拟解决的关键问题】探明转地放蜂过程中常见蜜蜂病毒和寄生虫的流行规律,及不同地区工蜂肠道中两种主要共生菌G. apicola和S. alvi的变化情况及与病原物的相关性,进一步探讨转地饲养方式对蜜蜂健康的影响,为蜜蜂疾病的防治措施提供理论依据。1 材料与方法
1.1 供试材料
于2015年4—12月的转地放蜂期间,对同一蜂场的指定蜂群进行取样。试验共选择7个采集地区,采集的蜜源植物和地点分别为油菜（湖北省浠水县）、洋槐（河北省灵寿县）、椴树（吉林省延边县）、荞麦（内蒙古赤峰市）、芝麻（河南省新蔡县）、盐肤木（湖北省英山县）和茶树（湖北省浠水县）,每个地区均在固定的6群蜂中取样,每群取5只工蜂检测病毒和微孢子虫。共采集工蜂样本210只,且均为活蜂,采样后装入含有糖粉的小盒中运输至实验室,工蜂样品取肠道提取DNA,检测3种微孢子虫和2种肠道内共生菌,剩下的部分提取RNA,检测7种常见蜜蜂病毒。1.2 DNA的提取及PCR检测
剪取每只蜂的腹部并拉取肠道,分别放入不同离心管中,加入100 μL Krebs Ringer solution,使用无菌的研磨棒将腹部研磨成匀浆。每个样品取50 μL匀浆,按照DNA提取试盒的操作方法（Wizard ® SV 96 Genomic DNA Purification System,Promega）提取DNA。提取后将DNA用于检测东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、西方蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）和熊蜂微孢子虫（Nosema bombi）,引物如表1所示。PCR反应体系：500 ng模板DNA,12.5 μL Mix,10 mmol·L-1正反向引物各1 μL,ddH2O补至25 μL。PCR反应条件：94℃ 4 min,然后94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,共40个循环,最后72℃ 10 min。每次PCR均做阴性（ddH2O）和阳性对照。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳,染色后观测结果。部分目的条带使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（TaKaRa,Japan）回收PCR产物,送至公司测序以验证试验结果。1.3 RNA的提取及RT-PCR检测
采用Trizol法提取拉取肠道后剩余部分蜜蜂样本的总RNA,并对采集的所有样品进行蜜蜂病毒RT-PCR检测。选择7种常见病毒蜜蜂急性麻痹病毒（ABPV）、黑蜂王台病毒（BQCV）、蜜蜂慢性麻痹病毒（CBPV）、蜜蜂残翅病毒（DWV）、克什米尔蜜蜂病毒（KBV）、蜜蜂以色列急性麻痹病毒（IAPV）和囊状幼虫病病毒 （SBV）。将提取好的RNA取1 μg,利用反转录试剂盒（TaKaRa,Japan）合成cDNA。将合成的cDNA进行PCR扩增反应,病毒引物参考文献（表1）。PCR反应体系：Mix 12.5 μL,正向和反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O补至25 μL。PCR条件：反转录48℃ 45 min,95℃ 2 min,然后95℃ 30 s,55℃ 1 min,68℃ 2 min,共40个循环,68℃ 7 min。每次RT-PCR均做阴性（ddH2O）和阳性对照。PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳,染色后在紫外灯下观测结果。使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（TaKaRa,Japan）回收PCR产物,送至公司测序。Table 1
表1
表1本试验采用的PCR引物
Table 1PCR primers used in this study
| 名称 Name | 引物 Primer | 序列 Sequence (5′-3′) | 产物长度 Size (bp) | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|---|
| 蜜蜂急性麻痹病毒 Acute bee paralysis virus | ABPV-F | TTATGTGTCCAGAGACTGTATCCA | 900 | [22] |
| ABPV-R | GCTCCTATTGCTCGGTTTTTCGGT | |||
| 黑蜂王台病毒 Black queen cell virus | BQCV-F | TGGTCAGCTCCCACTACCTTAAAC | 700 | [22] |
| BQCV-R | GCAACAAGAAGAAACGTAAACCAC | |||
| 蜜蜂慢性麻痹病毒 Chronic bee paralysis virus | CBPV-F | AGTTGTCATGGTTAACAGGATACGAG | 455 | [23] |
| CBPV-R | TCTAATCTTAGCACGAAAGCCGAG | |||
| 蜜蜂残翅病毒 Deformed wing virus | DWV-F | ATCAGCGCTTAGTGGAGGAA | 702 | [24] |
| DWV-R | TCGACAATTTTCGGACATCA | |||
| 蜜蜂以色列急性麻痹病毒 Israeli acute paralysis virus | IAPV-F | GCGGAGAATATAAGGCTCAG | 586 | [25] |
| IAPV-R | CTTGCAAGATAAGAAAGGGGG | |||
| 克什米尔蜜蜂病毒 Kashmir bee virus | KBV-F | GACGCTTCGTTCATGCAACA | 703 | [26] |
| KBV-R | GTGAAAAGAATTCACTTGGTG | |||
| 囊状幼虫病病毒 Sacbrood virus | SBV-F | GCTGAGGTAGGATCTTTGCGT | 824 | [27] |
| SBV-R | TCATCATCTTCACCATCCGA | |||
| 西方蜜蜂微孢子虫 Nosema apis | N. apis-F | CCATTGCCGGATAAGAGAGT | 269 | [28] |
| N. apis-R | CCACCAAAAACTCCCAAGAG | |||
| 东方蜜蜂微孢子虫 Nosema ceranae | N. ceranae-F | GACAACAAGGAAGACCTGGAAGTG | 780 | [29] |
| N. ceranae-R | TGTGAATAAGAGGGTGATCCTGTTGAG | |||
| 熊蜂微孢子虫 Nosema bombi | N. bombi-F | CACCAGGTTGATTCTGCCT | 545 | [30] |
| N. bombi-R | TGTTCGTCCAGTCAGGGTCGTCA | |||
| 蜜蜂肌动蛋白（内参基因） Apis-β-actin (Reference gene) | Actin-F | AGGAATGGAAGCTTGCGGTA | 181 | [31] |
| Actin-R | AATTTTCATGGTGGATGGTGC | |||
| γ-变形菌纲 Gilliamella apicola | Gill-F | CCTTTGTTGCCATCGATTAGG | 249 | [32] |
| Gill-R | GACATTCTGATTCACGATTACTAGC | |||
| β-变形菌纲 Snodgrassella alvi | Snod-F | GGAATTTCTTAGAGATAGGAAAGTG | 136 | [32] |
| Snod-R | TTAATGATGGCAACTAATGACAA |
新窗口打开
1.4 肠道细菌的荧光定量PCR检测
将上述提取的DNA样品进行分组,每个地区的样品分为一组,每组取5只工蜂作为生物学重复进行检测。使用SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR,对不同地区工蜂样本中的共生菌G. apicola和S. alvi的表达量进行测定。qPCR扩增使用Mx3005P real-time PCR系统（Stratagene,La Jolla,CA）。为确保扩增效率,使用蜜蜂β-actin为内参基因。 β-actin、G. apicola和S. alvi的引物如表1所示。 qPCR反应条件：95℃ 3 min,然后95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,40个循环,随后进行熔解曲线分析：55—95℃,0.5℃/read 1 s hold。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳。对阳性结果进行目的片段的回收并测序,测得的序列在NCBI上进行对比。不同表达水平的细菌基因和β-actin使用循环数的阈值（Ct值）来衡量。每个样品作3个复孔以减少试验误差。目的基因表达水平用ΔΔCt法计算：目的基因的相对表达量=2-ΔΔCt,ΔΔCt= (Ct/target gene-Ct/actin) test group-(Ct/target gene-Ct/ actin)control,以表达量最低的样品作为参照进行计算,柱状图结果均用“平均值±标准误”表示。1.5 统计分析
使用SPSS 17.0软件进行数据分析。首先对检测出病毒和寄生虫的样品,根据感染病原种类进行统计,算出每个地区每种蜜蜂病毒和寄生虫的感染率;再通过卡方检验,比较每种病原物在不同地区间、不同季节间感染率的差异;采用Kendall Rank相关系数,分析每个地区样本中IAPV、BQCV和DWV的感染率与肠道共生菌数量的相关性;采用ANOVA方差分析的方法对不同地区之间工蜂肠道菌表达量进行统计分析。2 结果
2.1 转地蜂群病毒感染情况
从转地放蜂经过的7个地区共采集210只蜜蜂工蜂,检测7种常见蜜蜂病毒,结果如表2所示。在工蜂样本中仅检测出IAPV、BQCV和DWV。IAPV在所有地区都有检出,其中河南省新蔡县感染率最高,达97%;在吉林省延边州感染率最低,为60%;不同地区之间IAPV的感染率差异显著（χ2=14.5,P=0.02）。BQCV在所有地区也均有检出,其中吉林省延边州感染率最高,达到77%;河北省灵寿县感染率最低,为10%;不同地区间BQCV的感染率差异极显著（χ2=43.1, P=0.0001）。DWV的感染率相对较低,在7个地区中有5个地区检出,在吉林省延边州和内蒙古区赤峰市的感染率最高,为30%,不同地区间DWV的感染率差异极显著（χ2=24.541,P=0.001）。2.2 转地蜂群寄生虫感染情况
西方蜜蜂微孢子虫在各样本中均未检出;东方蜜蜂微孢子虫在4个地区存在感染情况,感染率为23%—57%,湖北省浠水县感染率最高,吉林省延边州感染率最低,不同地区间感染率差异极显著（χ2=54.115,P=0.0001）;熊蜂微孢子虫在各个地区均有检出,其中湖北省浠水县感染率最高,为70%;吉林和内蒙感染率最低,为27%。卡方检验分析表明不同地区间熊蜂微孢子虫感染率差异显著（χ2=16.44,P=0.012）（表2）。Table 2
表2
表2意大利蜜蜂蜂群样本的采集情况及病原微生物的感染率
Table 2Synopsis of collection details and prevalence of parasites and virus in A. m. ligustica colonies (Chi-square test)
新窗口打开
2.3 转地蜂群病原微生物季节性变化
将取样时间按季节进行分类,4—5月为春季,7—8月为夏季,9—10月为秋季,12月为冬季。对每个季节取的样品中病原物的感染率进行卡方检验,结果表明蜜蜂病毒IAPV在不同季节的感染率差异不显著（χ2=2.236,P=0.525）,而BQCV、DWV在不同季节间的感染率差异极显著（χB2=20.681,PB=0.0001;χD2=21.176,PD=0.0001）。在寄生虫方面,熊蜂微孢子虫和东方蜜蜂微孢子虫在不同季节的感染率差异极显著（χNB2=12.597,PNB=0.006;χNC2=62.286,PNC=0.0001）。2.4 转地蜂群肠道内共生菌的检测与相关性分析
对不同地区蜂群的肠道菌G. apicola和S. alvi进行检测和表达量测定,结果如图1所示。在7个地区工蜂肠道中均含有共生菌G. apicola和S. alvi。方差分析结果表明,G. apicola的含量在湖北省英山县最多,在内蒙古区赤峰市最少,不同地区间数量差异极显著（P=0.0001）。S. alvi的含量在湖北省英山县最多,在河南省新蔡县最少,且不同地区间数量差异也为极显著（P=0.004）。从两种共生菌的含量来看,湖北省英山县两种共生菌的含量均最多,而河南省新蔡县与内蒙古区赤峰市两种共生菌的含量均较少,统计学分析表明工蜂体内两种共生菌的总数在不同地区间存在极显著差异（P=0.0001）。此外,对不同地区样本的病原物感染率和共生菌含量进行相关性分析,结果显示共生菌S. alvi的含量和IAPV的感染率呈极显著负相关关系（Kendall’s tau rank：r=0.878,P=0.006）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1不同放蜂地区工蜂体内G. apicola与S. alvi的表达量
-->Fig. 1Relative abundance of G. apicola and S. alvi in honeybee workers of different beekeeping regions
-->
3 讨论
本试验研究了在转地放蜂过程中不同地域和不同蜜源植物条件下,同一意蜂蜂场主要病原物的感染率和部分肠道共生菌的变化情况,结果表明不同病毒和寄生虫的感染率在不同地区差异显著,这可能是季节、蜜源植物、温湿度和地理位置综合作用的结果。在7种常见蜜蜂病毒中,仅检测出IAPV、BQCV和DWV这3种病毒,其中IAPV的检出率较高,为60%—97%,COX-FOSTER等[33]研究表明,IAPV与蜜蜂崩溃综合症（CCD）之间有着强烈的相关性,所以推测CCD的主要病原可能为IAPV,李志国[34]研究显示蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是IAPV的载体,而本研究蜂群中IAPV的感染率较高,进一步说明了IAPV是危害蜜蜂的主要病毒之一。此外BQCV的检出率也较高,该病毒通常在蜂群中不表现出症状,以一种隐形感染的方式长期存在于蜜蜂体内,RIBIÈRE等[35]研究表明BQCV与微孢子虫共感染表现出强烈的致病性,本研究中同样检出了微孢子虫的存在,因此控制蜂群蜜蜂微孢子虫是减少BQCV感染的主要方式[36]。SHEN等[37]研究表明大蜂螨（Varroa destructor）是DWV传播的载体,在本研究中DWV的感染率较低,这可能是由于转地养蜂是在大流蜜期,而这个时期也是大蜂螨低流行期[18];DWV夏季的感染率高于春秋季,可能是因为夏季温度较高,湿度较大的环境更有利于DWV的传播。另外本研究中的转地蜜蜂从河北省浠水县出发,经过5个地区后又回到浠水县,而结果表明在此地区的两个不同时间段内,3种病毒的感染率均较高,这说明地理位置和季节均对病毒感染率有着较大的影响。蜜蜂微孢子虫病是危害西方蜜蜂的主要病原物[38],其中东方蜜蜂微孢子虫被认为是对蜜蜂危害最为严重的一种病原[39]。本试验在意蜂样品中检出大量东方蜜蜂微孢子虫,却没有检测到西方蜜蜂微孢子虫,这与LI等[18]的研究结果一致,前期研究表明东方蜜蜂微孢子虫最初感染东方蜜蜂,目前已取代西方蜜蜂微孢子虫,在全世界传播[39],本研究也进一步证实了这一结论。东方蜜蜂微孢子虫在春季的感染率显著高于秋冬季,在本研究的秋冬季样本中,没有检测到东方蜜蜂微孢子虫的存在,这一结果为东方蜜蜂微孢子虫不耐低温,其传播能力和毒力在寒冷环境下较低的结论提供了更有力的证据[18]。此外,本研究也在意蜂肠道内检测到了熊蜂微孢子虫,MCIVOR等[40]也有过类似报道,这一现象更进一步说明熊蜂微孢子虫可进行跨种侵染。
G. apicola和S. alvi是蜜蜂体内普遍存在的优势共生菌,从本研究中两种共生菌的总数来看,在湖北省英山县两种共生菌的数量均最多,且与其他地区差异显著,这可能是因为在湖北地区的蜜源植物盐肤木与其他地区相比,蜜、粉更为丰富,为蜂群提供了充足的营养条件。此外,本研究还发现共生菌S. alvi的含量与IAPV的感染率呈显著负相关,LI等[18]发现感染东方蜜蜂微孢子虫的中华蜜蜂体内共生菌数量较正常蜂显著减少,这表明蜜蜂肠道菌群的组成可能影响其对病原物的敏感性,共生菌屏蔽病原的作用可能是蜜蜂对抗疾病的一种重要途径[41]。KOCH等[42]的研究结果也表明这两种菌具有抵抗短膜虫的作用,但这两种菌是否具有抵抗病毒的作用还有待进一步研究。
中国是世界第一养蜂大国,转地放蜂是一种特色的蜜蜂饲养形式,可在最大程度上充分利用蜜源植物,产生更高的收益[43]。而转地放蜂主要采用卡车运输,蜂群在运输过程中处于受热、缺水和振动的环境,且蜂群摆放相对集中,密度较大,破坏了蜜蜂的正常生活状态,因此转地放蜂很可能是蜜蜂疾病发生和传播的因素之一。蜜蜂疾病的流行与暴发会给养蜂业造成巨大的经济损失,因此对转地蜂群蜜蜂疾病进行调查是非常有必要的。本研究通过对同一蜂场不同时期的病原微生物流行情况的调查,进一步明确了不同时期的病毒感染情况,以及共生菌和病原物之间的相关性。此外,多种因素如气候、季节、地域和蜜源植物的不同,都可以对蜂群健康产生影响。但对于蜜蜂肠道共生菌的功能和有害病原物的致病机制,以及蜜蜂是否可以通过调控肠道菌群来控制病原物感染等问题仍需要进行更深入的研究。
4 结论
转地饲养的意蜂蜂场中,IAPV、BQCV、DWV和东方蜜蜂微孢子虫、熊蜂微孢子虫均普遍存在感染现象,蜜蜂病原物的感染率和肠道共生菌的含量在不同放蜂区域之间差异显著,且部分蜜蜂病原物与蜜蜂肠道共生菌间呈显著负相关关系。转地放蜂饲养行为对蜜蜂的健康状况有一定影响。The authors have declared that no competing interests exist.
