东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应

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本站小编 Free考研考试/2021-12-26

丁建莉, 姜昕, 关大伟, 马鸣超, 赵百锁, 周宝库, 曹凤明, 李力, 李俊. 东北黑土微生物群落对长期施肥及作物的响应[J]. , 2016, 49(22): 4408-4418 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.22.013
DING Jian-li, JIANG Xin, GUAN Da-wei, MA Ming-chao, ZHAO Bai-suo, ZHOU Bao-ku, CAO Feng-ming, LI Li, LI Jun. Responses of Micropopulation in Black Soil of Northeast China to Long-Term Fertilization and Crops[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2016, 49(22): 4408-4418 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.22.013

0 引言

【研究意义】中国东北黑土带是世界著名的三大黑土带之一,土壤有机质含量高、养分丰富,是重要的商品粮基地,对国家粮食供应和安全起着举足轻重的作用,但长期过量不合理的施肥和耕作,导致了黑土农田质量日益退化^[1]。土壤微生物作为农田生态系统的重要组成部分,能够对长期肥料累积作用产生敏感而快速的响应,是评价土壤质量、土壤肥力和作物生产力的重要指标^[2]。因此,开展对黑土中微生物群落结构和丰度的研究,能为进一步揭示土壤微生物与生态环境间的响应机制,以及改进施肥和耕作制度提供依据。【前人研究进展】研究发现,施肥会改变土壤微生物学特性,长期施用化肥能显著提高土壤微生物生物量,并引起群落结构变化^[3],长期施氮肥显著影响固氮菌、氨氧化菌等氮循环菌群^[4],磷肥的长期施用能控制一些特异性细菌及真菌的密度,但对褐灰钙土土壤微生物群落总体的丰富度没有明显影响^[5]。施用不同有机肥和氮肥均会引起土壤微生物组成的差异^[6],有机肥能够显著改变微生物群落结构及多样性^[7],提高微生物生物量和代谢活性^[8]、以及土壤酶活性^[9]。粪肥的长期施用会使作物根系分泌物和土壤中可溶性有机碳含量增加,提高土壤中微生物群落多样性^[10],显著降低土壤真菌与细菌的比率,改变细菌和真菌群落结构^[11],长期施用绿肥促进了某些细菌的生长,从而降低了作物枯萎病的发病率^[12]。土壤微生物不仅受施肥方式的影响,也受作物类型的影响^[13],蔡艳等^[14]报道不施肥条件下粮豆轮作有利于提高细菌多样性。此外,目前的高通量测序技术可对环境中所有微生物群落进行研究,获得数据量大,并更真实地揭示微生物群落的复杂性和多样性,极大促进了环境中不可培养微生物以及痕量菌的更深入研究^[15-16]。Illumina Miseq高通量测序可实现多样品的可变区同时测序,前人应用此方法发现东北黑土长期施用氮肥导致土壤微生物多样性降低,群落结构改变^[17];秦杰等^[18]通过此技术初步分析了东北黑土长期施用不同无机肥条件下,土壤微生物群落结构特征和组成差异变化,并取得一定进展。【本研究切入点】由于多年连续施用大量无机肥,尤其是氮肥,造成东北黑土土壤pH持续下降,土壤有机质含量下降,土壤中微生物已由“细菌型”向“真菌型”转变^[19]。已有的报道显示有机肥能够改善土壤质量、改变土壤微生物组成^[20-21],但其如何影响土壤质量及响应机制并不清楚。同时除常规施肥等农业措施外,不同作物及种植制度也会对土壤微生物群落结构产生影响,但目前这方面报道较少。【拟解决的关键问题】本研究以黑龙江省农业科学院35年定位试验站的连续两种作物种植季的4个不同施肥处理耕层土壤为研究对象,以16S rRNA基因为分子标靶,借助Illumina MiSeq高通量测序平台和定量PCR技术,探讨长期施肥和作物对东北黑土微生物群落结构和丰度的影响,为农田优化施肥和耕作制度,提高土壤可持续生产力提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在黑龙江省农业科学院长期定位试验站进行,该试验站位于黑龙江省哈尔滨市（45°40’ N,126°35’ E）,属于松花江二级阶地,地势平坦,海拔151 m,年均气温3.5℃,无霜期135 d,年降水量533 mm。自1980年起,试验按小麦-大豆-玉米顺序轮作,到2014年和2015年分别为大豆茬（第35个生长季,简称大豆季）和玉米茬（第36个生长季,简称玉米季）。本试验设计4个处理：不施肥处理（CK）;有机肥处理（M）;施氮肥、磷肥和钾肥的无机肥处理（NPK）;有机肥配施无机肥处理（MNPK）,3次重复。处理名称前加字母m表示玉米季的样品,如,mCK表示玉米季的不施肥处理;加字母s表示大豆季的样品,如sCK表示大豆季的不施肥处理。氮、磷、钾肥分别为尿素、重过磷酸钙、硫酸钾。氮磷钾肥大豆期施用量为75 kg N?hm^-2,150 kg P₂O₅?hm^-2,75 kg K₂O?hm^-2;小麦期和玉米期施用量为150 kg N?hm^-2,75 kg P₂O₅?hm^-2,75 kg K₂O ?hm^-2。有机肥为马粪,施用量为18 600 kg?hm^-2。

1.2 样品采集

分别于2014年9月和2015年9月,取作物收获季5—25 cm的耕层土壤,每个重复小区随机取10个点,剔除杂质后混匀作为该处理一个重复的土壤样品。土壤保存于封口塑料袋中,一部分温室风干研磨并过0.2 mm筛,用于测定土壤理化性质;另一部分样品保存于-80℃冰箱,待微生物群落分析。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤化学性质测定铵态氮测定采用KCl浸提-靛酚蓝比色法^[22]。参照鲁如坤^[23]方法测定以下土壤化学性质。其中,土壤pH测定采用酸度计法（土﹕水=1﹕1）;土壤有机质测定采用浓硫酸-重铬酸钾消煮-硫酸亚铁滴定法;土壤全氮的测定采用半微量凯氏定氮法;土壤有效磷的测定采用NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法;土壤速效钾的测定采用乙酸铵浸提-原子吸收火焰光度法。
1.3.2 土壤DNA的提取和16S rRNA基因的高通量测序土壤总DNA使用美国MOBIO公司的Power Max Soil DNA Isolation Kit试剂盒,每个样品称取0.25 g土壤,依照试剂盒说明提取土壤总DNA。所提取的土壤总DNA 的浓度和纯度用核酸定量仪（NanoDrop ND-1000）检测。DNA送至北京奥维森基因科技有限公司,应用Illumina MiSeq 平台对细菌和古菌16S rRNA基因的V4（515F-806R）进行测序^[24]。测序原始序列上传至NCBI的SRA数据库（SRP062512）。
1.3.3 16S rRNA基因丰度测定采用SYBR Green定量PCR法测定16S rRNA基因,反应在ABI 7500 Real-time PCR（ABI，USA）仪器上进行。反应体系为FastFire qPCR PreMix （TIANGEN，China）10 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,1μL DNA 模板,10 n mol?L^-1引物（515F-806R）,补加ddH2O至20 μL。以含有16S rRNA基因的重组 pGEMR-T 载体为标准质粒,参照文献[25]制备质粒和进行后续工作。

1.4 数据分析处理

通过Illumina MiSeq平台进行Paired-end测序,下机数据经过QIIME（v1.8.0）软件过滤、拼接、去除嵌合体^[17],再聚类为用于物种分类的OUT（Operational Taxonomic Units）,OTU相似性设置为97%。对比Greengenes数据库,得到每个OTU 对应的物种分类信息。利用Mothur软件（version 1.31.2）进行α多样分析（包括Shannon、ACE和Chao1等3个指数）。基于Weighted Unifrace距离^[26],使用R（v3.1.1）软件包的pheatmap进行聚类分析^[27]。采用SPSS 19.1软件,单因素ANOVA分析和Pearson相关性分析,用Turkey 显著差异法分析处理间的差异显著性;同时应用两因素方差分析（Two-way ANOVA）说明作物效应和施肥效应的显著性。

2 结果

2.1 不同作物和施肥处理对土壤化学性质的影响

两种作物季的不同施肥处理对土壤化学性质影响见表1,施肥和作物对土壤化学性质影响见表2。单因素分析结果表明,与不施肥相比,单施无机肥降低了土壤pH,施有机肥提高了pH,大豆季的sNPK处理的土壤pH比sCK降低0.95,有机肥配施无机肥处理（sMNPK）的pH要高出单施无机肥处理（sNPK）0.4。有机肥配施无机肥和单施无机肥处理极显著增加土壤中全氮、硝态氮、有效磷和有机质等的含量（P<0.05）,其中玉米季的mMNPK处理的有效磷含量较mCK处理提高60.81 mg·kg^-1,mNPK处理也较mCK处理提高57.81mg·kg^-1。总体上,施肥对不同处理的铵态氮含量影响不显著,但两个作物季间的铵态氮含量差异显著;玉米季的铵态氮含量明显低于大豆季的,sNPK处理的铵态氮含量为35.80 mg·kg^-1,而mNPK的仅为11.26 mg·kg^-1,说明作物季的变化是引起土壤化学性质变化的重要因素之一。同时,通过施肥和作物对土壤化学性质影响的方差分析,可知施肥和作物均显著影响土壤化学性质。
Table 1
表1
表1两种作物季不同施肥处理土壤化学性质
Table 1Variations of soil chemical properties under different fertilizer treatments of two crop growing seasons

作物 Crop	处理 Treatment	pH	有机质 Organic matter (g·kg^-1)	全氮 Total N (g·kg^-1)	硝态氮 NO₃^- (mg·kg^-1)	铵态氮 NH₄⁺ (mg·kg^-1)	有效磷 Available P (mg·kg^-1)	速效钾 Available K (mg·kg^-1)
玉米 maize	mCK	6.42±0.2cd	24.15±0.93a	1.34±0.01bc	2.381±0a	9.76±0.25a	8.92±0.30a	140.63±2.29ab
	mM	6.52±0.09cd	26.96±1.04bc	1.35±0.02bc	2.49±0.13ab	8.48±0.12a	10.38±1.06a	114.75±12.18a
	mMNPK	6.29±0.05c	26.03±0.31abc	1.41±0.08c	6.76±0.64d	10.18±0.06a	69.06±2.25b	134.11±19.24ab
	mNPK	5.89±0.03b	25.01±1.62ab	1.48±0.06c	3.27±0.71abc	11.26±0.35a	66.73±13.1b	142.11±5.85ab
大豆 Soybean	sCK	6.48±0.06cd	24.46±0.25a	1.18±0.02a	2.36±1.02a	34.85±0.57b	2.89±0.90a	157.17±29.27bc
	sM	6.59±0.05d	27.67±0.12c	1.23±0.06ab	4.44±0.62bc	37.47±6.41b	13.85±0.98a	190.20±1.48c
	sMNPK	5.88±0.16b	25.65±0.31abc	1.33±0.05bc	6.84±0.63c	41.27±4.82b	103.1±20.48c	171.78±9.3bc
	sNPK	5.53±0.03a	24.92±0.32ab	1.42±0.08c	4.72±1.12d	35.80±7.46b	94.59±7.01c	166.88±15.02bc

Data are?x ± s; Values followed by different letters in a row are significant among treatments at the 0.05 level. The same as below表中数据为平均值±标准差;同列数值后不同字母表示处理间差异达显著水平(P<0.05)。下同

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Table 2
表2
表2施肥和作物对土壤化学性质与微生物多样性指数影响的方差分析
Table 2Two-way ANOVA results for soil chemical properties and α diversity index

		施肥效应 Fertilizer		作物效应 Crop		交互作用 Interaction
		F	P	F	P	F	P
土壤化学性质 Soil chemical property	pH	85.658	<0.001	14.621	0.001	9.743	0.001
	有机质 Organic matter	16.355	<0.001	0.178	0.678	0.554	0.653
	全氮 Total N	15.406	<0.001	24.462	<0.001	1.091	0.381
	硝态氮 NO₃^-	26.225	<0.001	0.0	1.0	0.0	1.0
	铵态氮 NH₄⁺	0.876	0.474	299.482	<0.001	0.984	0.425
	有效磷 Available P	137.29	<0.001	16.300	0.001	6.802	0.004
	速效钾 Available K	0.155	0.925	41.386	<0.001	4.711	0.015
α多样性指数 α diversity index	Shannon	0.518	0.676	41.332	<0.001	2.680	0.082
	ACE	5.090	0.012	110.439	<0.001	5.562	0.008
	Chao1	3.967	0.027	114.427	<0.001	4.440	0.019

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2.2 不同作物和施肥处理对黑土中16S rRNA基因丰度的影响

供试土壤中的16S rRNA基因丰度测定结果如图1所示,玉米季土壤中16S rRNA基因拷贝数为6.32× 10⁸—8.83×10⁸/ng DNA,大豆季拷贝数为0.96×10⁹—2.30×10⁹/ng DNA,表明2种作物季存在显著差异。在玉米季中,mMNPK处理的拷贝数最高,为8.83×10⁸/ng DNA,比mCK和mNPK处理分别提高了39.72%、36.63%;另外,mM处理也较mCK和mNPK处理分别提高23.73%、20.86%。在2种作物季中均为有机肥无机肥配施的拷贝数最高,无机肥处理和不施肥处理间没有显著性差异。16S rRNA基因拷贝数与土壤化学性质的Pearson相关性分析（表3）,结果表明,基因拷贝数与土壤硝态氮和速效钾极显著正相关,而与铵态氮极显著负相关。

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图1两种作物季不同施肥处理黑土中16S rRNA基因丰度拷贝数
小写字母表示玉米季不同处理间差异达显著水平;大写字母表示大豆季不同处理间差异达显著水平（P<0.05）
-->Fig. 1Copy numbers of 16S rRNA gene in soil samples from different fertilization treatments of two crop growing seasons detected by real-time PCR
Lowercase letters are significant among maize season treatments; Capital letters are significant among soybean season treatments (P<0.05)
-->

Table 3
表3
表316S rRNA基因拷贝数、α多样性指数与土壤化学性质Pearson相关性分析
Table 3Pearson correlation coefficients between 16S rRNA gene sequence copy numbers, α diversity index and soil chemical characteristics

项目 Item	pH	有机质 Organic matter	全氮 Total N	硝态氮 NO₃^-	铵态氮 NH₄⁺	有效磷 Available P	速效钾 Available K
16S rRNA	-0.223	0.214	-0.388	0.860**	-0.657**	0.386	0.699**
Shannon	-0.1	0.029	-0.593**	0.279	0.922**	0.124	0.808**
ACE	0.303	-0.24	-0.002	-0.461*	-0.490*	-0.457*	-0.396
Chao 1	0.291	-0.233	-0.003	-0.454*	-0.477*	-0.447*	-0.391

**,0.01水平具有显著相关性;*,0.05水平具有显著相关性 **, correlation is significant at the 0.01 level; *, correlation is significant at the 0.05 level

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2.3 不同作物和施肥处理对黑土中微生物α多样性的影响

两种作物季不同施肥处理的微生物 α多样性指数均值统计情况见表4。无论是多样性指数Shannon,还是丰富度指数ACE与Chao1均是大豆季高于玉米季,两种作物季具有显著性差异。ACE指数玉米季为3 674.58—4 034.84,而大豆季在4 167.47—4 887.36。通过分析可见作物明显影响土壤微生物α多样性。
Table 4
表4
表4两种作物季不同施肥土壤中微生物α多样性指数分析
Table 4α-diversity index of microorganisms under different fertilizer treatments of two crop growing seasons

作物 Crop	处理 Treatment	Shannon	ACE	Chao1
玉米 Maize	mCK	6.46 ±0.47abc	3795.59 ±150.34a	3621.66 ±184.67ab
	mM	5.91 ±0.22a	3674.58 ±178.40a	3552.56 ±188.61a
	mMNPK	6.08 ±0.26ab	4034.84 ±256.96a	3883.83 ±239.49ab
	mNPK	6.00 ±0.02ab	3786.14 ±74.16a	3662.82 ±84.75ab
大豆 Soybean	sCK	6.67±0.48abc	4654.99 ±105.32bc	4508.66 ±112.33cd
	sM	6.99 ±0.08c	4887.36 ±97.43c	4656.11 ±81.24d
	sMNPK	6.93 ±0.06c	4696.49 ±334.88c	4528.60 ±298.58cd
	sNPK	6.75 ±0.14bc	4167.47 ±70.15ab	4072.87 ±23.82bc

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大豆季4个处理α多样性指数比较,单施有机肥处理（sM）均最高;有机肥配施无机肥（sMNPK）的ACE指数和Chao1指数高于无机肥处理（sNPK）,更接近于不施肥处理（sCK）。可见长期施肥会引起土壤微生物α多样性的改变。总体上,有机肥配施无机肥处理α多样性比无机肥处理高。
通过施肥和作物对土壤微生物多样性指数影响的方差分析（表2）,可知施肥和作物对多样性指数均有显著影响。进一步分析α多样性指数与土壤化学性质Pearson相关性（表3）,从表中数据可知α多样性指数与土壤全氮、硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾等具有相关性。Shannon指数与全氮含量具有极显著负相关性,与铵态氮和速效钾含量具有极显著正相关性。

2.4 不同作物和施肥处理对黑土中微生物组成的影响

经高通量测序分析可知,玉米季有88.53%— 91.37%为细菌,古菌比例为7.53%—11.62%,另外的1.09%—1.17%为不可确定;大豆季有93.91%—96.71%为细菌,古菌仅占2.70%—4.10%,有0.32%—2.18%不能确定。且两种作物季的古菌中均约99%以上为Crenarchaeota,细菌群落对不同作物季的响应更为显著。两种作物季的不同施肥土壤中微生物门水平组成见图2,玉米季细菌主要的5个菌门分别为Acidobacteria（24.47%—27.90%）、Proteobacteria（18.60%— 21.43%）、Verrucomicrobia（12.23%—16.93%）、Bacteroidetes（7.16%—10.49%）和Gemmatimonadetes （4.07%—6.14%）。大豆季细菌主要的5个菌门分别为Proteobacteria（27.78%—34.40%）、Acidobacteria（16.39%—20.94%）、Gemmatimonadetes（8.85%— 11.03%）、Actinobacteria（8.03%—10.34%）和Verrucomicrobia（7.80%—8.37%）。两个作物季的Bacteroidetes和Actinobacteria 相对丰度差异明显。

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图2两种作物季不同施肥土样中微生物门水平的组成（相对丰度>1%）
-->Fig. 2Relative abundance of soil microorganisms under long-term fertilization of two crop growing seasons (At phylum level, relative abundance>1%)
-->

表5中列出了大豆玉米2种作物季不同施肥处理土壤中微生物纲水平的组成。从表中可知,Acidobacteria在两种作物季中出现较大变化;Chloracidobacteria在玉米季相对丰度为12.01%—18.55%,而大豆季为4.25%—9.37%,玉米季的比大豆季所占的比例提高了7.76%—9.18%。另外,Chloracidobacteria在同一作物季的施肥处理相对丰度要低于不施肥处理,如mM（16.02%）、mMNPK（13.48%）和mNPK（12.01%）的相对丰度均小于mCK（18.55%）的相对丰度。通过微生物组成与土壤化学性质Pearson相关性分析（表6）,可知Acidobacteria相对丰度与土壤pH极显著正相关;与铵态氮、有效磷和速效钾含量极显著负相关。
Table 5
表5
表5两种作物季不同施肥土壤中微生物纲水平的组成（8组中至少有1组的相对丰度>1%）
Table 5Relative abundance of soil microorganisms under long-term fertilization of two crop growing seasons (At class level, at least one group in eight groups relative abundance>1%)

界 Kingdom	门 Phylum	纲 Class	相对丰度Relative abundance(%)
界 Kingdom	门 Phylum	纲 Class	mCK	mM	mMNPK	mNPK	sCK	sM	sMNPK	sNPK
Bacteria	Acidobacteria	Chloracidobacteria	18.55e	16.02d	13.48c	12.01c	9.37b	8.37b	5.25a	4.25a
		Solibacteres	1.4a	1.19a	1.63a	2.56b	1.34a	1.19a	2.45b	3.41c
		Acidobacteria-6	4.96ab	5.25b	5.51b	4.1a	8.65d	8.61d	6.51c	4.57ab
		Acidobacteriia	0.92a	1.24a	2.76b	4.14c	0.47a	0.27a	1.23a	2.92b
	Bacteroidetes	Saprospirae	8.34d	5.05c	5.27c	5.25c	2.01a	3.24b	2.87ab	2.02a
		Cytophagia	1.25d	0.68bc	1.18d	1.04cd	0.24a	0.42ab	0.46ab	0.16a
	Proteobacteria	Deltaproteobacteria	7.58e	7.35de	6.53d	5.44c	3.74b	4.07b	3.69b	2.33a
		Gammaproteobacteria	2.70ab	2.4a	3.94c	3.75c	2.18a	2.94ab	3.86c	3.38bc
		Betaproteobacteria	6.38b	5.04a	6.25b	5.78ab	10.19c	11.56d	9.94c	11.79d
		Alphaproteobacteria	4.04a	3.74a	4.68a	5.21a	11.66b	11.05b	14.97c	16.9d
	Gemmatimonadetes	Gemmatimonadetes	4.0ab	3.02a	4.95b	4.28b	8.27c	7.29c	7.6c	9.72d
		Gemm-1	0.68a	0.84abc	0.92abc	0.76ab	0.86abc	0.75ab	1.07bc	1.16c
	Verrucomicrobia	Spartobacteria	7.94abc	13.68d	9.22bc	9.51cd	6.52c	6.35a	6.78ab	6.47a
		Pedosphaerae	3.11b	2.94b	2.58b	3.08b	1.17a	1.52a	1.11a	1.04a
	Planctomycetes	Phycisphaerae	0.72a	0.58a	0.88a	0.89a	2.42b	2.99c	3.39c	3.89d
		Planctomycetia	1.74ab	1.71ab	1.48a	1.47a	2.87c	2.63cb	2.65bc	2.42b
	Actinobacteria	Actinobacteria	0.85a	0.81a	1.05a	1.16a	4.43b	3.61b	3.7b	4.54b
		Thermoleophilia	0.85a	1.15ab	1.18ab	1.35ab	3.28c	3.13c	2.49bc	3.22c
	Chloroflexi	Anaerolineae	1.63c	1.18ab	0.62ab	0.93abc	0.42ab	0.59ab	0.5ab	0.2a
	Nitrospirae	Nitrospira	2.54c	3.47d	2.71c	2.29cb	2.69c	2.38cb	1.57b	0.9a
Archaea	Crenarchaeota	Thaumarchaeota	7.5b	10.21c	10.33c	11.58c	2.96a	2.69a	4.09ab	2.96a

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Table 6
表6
表6微生物组成与土壤化学性质Pearson相关性分析
Table 6Pearson correlation coefficients between soil chemical characteristics and microbial compositions

门 Phylum	pH	有机质 Organic matter	全氮 Total N	硝态氮 NO₃^-	铵态氮 NH₄⁺	有效磷 Available P	速效钾 Available K
Crenarchaeota	0.055	0.01	0.652**	-0.12	-0.890**	-0.009	-0.730**
Acidobacteria	0.529**	-0.065	0.193	-0.452	-0.891**	-0.526**	-0.672**
Actinobacteria	-0.171	0.045	-0.510*	0.125	0.890**	0.084	0.686**
Bacteroidetes	0.273	-0.142	0.334	-0.213	-0.806**	-0.242	-0.524**
Chloroflexi	-0.043	-0.058	-0.666**	0.158	0.911**	0.024	0.708**
Gemmatimonadetes	-0.359	-0.126	-0.386	0.282	0.896**	0.306	0.693**
Nitrospirae	0.797**	0.256	-0.21	-0.376	-0.585**	-0.711**	-0.575**
Planctomycetes	-0.197	0.092	-0.519**	0.257	0.949**	0.181	0.758**
Proteobacteria	-0.528**	-0.041	-0.232	0.432*	0.907**	0.513*	0.754**
Verrucomicrobia	0.244	0.159	0.462*	-0.282	-0.842**	-0.233	-0.788**

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供试土壤中的Proteobacteria在大豆玉米两种作物季中变化也较大（表5）,其中,Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria的相对丰度在玉米季分别为5.04%—6.38%和3.74%—5.21%;而在大豆季两者分别为9.94%—11.79%和11.05%—16.9%。Alphaproteobacteria的相对丰度在玉米季各施肥处理没有显著性差异,而在大豆季sMNPK（14.97%）和sNPK（16.90%）之间存在显著差异,sCK（11.66%）和sM（11.05%）之间没有显著性差异。Gammaproteobacteria的相对丰度在sMNPK和sNPK处理比不施肥处理增加1.72%和1.2%。另外,Proteobacteria相对丰度与土壤化学性质Pearson相关性分析（表6）,Proteobacteria相对丰度与pH极显著负相关;与硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾含量极显著正相关。
从表5中数据显示,Actinobacteria门中的Actinobacteria纲在玉米季的相对丰度为0.81%—1.16%,大豆季的提高到3.61%—3.54%,相同作物季的不同施肥处理间没有显著性差异。Actinobacteria相对丰度与全氮显著负相关;与铵态氮和速效钾含量极显著正相关。Bacteroidetes门中的Saprospirae的相对丰度,在玉米季3个施肥处理间没有差异,但与不施肥处理存在显著差异;而在大豆季的有机肥处理和有机无机配施处理要显著高于不施肥与无机肥处理。Bacteroidetes相对丰度与铵态氮和速效钾含量极显著负相关。

2.5 不同作物季和施肥处理的聚类分析

通过聚类分析,具有相似β多样性的供试样品聚类在一起,本研究各处理的结果（图3）显示主要聚类成两大分支,每一分支由同一作物季的各个施肥处理聚类组成。玉米季的mNPK处理的几个平行先行相聚,再依次与mMNPK、mM和mCK聚类;大豆季则是sCK与sM先聚类,而后依次与sMNPK和sNPK聚类。

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图3两种作物季不同施肥处理的β多样性分析
-->Fig. 3β diversity analysis of soil microorganisms under long-term fertilization of two crop growing seasons
-->

3 讨论

3.1 不同作物和施肥处理影响黑土中16S rRNA基因丰度的变化

本研究表明,大豆季黑土中16S rRNA基因丰度明显高于玉米季,大豆季的有机肥配施无机肥处理16S rRNA基因的拷贝数比玉米季的提高了1.60倍。因此可知,种植不同作物是影响土壤16S rRNA基因丰度的一个重要因素,种植大豆提高了土壤16S rRNA基因丰度。另外,HAN等^[28]利用平板计数的研究也发现豆科植物能够明显增加可培养微生物数量。其原因可能是因为种植作物根系分泌物的不同,而引起根系周围及其土壤中细菌等微生物种群结构的变化,大豆是豆科作物,其根瘤内部具有固氮能力的根瘤菌,能为土壤微生物提供更多的氮源;同时大豆根系分泌物中脂肪酸较多,能活化土壤中难溶的养分,提供更多营养物质,更有利于土壤中微生物的生长繁殖^[29]。
ZHOU等^[17]研究发现长期施用氮肥会显著降低土壤中16S rRNA基因的拷贝数。而WESSÉN等^[30]研究得出施用无机肥硝酸钙和硫酸铵会提高16S rRNA基因的拷贝数。我们的研究表明,无机肥处理并没有降低基因拷贝数,施用有机肥,尤其是有机肥配施无机肥能显著提高基因拷贝数。且土壤中16S rRNA基因拷贝数与土壤化学性质有明显的相关性（与硝态氮、速效钾含量显著正相关,而与铵态氮含量负相关）。前面分析已知土壤化学性质同时受施肥和作物的影响,进一步表明黑土中微生物的丰度的变化是施肥和作物共同作用的结果。

3.2 不同作物和施肥处理对黑土中微生物多样性的影响

本研究发现在同一处理中,大豆季的土壤微生物多样性明显高于玉米季,如有机肥配施无机肥处理的Chao1指数大豆季比玉米季提高了16.60%。此外,WU等^[16]研究长期定位试验站的红壤水稻土,结果表明有机肥配施无机肥处理的土壤微生物多样性与无机肥处理之间没有显著性差异;而TIAN等^[31]发现大量施用有机粪肥较无机肥降低土壤微生物多样性。我们的研究与DOAN等^[32]的发现一致,即有机肥无机肥配施的微生物多样性高于无机肥。这可能与土壤类型和施肥的时间有关系,TIAN是短期定位实验（3年）,而本研究是基于35年以上的长期定位实验的结果。
本文的聚类分析表明,群落结构按照作物季分成明显的两大簇,说明其存在较大差异,同时,同一簇的4个不同施肥处理相互比较,得知不同施肥方式也引起了群落结构间的差异。与有机肥无机肥配施相比,施无机肥对黑土土壤微生物群落结构改变更大。因此,长期施肥导致的东北黑土中微生物群落的变化跟作物种类、气候和降水等因素相关,但各因素作用的程度如何还不得而知。同时,根据土壤微生物多样性指数与化学指标的相关性分析,可知多样性指数与土壤全氮、硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾等化学性质密切相关。

3.3 不同作物和施肥处理对黑土中微生物组成的影响

本研究表明在大豆和玉米季中的土壤微生物组成存在较大差异。玉米季的古菌所占比例（7.53%— 11.62%）高于大豆季（仅占2.70%—4.10%）;玉米季Acidobacteria是细菌中相对丰度最高的菌门,而大豆季相对丰度最高的菌门是Proteobacteria;玉米季的Bacteroidetes相对丰度较高而在大豆季较低,大豆季的Actinobacteria相对丰度较高而在玉米季较低。Bacteroidetes和Actinobacteria丰度在两季作物中差异明显,作物影响微生物组成,这个结果与以前的报道一致^{[13, 33]}。且同一作物不同施肥处理之间也存在差异,如Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria相对丰度变化较大,施肥处理均比不施肥处理的相对丰度提高,对有机肥配施无机肥和无机肥均比较敏感。Actinobacteria的相对丰度不同施肥处理之间没有明显差异。Chloracidobacteria在不施肥处理具有较高相对丰度,而对有机肥配施无机肥、有机肥和无机肥均表现不稳定性。以上分析得知,作物和施肥均改变了土壤微生物的群落组成,组成的改变是否会引起土壤微生物整体代谢功能的变化,还有待于更深入的研究。
根据土壤微生物组成（门水平）与化学指标的相关性分析,可知微生物组成与土壤pH、全氮、硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾等化学性质密切相关。土壤质量的改变是缓慢的、长期积累的效应,土壤微生物随着土壤性质的改变而改变。而本论文没有关于施肥和作物引起微生物数量、多样性等变化的贡献量进行量化分析,以及施肥与作物交互作用机理等的研究,这些问题还需进一步研究探讨。

4 结论

本研究表明,施肥和不同作物均对东北黑土土壤微生物丰度、α多样性和群落结构产生了影响。连续施用无机肥会导致土壤酸化,而有机肥无机肥配施能有效地提高土壤pH,缓解酸化。且土壤化学性质与土壤微生物群落变化具有相关性。有机肥配施无机肥显著增加了黑土中微生物的16S rRNA基因拷贝数,而无机肥对其影响不显著;大豆种植季的16S rRNA基因拷贝数显著高于玉米种植季。有机肥配施无机肥的α多样性指数高于无机肥;大豆种植季的α多样性指数较玉米种植季的高。
The authors have declared that no competing interests exist.