基于荧光检测技术的多花黑麦草EST-SSR指纹图谱的构建

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本站小编 Free考研考试/2021-12-26

刘欢, 张新全, 马啸, 张瑞珍, 何光武, 潘玲, 金梦雅. 基于荧光检测技术的多花黑麦草EST-SSR指纹图谱的构建[J]. , 2017, 50(3): 437-450 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.03.003
LIU Huan, ZHANG XinQuan, MA Xiao, ZHANG RuiZhen, HE GuangWu, PAN Ling, JIN MengYa. Construction of EST-SSR Fingerprinting Based on Fluorescence Detection Technology for Italian Ryegrass[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2017, 50(3): 437-450 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.03.003

0 引言

【研究意义】多花黑麦草（Lolium multiflorum Lam.）作为中国南方种植面积最大的一年生牧草,受到广大农牧民的关注^[1]。在长期引种、育种和选种的过程中,栽培范围不断扩大,品种不断增加,市场销售的商品种子出现了同名异物、同物异名、多种混卖、种子不纯等现象,阻碍了优良品种推广及应用,严重危害了育种者和生产者的利益,因此,能有效地鉴定区别不同品种是合理利用多花黑麦草的前提条件之一。【前人研究进展】目前,多花黑麦草品种常见的鉴定方法包括DUS鉴定法（distinctness,uniformity,stability）和DNA指纹图谱鉴定法,但由于DUS鉴定成本高,且易受环境因素和人为测量因素影响^[2-3],因此,在不断完善多花黑麦草DUS测试指南的同时,DNA指纹图谱在多花黑麦草的品种鉴定中的应用也不可忽视^[4]。国际植物新品种保护联盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants,UPOV）已批准在已有DNA指纹图谱的基础上^[5],DNA分子标记技术可以应用于近似品种的辅助筛选^[6]。HIRATA等^[7]研究证明SSR分子标记可以有效鉴定多花黑麦草和其相似的品种;PASAKINAKIENE等^[8]利用SSR标记对多花黑麦草、多年生黑麦草、草地羊茅和高羊茅进行了鉴定;赵欣欣等^[9]通过SSR分子标记鉴定了多花黑麦草杂种后代真实性和表型差异;罗永聪等^[10]通过12对SSR引物构建的指纹图谱区分了21个多花黑麦草品种（系）;黄婷等^[11]通过20对SSR引物对6个多花黑麦草品种进行了鉴定分析。PRAKASH等^[12]虽然对琼脂糖凝胶电泳技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行了优化,但仍难以满足试验中高效、准确、大样品数的需求,因此,在这样的现状中,毛细管电泳荧光检测技术逐渐受到关注。SSR荧光标记毛细管电泳法是以DNA测序技术为基础发展起来的检测方法,具有高效、自动化等优点。程本义等^[13]和陈雅琼等^[14]研究表明荧光标记技术检测效率显著高于聚丙烯凝胶电泳,结果更为精确灵敏,更适用于材料的高通量检测分析。易红梅等^[15]通过对7个SSR位点的检测分析,通过毛细管电泳荧光标记检测法和变性PAGE银染法分别构建了192份玉米品种的指纹图谱,结果得出荧光标记技术检测法效率更高;许鲲等^[16]也通过40对SSR荧光引物构建了163份国家冬油菜的指纹图谱。SANCHEZ-PEREZ等^[17]探讨了琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳3种技术在杏仁研究上的优劣,结果证明聚丙烯酰胺凝胶电泳与毛细管电泳比琼脂糖凝胶电泳效果更佳,但DNA自动测序仪成本较高,而PAGE更耗费时间。因此,目前的检测方法都各有优缺点,单一的检测技术在品种鉴定和指纹图谱构建中已经难以满足所有试验需求,因此,在不同的试验阶段按实际需求选择合适的检测技术,可显著提高鉴定效率。【本研究切入点】EST-SSR分子标记是基于植物表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）进行开发的SSR标记,物种间通用性高、侧翼序列保守性高,可直接反映出转录区的差异^[18],被广泛应用在结缕草^[19]、牛鞭草^[20]和高丹草^[21]等禾本科植物DNA指纹鉴定中。目前,已通过RAPD、SSR和ISSR等分子标记构建了黑麦草的DNA指纹图谱,但是EST-SSR分子标记在黑麦草指纹图谱构建上的应用未见报道,仍未见SSR荧光标记毛细管电泳检测法在多花黑麦草上的应用。【拟解决的关键问题】本研究结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳荧光检测技术,构建10个多花黑麦草品种（系）的指纹图谱,为多花黑麦草品种育成、品种鉴定提供高通量技术手段,完善多花黑麦草现有的DNA指纹数据库。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择10个四倍体多花黑麦草材料,包括8个国审品种,2个新品系,均由四川农业大学草业科学系2014—2015年收集（表1）。于2015年9月在光照培养箱中水培发芽育苗,待植株长至4—5叶龄取样。
Table 1
表1
表1供试10个多花黑麦草品种（系）信息
Table 1Informations of 10 L.multiflorum varieties (strains) used in this study

编号 No.	材料名称 Material name	来源 Origin	品种类型 Type
1	特高 Tetragold	百绿集团 BARENBRUG	引进品种 The introduced varieties
2	长江2号 Changjiang No.2	四川农业大学 Sichuan Agricultural University	育成品种 The bred varieties
3	赣选1号 Ganxuan No.1	江西省畜牧技术推广站 Jiangxi livestock technologies popularizing Station	引进品种 The introduced varieties
4	阿伯德 Aubade	FF公司 FF company	引进品种 The introduced varieties
5	达伯瑞 Double Barrel	丹农种子公司 DLF-TRIFOLIUM	引进品种 The introduced varieties
6	邦德 Abundant	丹农种子公司 DLF-TRIFOLIUM	引进品种 The introduced varieties
7	杰威 Splendor	丹农种子公司 DLF-TRIFOLIUM	引进品种 The introduced varieties
8	川农1号 Chuannong No.1	四川农业大学 Sichuan Agricultural University	育成品种 The bred varieties
9	川农2号 Chuannong No.2	杂交后代连续混合选择 The hybrids are propagated mixedly and continuously by the mode selection	新品系 The new lines
10	LG1（F₄N×赣选1号）	杂交后代连续混合选择 The hybrids are propagated mixedly and continuously by the mode selection	新品系 The new lines

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1.2 DNA的提取

参考行业标准《植物品种鉴定DNA指纹方法总则》（NY/T 2594-2014）^[22],由于多花黑麦草是异花授粉植物,因此,采用单株鉴定的方式,每份材料选取20个单株,共200个单株的幼嫩植株,通过试剂盒（北京天根生化公司）提取基因组DNA,然后用超微量分光光度仪（NanoVue Plus）检测DNA纯度和浓度,选取合格的DNA样品于-20℃保存备用。

1.3 EST-SSR引物筛选

引物筛选采用3个田间表型性状差异较大的多花黑麦草品种（特高Tetragold、长江2号ChangjiangNo.2和阿伯德Aubade）,每个品种选择4个单株,共12个单株提取DNA。所用引物序列由多花黑麦草转录组自行测序开发而来,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR所用94 kD分子量Taq酶、PCR-Mix混合液（含有10×PCR buffer、Mg²⁺、dNTPs）和50 bp DNA ladder Marker均购自北京天根生化公司。
引物筛选采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行,EST-SSR优化反应体系为15 µL,在前人的基础上稍作修改^[11],包括DNA 1.5 μL（10 ng·μL^-1）、正反向引物各0.3 μL（10 pmol·μL^-1）、Taq酶0.3 μL（2.5 U·μL^-1）、PCR-Mix 7.5 μL（10 ng·μL^-1）和ddH₂O 5.1 μL。PCR反应程序为94℃ 5 min;94℃ 30 s,退火45 s,72℃ 1 min,35个循环;72℃ 10 min,4℃保存。扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺Acr﹕N'-N'甲叉双丙烯酰胺Bis =29﹕1,1×TBE缓冲液）上进行检测。每样品点样5.5 μL,50 bp DNA Ladder为分子量标准,200 V电压预电泳30 min,而后400 V电压电泳2 h,在0.1%的AgNO₃溶液中银染,在NaOH溶液中显色^[23],凝胶用Bio-6000凝胶扫描仪扫描保存以供分析。最终从200对自主开发的EST-SSR引物（分别编号为N1—N200）中共筛选出30对高效引物,并根据反复试验的结果调整最终的退火温度与循环数（表2）。
Table 2
表2
表230对EST-SSR荧光引物信息
Table 2Informations of 30 EST-SSR fluorescence primer pairs

编号 No.	重复序列 RM	正向引物 Forward primer sequence (5′-3′)	解链温度 Tm (℃)	反向引物 Reverse primer sequence (5′-3′)	解链温度 Tm (℃)	目标片段 TF (bp)	退火温度 AT (℃)	循环数 NC
N1	ATC	ACCATCTTTCCTTGTGTGCTTTA	60.0	CCATCACCATTCTGTAAGCTAGG	60.0	103	64.0	35
N7	TGG	TTAATGACTTGGGAGTAGGCATC	59.5	ACAAGACTAACACCAGCAACACA	59.8	125	69.0	40
N14	AAG	ATAGTTCTTTGTCTGGCTCTTGG	59.0	TGCCTTTTTCTTCCTCTTTATCA	59.4	86	60.0	35
N15	T	TGGTGCAACTTTTAAAGACTTGATT	60.4	TATGGGTAGGAAGTGTATGCAGG	60.3	153	60.0	35
N37	GCC	AGAGCCTGCATGCATGAGTAGT	61.4	GAAGCGAGGAGGGCTGAG	61.2	101	70.0	40
N38	GGC	GTTGTCGAAGGCGCAGAC	60.6	CAGATAAAGGGGCTGACCG	60.6	159	69.0	40
N54	AG	CGGCTACAGAAAAACACAGAACT	59.9	ATGTATGCCCTTCTTTTAGCACA	60.0	137	58.0	35
N57	TC	CTCCTGGACTGGCTCCCT	60.4	CGGATATACACCCTTGTCCAGT	60.1	83	64.0	40
N63	CTT	CCTCTTCTCTTCCACTTCTGCT	59.3	AGATCTTGATCTGGAGGAGGG	59.6	116	67.0	40
N65	ACG	CACAGAGCTCTTGTCAGTTGGT	59.6	GACTGCTTGCTCCTCCTCTC	59.3	139	69.0	35
N69	GCA	CTCGGACTTCTTCGAGTCGT	59.6	CAGGTATTGCACGTCCACC	60.0	159	67.0	35
N77	GCA	GTGTGGATGCACAACAACAAG	60.1	GTGACTGCATGGCGACTG	60.0	115	67.0	35
N78	GAG	CTCTACGACTCCATCCCCAA	60.1	GAGATGAGCCCGTCCTTGT	60.2	152	69.0	35
N87	CGA	AGGATCTCAGGGAGCACGTC	61.8	CTACTTCCTCCAGGAGTCGAAGA	61.2	132	69.0	35
N92	AT	ATCACAGGAATCATGTTAAGGACT	58.1	TGGGCAACCATATGTCTAATCTT	59.8	158	67.0	35
N98	GAG	ACCGGTGTAACTGAAGGTGATAAT	60.1	GTGAAGAGCTATCTTCAGCGGT	60.0	157	64.0	35
N101	ATCC	CCAAAAGAATCAATCAGGACAAG	60.0	CCCGAACATTTTTAGACAGACTC	59.2	104	61.0	35
N105	TGG	TGACGAAGGTAATGATGACACTG	60.0	ATCTTCGTCGTCATTTATGTTGC	60.4	115	60.0	35
N107	CCG	AACCCTAGTCTGAAGAGGGAGC	60.3	GCATCTTCCTCCACCTTGG	60.6	110	66.0	35
N122	CTG	CGCCATTGCTATCCTCCTC	60.7	GAAGCTGACTTTCTCCAGCCTAC	60.9	139	67.0	35
N124	TA	TGTATCCCAGTCTGTGTTCATTG	59.9	ACTGAACGCCATATTCATCTCAT	59.9	129	64.5	40
N146	GCTCT	CCATGACTAGCTCACCAATCTCT	59.8	AAAGGAGAACCAGAGGAGAACAT	59.7	98	68.0	40
N151	GCT	GGTGAGCTCCTCCACCCT	60.2	AGCACTTCTCCTTCTTCAACTCC	60.4	149	70.0	40
N152	TCG	CCTGCATGATGGAGAAGTCC	60.6	CGAAGAACCAAAAACAAGCAG	59.9	128	64.0	35
N154	CA	CCAAGTTGCTTTTTAGGACCTTT	60.0	ATTTCAGAATATCATGCTCTGCG	60.6	146	64.0	35
N156	CAA	GGACCTTACAATATCACATGCCT	59.3	GTCTCTCACTTCAAAGGACCATC	59.2	120	64.0	40
N157	GCG	GTACCCCTTCTCCAGCAGC	59.8	GTAACTATCAACATGACCGTCGTC	59.8	156	70.0	35
N168	TG	TGTCCAGCAGTCTTCTTAGGGTA	60.3	TCCGCTGTAAAATTCTTGCATTA	60.9	154	63.0	40
N172	CTG	AGGATACATGAGCGTGACTTGAG	60.7	CATCATGAGTCGCAGGCAT	60.8	147	70.0	35
N177	ATAACA	ATAGAAGCCAGGGAAGATACAGG	60.0	CTCAGTATCATCATTCCACCTCC	59.8	95	61.0	40

RM: Repeat motif; TF: Target fragment; Tm: Melting temperature; AT: Annealing temperature; NC: Number of cyclesRM：重复序列;TF：目标片段;Tm：解链温度;AT：退火温度;NC：循环数

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1.4 荧光标记毛细管电泳

将从200对引物中筛选出的30对EST-SSR引物（表2）,在每对引物5′端添加荧光标记FAM（6-carboxy-fluorescein）。试验中所用荧光引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物用灭菌ddH₂O溶解并稀释到10 µmol·μL^-1备用。
毛细管电泳的PCR扩增采用10 µL的反应体系,其中包括5 ng DNA、3U Taq DNA聚合酶、2 mmol·L^-1Mg²⁺、5 mmol·L^-1 dNTPs、2 μmol·L^-1正向引物和反向引物、2 μmol·L^-1 FAX荧光标记和7 μL ddH₂O。PCR反应体系为94℃ 5 min;94℃ 30 s,不同退火温度退火30 s,72℃ 1 min,35或40个循环;72℃ 10 min,4℃保存。将PCR产物稀释,在96孔板的各孔中分别加入9 μL去离子甲酰胺、0.05 μL GS3730-500分子量内标和1 μL稀释后的PCR产物,95℃变性5 min,于4℃冷却10 min,再置于ABI 3730XL DNA分析仪（Applied Biosystems,Foster City,USA）上进行自动荧光检测。毛细管电泳程序为预电泳15 kV,2 min;2 kV电压进样10 s;电泳15 kV,20 min。最后设置分子内标（Size Standard）和参数（Parameters）用Data Collection和Gene Marker软件进行数据收集与图像分析。

1.5 数据统计与分析

原始数据采用Data Collection软件收集,并根据引物筛选时确定的分子量范围及引物颜色进行分子量的确定,用Gene Marker 2.2.0软件进行分析,最终将电泳结果转化成PDF图片形式导出。将毛细管电泳检测所得的SSR扩增片段信息输入EXCEL表格,以多花黑麦草品种编号和基因型编号为横列,以扩增核苷酸片段大小为纵列,有稳定扩增核苷酸片段记为“1”,没有或扩增不稳定的记为“0”,生成由“1”和“0”构成的原始数据矩阵。然后根据表征矩阵,数据通过DCFA 1.1^[24]生成,利用POPGENE 1.31软件^[25]计算I值（Shannon’s information index）和H值（Nei’s gene diversity）。多态性信息含量PIC值（Polymorphism information content）参考Nei^[26]的方法进行计算,PIC=1-ΣP_i²（P_i表示第i个等位位点出现的频率,反映每个SSR位点的多态性水平）。
指纹图谱代码采用陈昌文等^[27]方法,并根据指纹图谱代码构建10个多花黑麦草材料的DNA指纹图谱;最终将每个材料的信息分别整合到QR编码中,编码中扩增信息标注方式参考宋海斌等^[28]标注方法,依据扩增位点分子量从小到大的顺序记录各检测位点的分子量（单位为bp,略去单位bp,只记录数字）,如果一份材料经同一引物扩增同时检测出多个位点,则用“-”连接数字,即可简单表示每个材料的扩增信息。

2 结果

2.1 EST-SSR标记多态性分析

利用初步筛选出的30对EST-SSR引物对10个多花黑麦草材料进行了荧光标记毛细管电泳检测。发现部分由聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出的引物,添加荧光标记后在毛细管电泳中难以检测到稳定片段或检测效果不佳,不适用于多花黑麦草高通量指纹鉴定中,因此,根据DNA分析仪检测到的片段,排除检测异常、具有较多异常峰型的、较多位点不易判别的引物,筛选出能检测到稳定变异等位基因的25对EST-SSR引物,每条扩增片段的长度范围为51—249 bp。采取每个材料20个单株进行毛细管电泳^[6],删除部分不稳定扩增片段后,获得稳定性较高的扩增片段信息（表3）。
Table 3
表3
表325对EST-SSR引物扩增片段信息
Table 3Amplified fragment informations of 25 EST-SSR primer pairs

引物 Primer	扩增片段长度 Amplified fragment length (bp)
N1	51	53	59	100	102
N7	110	113	116	123	126
N14	72	74	78	78	80	83
N37	86	90	93	96	99
N38	143	146	149	150	152	153
N54	127	129	131	136	138	141
N63	109	111	114	117
N65	131	132	134	137	140
N69	151	153	154	156	157
N77	107	110	113
N78	143	151	153
N87	114	126
N98	153	156	159
N101	92	95	98	99	100	102	103	105	106
	110	118
N105	114	117	121
N107	106	109	110	112
N122	127	132	134	137
N124	117	127	129	131
N146	86	88	89	91	93	97
N151	129	138	139	142	143	145	146	152	155
N152	127	130
N154	140	142	144	146	148	151
N156	102	112	113	116	118	121	124
N168	152	168	169	171	183
N177	74	86	91	92	231	237	243	249

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25对EST-SSR引物对10个多花黑麦草品种（系）进行扩增,共检测出127个等位基因。不同引物扩增的等位基因数明显不同,可检测到有效等位基因数为2（N87）—11（N101）个,平均每个引物5.08个等位基因;特异等位基因数范围为0（N152）—11（N101）个,平均每对引物4.00个,多态性位点比率为33.33% —100.00%,平均73.02%（表4）。PIC变动范围为0.484（N87）—0.877（N101）,平均0.702,表明多花黑麦草材料间变异较大,具有丰富的遗传多样性。Shannon指数最大为3.322（N101）,均值为1.929;基因多样性指数变动范围为0.159（N101）—0.500（N152）,平均0.318;可鉴别的材料数为0—10个。综上所述,可得出引物N101是所有引物中鉴定效率最高的引物,该引物可完全区分本试验所有的多花黑麦草材料。测得的序列若按二倍性估算,最多可能鉴别121种材料,在以后多花黑麦草DNA指纹数据库的构建中应重点应用。
Table 4
表4
表4EST-SSR引物扩增结果及多态性信息
Table 4Results and the polymorphism informations of EST-SSR primers

引物 Primer	有效等位基因数 NEA	特异等位基因数 NSA	多态性位点比率 PPS(%)	多态性信息量 PIC	Shannon指数 I	基因多样性指数 H	区分材料数 DV	最多区分材料数 DMV
N1	5	5	100.00	0.651	2.046	0.260	5	25
N7	5	4	80.00	0.735	1.922	0.294	4	16
N14	6	5	83.33	0.772	2.646	0.309	7	25
N37	5	3	60.00	0.761	2.046	0.304	5	9
N38	6	5	83.33	0.729	2.922	0.243	8	25
N54	6	6	100.00	0.768	2.322	0.256	5	36
N63	4	3	75.00	0.698	1.922	0.349	4	9
N65	5	4	80.00	0.740	2.171	0.296	5	16
N69	5	3	60.00	0.707	1.846	0.283	4	9
N77	3	2	66.67	0.579	0.722	0.386	2	4
N78	3	3	100.00	0.615	1.571	0.410	4	9
N87	2	1	50.00	0.484	0.881	0.484	2	2
N98	3	1	33.33	0.625	0.971	0.417	2	2
N101	11	11	100.00	0.877	3.322	0.159	10	121
N105	3	1	33.33	0.625	0.971	0.417	2	2
N107	4	3	75.00	0.653	1.961	0.327	5	9
N122	4	3	75.00	0.626	2.122	0.313	5	9
N124	4	2	50.00	0.653	1.361	0.326	3	4
N146	6	6	100.00	0.770	2.846	0.257	8	36
N151	9	8	88.89	0.834	3.122	0.185	9	64
N152	2	0	0.00	0.500	0.000	0.500	0	1
N154	6	5	83.33	0.806	2.922	0.435	8	25
N156	7	6	85.71	0.780	2.722	0.223	7	36
N168	5	5	100.00	0.776	1.961	0.310	5	25
N177	8	5	62.50	0.800	0.922	0.200	3	25
平均Mean	5.08	4.00	73.02	0.702	1.929	0.318	4.88	21.76

NEA: Number of effective alleles; NSA: Number of specific alleles; PPS: The percentage of polymorphic sites; PIC: Polymorphic information content; I: Shannon’s diversity index; H: Nei’s gene diversity; DV: Distinguished varieties; DMV: Distinguished the most number of varietiesNEA：有效等位基因数;NSA：特异等位基因数;PPS：多态性位点比率;PIC：多态性信息量;I：Shannon多样性指数;H：基因多态性指数;DV：区分材料数;DMV：最多区分材料数

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2.2 EST-SSR标记引物高效性分析

对25对EST-SSR荧光引物在10个多花黑麦草材料的毛细管电泳结果进行统计分析,结果表明,10个多花黑麦草品种（系）均可检测到特异等位基因（表5）,即均可利用一个引物就可鉴别相应的品种。其中,特高、达伯瑞和川农2号只具有1个特征引物;长江2号和邦德具有2个特征引物;赣选1号、阿伯德、杰威、川农1号和LG1具有3个特征引物。另外,一个引物可以同时鉴定多个品种,即它能在多个品种上检测到特异等位基因。如图1,可观察到N101引物在长江2号（118 bp）、赣选1号（105 bp）和川农2号（92 bp）上同时检测到特异等位基因;N168引物在特高（152 bp）、杰威（169 bp）和LG1（168 bp）上同时检测到特异等位基因;N151引物在长江2号（143 bp）和邦德（152 bp）上同时检测到特异等位基因;N156引物在赣选1号（102 bp）和达伯瑞（112 bp）上同时检测到特异等位基因;N38引物在阿伯德（143 bp）和杰威（152 bp）上,N54在杰威（136 bp）和川农1号（138 bp）上,N146引物在赣选1号（93 bp）和LG1（89 bp）上同时检测到特异等位基因;其余引物均只在一个材料上出现特异等位基因。结果表明,25对EST-SSR引物在毛细管电泳下能检测到丰富的等位基因,可有效用于多花黑麦草指纹图谱的构建。

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图1荧光引物N101在长江2号、赣选1号和川农2号（从上至下）单株上的特异峰图
-->Fig. 1Specific peak figures of Changjiang No.2, Ganxuan No.1 and Chuannong No.2 (from up to down) at fluorescent primer N101
-->

Table 5
表5
表510个多花黑麦草材料的14对特征引物
Table 514 specific primer pairs for 10 L.multiflorum materials

材料名称 Material name	特征引物 Specific primer	特异等位基因 Specific allele (bp)	特异等位基因频率 Frequency of specific allele	材料名称 Material name	特征引物 Specific primer	特异等位基因 Specific allele (bp)	特异等位基因频率 Frequency of specific allele
特高	N168	152	0.40	邦德 Abundant	N107	112	0.45
Tetragold				邦德 Abundant	N151	152	0.55
长江2号 Changjiang No.2	N101	118	0.45	杰威 Splendor	N38	152	0.40
长江2号 Changjiang No.2	N151	143	0.50		N54	136	0.50
赣选1号 Ganxuan No.1	N101	105	0.50		N168	169	0.40
	N146	93	0.45	川农1号 Chuannong No.1	N54	138	0.45
	N156	102	0.45		N69	151	0.40
阿伯德 Aubade	N38	143	0.50		N122	132	0.40
	N124	117	0.65	川农2号 Chuannong No.2	N101	92	0.50
	N177	74/231/237	0.75/0.75/0.40	LG1	N1	53/59	0.50/0.55
达伯瑞	N156	112	0.50		N146	89	0.40
Double Barrel					N168	168	0.45

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2.3 多花黑麦草品种（系）DNA指纹图谱构建

2.3.1 指纹图谱标准模式图由于多花黑麦草是异花授粉植物,在品种间和品种内变异均较大,为避免单个引物构建的指纹图谱在更多材料鉴定时的误差,因此,采用引物组合法进行了指纹图谱构建^[29]。根据毛细管检测峰型、PIC值、引物多态性、引物鉴定效率（表4和表5）,从25对EST-SSR引物中选择了6对扩增和检测效果较好的引物（N54、N101、N146、N151、N154、N156）^[30],6对引物可检测到的稳定等位基因数均不小于19个（表6）,在达伯瑞和邦德上可检测到的等位基因数最多,均为22个,其中,基因数较少的是杰威和川农2号,但材料间可检测到的等位基因数差异不显著。
Table 6
表6
表66对引物在不同材料中可检测到的等位基因数
Table 6The number of alleles in different materials by 6 primer pairs

材料名称 Material name	等位基因数 Number of alleles	材料名称 Material name	等位基因数 Number of alleles
特高 Tetragold	20	邦德 Abundant	22
长江2号 Changjiang No.2	20	杰威 Splendor	19
赣选1号 Ganxuan No.1	21	川农1号 Chuannong No.1	21
阿伯德 Aubade	20	川农2号 Chuannong No.2	19
达伯瑞 Double Barrel	22	LG1	20

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利用筛选出的6对EST-SSR荧光引物分别构建了10个多花黑麦草材料检测位点的标准模式图（图2）。以品种长江2号为例,横坐标表示不同的EST-SSR多态性引物,纵坐标表示引物扩增峰图的分子量。长江2号标准模式图表示的是,长江2号分别在引物N54的127、129和131 bp,引物N101的95、100、103、110和118 bp,N146的86和91 bp,引物N151的138、139、142、143、145和146 bp,引物N154的144、146和148 bp,N156的116 bp处检测到核苷酸片段,可鉴定区别于其他品种,这种标准模式图能将毛细管电泳峰图转变成更直观的多态性谱带图,为品种鉴定提供了更简单易操作的方式。

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图210个多花黑麦草材料的标准模式图
-->Fig. 2The standard model pattern of 10 L.multiflorum materials
-->

2.3.2 指纹图谱代码参考陈昌文等^[27]方法,对筛选出来的6个引物扩检测出的位点进行赋值（表7）,采用1—9字符进行赋值,对于等位基因数超过9的引物,采用只考虑其中9个基因位点的方法来进行,优先删除鉴定性差的等位基因位点。根据这些原则,对25对引物扩增的等位基因筛选后,选择了其中42个等位基因位点进行赋值。根据引物扩增峰值的选择和赋值标准,编码时保证每对引物下的编码只有一位数字,并且按照6个引物下的扩增片段大小,先选择位点较小的原则进行赋值,编码了多花黑麦草指纹图谱代码（表8）。编码后,每个材料的DNA指纹图谱代码具有6位数字,代表6个引物上的6个电泳峰。如特高,图谱代码为331233,表示特高在引物N54的131 bp（3）、N101的98 bp（3）、N146的86 bp（1）、N151的138 bp（2）、N154的144 bp（3）和N156的113 bp（3）处均能检测出峰。
Table 7
表7
表7等位基因电泳峰的选择和赋值标准
Table 7The selection and encoded standard of allelic peak

引物 Primer	编码 Code (bp)
引物 Primer	1	2	3	4	5	6	7	8	9
N54	127	129	131	136	138	141	—	—	—
N101	92	95	98	99	100	102	105	110	118
N146	86	88	91	93	97	—	—	—	—
N151	129	138	139	142	143	145	146	151	155
N154	140	142	144	146	148	151	—	—	—
N156	102	112	113	116	118	121	124	—	—

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Table 8
表8
表810个多花黑麦草材料的DNA指纹图谱代码
Table 8DNA fingerprinting codes of 10 L.multiflorum materials

材料 Material	指纹图谱代码 Fingerprinting code	材料 Material	指纹图谱代码 Fingerprinting code
特高 Tetragold	331233	邦德 Abundant	121223
长江2号 Changjiang No.2	121234	杰威 Splendor	442124
赣选1号 Ganxuan No.1	151131	川农1号 Chuannong No.1	231214
阿伯德 Aubade	151213	川农2号 Chuannong No.2	312234
达伯瑞 Double Barrel	141222	LG1	223224

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编码结果表明,6位指纹图谱代码能够完全区分10个多花黑麦草材料,每份材料均具有特异的指纹图谱代码。根据指纹图谱代码,简化多花黑麦草材料的指纹图谱,图3中谱带与表8中的指纹图谱代码完全一致,由图3可知,10个多花黑麦草材料明显具有不同位点检测到等位基因,可明显区别不同材料。

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图310个多花黑麦草材料指纹图谱
-->Fig. 3Fingerprintings of 10 L.multiflorum materials
-->

2.3.3 指纹图谱QR编码利用QrPlant Generator植物二维码生成工具对所有供试材料进行编码,为每份材料构建了一份指纹图谱QR编码（图4）,其中包含了材料名称、材料类型、材料的植物学分类、指纹图谱代码、引物扩增信息^[28]。如扫描特高的QR编码,会获得如下信息：

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图4多花黑麦草指纹图谱QR编码
-->Fig. 4Fingerprinting QR code of L.multiflorum
-->

材料名称Cultivars Name：特高Tetragold;
类型Type：引进品种The introduced varieties;
植物学分类Botanic classification：L. multiflorum.cv. Tetragold;
EST-SSR指纹图谱代码EST-SSR fingerprinting codes：331233;
扩增信息Amplification information：
N54-131-141N101-98-102N146-86-88-91-97N151-138-145-146N154-144-146-148-151N156-113-116-118-121-12。

3 讨论

3.1 EST-SSR标记效果分析

EST-SSR分子标记不仅具有SSR标记共显性、重复性高、多态性高等优点^[31-32],而且通用性也较SSR分子标记高,因此,逐渐成为植物种质遗传多样性分析、系谱分析、品种鉴定及DNA指纹图谱构建中广泛应用的分子标记^[33-34]。本试验根据荧光检测毛细管电泳检测结果,选择了25对EST-SSR引物进行多花黑麦草材料的鉴定。25对引物共检测出127个等位基因,特异等位基因数在0—11个不等,平均每对引物4.00个,PIC变幅为0.484—0.877,Nei氏基因多样性指数变幅为0.159—0.500。同时,引物N101在200对引物中鉴定效率最高,在多花黑麦草遗传多样性、品种鉴定和DNA指纹图谱的构建中具有重要的应用价值。
多花黑麦草品种（系）间存在相似的遗传背景和近缘关系,特别是杂交材料,一般是通过杂交后代连续混合选择或多个品种开放授粉连续混合选择育成的,因此,品系间、品系与亲本间亲缘关系相近,在品种鉴定时难以区分。本试验筛选出的6对引物成功将亲缘关系近的材料区分开,如赣选1号,同时是川农1号（牧杰×赣选1号）和LG1（F₄N×赣选1号）的亲本,在6对引物下的指纹图谱代码分别为151131、231214和223224,证明了引物多态性好且鉴别效率高,在近亲品种的鉴定中也具有品种特异性片段,可形成不同的指纹代码。

3.2 DNA指纹图谱构建分析

DNA指纹图谱是快速鉴别植物品种时的有效工具,效率较DUS鉴定法更加准确快速,错误率更低^[35-36];较物理化学鉴定法和生化鉴定法更具有普遍性,不需要特殊的物理化学反应或者特殊的蛋白质,能在各类植物中普遍应用。DNA指纹图谱构建采用的方法一般有特征位点法^[30]、单引物法^[37]和核心引物组合法^[38]。但由于利用单一引物法获取不同的品种特异性等位基因需要较多引物和更多的供试品种,导致鉴定效率较不同引物组合法更低^[39-40],因此,本试验采用6对引物组合构建了10个多花黑麦草材料的指纹图谱,图谱包括指纹图谱标准模式图、指纹图谱代码和指纹图谱QR编码。虽然指纹图谱标准模式图与指纹图谱代码易于理解,但包含信息量较少;而指纹图谱QR编码信息量更大,可编码该品种的所有相关信息,检索该品种时更方便且全面,也更加有利于多花黑麦草指纹鉴定工作的快速进行。同时配合品种DUS测试,可以更全面的解决生产实际中多花黑麦草品种的鉴定区分问题。本研究通过EST-SSR荧光标记毛细电泳检测法初步建立了多花黑麦草高通量指纹鉴定体系,为多色荧光检测法、种子纯度鉴定、指纹数据库的构建奠定了基础。

4 结论

本研究筛选应用了25对EST-SSR引物,构建了10个多花黑麦草材料的DNA指纹图谱。通过引物多态性和高效性分析表明,荧光引物N101在多花黑麦草材料上多态性高,可直接鉴别本试验中的所有多花黑麦草材料。采用6对引物构建了多花黑麦草指纹图谱,通过标准模式图、图谱代码和图谱QR编码3种方式鉴定了10个多花黑麦草材料,分别构建了唯一的指纹代码和QR编码,建立了基于SSR荧光标记的高通量多花黑麦草指纹鉴定体系。
The authors have declared that no competing interests exist.