块根块茎类作物内生固氮菌分离鉴定、系统发育与促生特性

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本站小编 Free考研考试/2021-12-26

李艳星, 郭平毅, 孙建光. 块根块茎类作物内生固氮菌分离鉴定、系统发育与促生特性[J]. , 2017, 50(1): 104-122 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.010
LI YanXing, GUO PingYi, SUN JianGuang. Isolation, Identification, Phylogeny and Growth Promoting Characteristics of Endophytic Diazotrophs from Tuber and Root Crops[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2017, 50(1): 104-122 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.010

0 引言

【研究意义】胡萝卜、白萝卜、紫甘蓝、马铃薯、山药、莲藕、芋头、红薯、生姜、甜菜等都是常见食才（甜菜是生产蔗糖原料）,作为蔬菜、杂粮或调味品,在人们的日常生活中起着不可或缺的重要作用。从植物学的角度,它们有一个共同特征,都是块根块茎类作物（紫甘蓝为球茎）,而且块根块茎正是人们取食的部分。研究块根块茎类作物内生固氮菌对于加强人们对该类作物的了解,获得固氮菌资源,提高栽培技术,生产安全优质产品具有重要意义。【前人研究进展】植物内生菌（endophytic bactcria）指从经过表面消毒的植物组织器官或植物体内分离出来的对植物本身有益无害的细菌^[1]。现在这个概念有了一些扩大,认为植物内生菌泛指生活史或某个生命阶段生活在健康植物体内,不引起宿主植物外在病症的细菌、真菌或放线菌^[2],但不包括在植物体内定殖,引起寄生植物病害的致病菌,也不包括菌根真菌^[3]。植物内生固氮菌（endophytic diazotrophs）是植物内生菌中的一个主要类群,它们不仅具有固氮作用,还有促进植物生长,提高植物抗病、抗逆等多种功能^[4]。目前,人们在水稻^[5]、玉米^[6]、小麦^[7]、甘蔗^[8]等作物上都发现了内生固氮菌,对于马铃薯内生固氮菌的研究也有报道^[9-10],但对于其他块根块茎类作物的内生固氮菌了解尚少。【本研究切入点】通过农田采集和市场采购两种方式收集块根块茎类作物的块根块茎样品,批量分离、鉴定内生固氮菌,研究块根块茎类作物内生固氮菌的系统发育、促生特性,并探讨块根块茎类作物内生固氮菌的种群特点及其随寄主植物的分布特征。【拟解决的关键问题】明确块根块茎类作物内生固氮菌的系统发育、种群特点、分布特征、促生特性。

1 材料与方法

试验于2014—2015年在中国农业科学院完成。

1.1 样品、试剂、培养基

试验共用到块根块茎类作物样品14份,包括胡萝卜、白萝卜、马铃薯、紫甘蓝、山药、莲藕、芋头、红薯、生姜、甜菜等。其中5份样品采自农田,9份样品购自北京蔬菜市场。样品主要为处于成熟期的作物块根块茎。样品信息详见表1。
Table 1
表1
表1新分离内生固氮菌及其促生特性
Table 1Isolated endophytic diazotrophs and their plant growth promoting properties

菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	拮抗病原真菌 Antagonism^c (%)
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	MLS1	37402	37438
655gz04	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Acinetobacter harbinensis HITLi 7 (KC843488)	98.38	0	0	0	0	0
660gz02	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Arthrobacter arilaitensis Re117 (FQ311875)	99.37	0	3.20±0.44	0	0	0
658gz04	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Arthrobacter bergerei CIP 108036 (AJ609630)	99.35	0	16.86±1.90	0	0	0
657gz01	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Arthrobacter nicotianae DSM 20123 (X80739)	99.32	0	0	0	0	0
664bzr05	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Arthrobacter nicotinovorans DSM 420 (X80743)	100.00	0	0	0	0	0
664gz05	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Arthrobacter nitroguajacolicus G2-1 (AJ512504)	99.35	0	0	0	0	0
651gz03	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (CP000560)	99.93	0	16.13±1.14	63	57	55
663bzr08	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00	0	0	0	0	0
653bzr03	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Bacillus circulans ATCC 4513 (AY724690)	100.00	0	0	58	0	0
659bzr01	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus fengqiuensis NPK15 (KC291653)	99.85	0	17.94±1.00	0	0	0
660bzr13	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Bacillus firmus NCIMB 9366 (X60616)	99.54	0	0	0	0	0
653bzr02	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Bacillus flexus IFO 15715 (AB021185)	100.00	0	27.42±0.79	0	0	0
659gz02	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus halosaccharovorans E33 (HQ433447)	99.77	0.026±0.039	9.58±1.10	0	0	0
655bzr05	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus licheniformis ATCC 14580 (AE017333)	99.93	0	9.23±0.80	0	0	0
660gz09	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Bacillus luciferensis LMG 18422 (AJ419629)	99.63	0	0.81±0.53	0	0	0
663bzr06	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Bacillus marisflavi TF-11 (AF483624)	100.00	0	0	0	0	0
655gz08	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus megaterium IAM 13418 (D16273)	99.85	0	10.58±1.14	0	0	0
651gz08	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus methylotrophicus CBMB205 (EU194897)	100.00	0	13.20±0.79	46	53	53
660bzr03	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Bacillus oceanisediminis H2 (GQ292772)	99.70	0	0	0	0	0
659bzr06	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus safensis FO-36b (ASJD01000027)	99.93	0	14.55±1.06	0	0	0
655bzr07	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus simplex NBRC 15720 (AB363738)	100.00	0	10.22±1.14	0	0	0
654bzr02	块根 Root	红薯/北京市场 Sweet potato/Beijing market	Bacillus sonorensis NBRC 101234 (AYTN01000016)	99.70	0	6.71± 1.07	53	49	53
658gz02	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Bacillus stratosphericus 41KF2a 9 (AJ831841)	100.00	0	0	0	0	0
664bzr03	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Bacillus subterraneus DSM 13966 (FR733689)	99.32	0	0.46±0.46	0	0	0
662bzr12	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Bacillus tequilensis KCTC 13622 (AYTO01000043)	100.00	0	6.48±0.71	57	59	49
660bzr15	块根Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	100.00	0	3.85±0.73	0	0	0
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	拮抗病原真菌 Antagonism^c (%)
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	MLS1	37402	37438
664bzr06	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Bacillus thioparans BMP-1 (DQ371431)	99.47	0	0	0	0	0
660bzr10	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Brevibacillus brevis NBRC 100599 (AP008955)	99.69	0	28.35±1.15	58	55	54
662bzr08	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Brevibacillus nitrificans DA2 (AB507254)	99.85	0	0	0	0	0
655gz07	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00	0	18.12±1.06	0	0	0
664gz01	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Chryseobacterium indoltheticum LMG 4025 (AY468448)	100.00	0	4.78±0.79	0	0	0
660gz07	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Delftia lacustris DSM 21246 (EU888308)	100.00	0	17.28±1.95	0	0	0
651bzr05	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Domibacillus indicus SD111 (KF732820)	98.82	0	0	0	0	0
660bzr14	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Enterobacter ludwigii EN-119 (NR042349)	99.70	0	8.12±0.88	0	0	0
658gz03	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Enterobacter mori LMG 25706 (GL890774)	99.76	0	15.67±1.13	0	0	0
654gz02	块根 Root	红薯/北京市场 Sweet potato/Beijing market	Enterobacter xiangfangensis 10-17 (HF679035)	99.70	13.76±0.99	13.31±1.17	0	0	0
658bzr06	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Fictibacillus barbaricus V2-BIII-A2 (AJ422145)	100.00	0	0	0	0	0
657bzr01	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Fictibacillus enclensis NIO-1003 (JF893461)	99.32	0	0	0	0	0
663bzr05	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Fictibacillus nanhaiensis JSM 082006 (GU477780)	100.00	0	3.67±0.71	0	0	0
664bzr04	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照Purple cabbage/Shandong field	Fictibacillus phosphorivorans Ca7T (JX258924)	99.92	0	2.50±0.88	0	0	0
653gz02	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场Potato/Beijing market	Flavimonas oryzihabitans IAM 1568 (D84004)	99.49	0	5.21±0.63	0	0	0
664gz06	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Flavobacterium oncorhynchi 631-08 (FN669776)	97.70	0	0	0	0	0
660bzr12	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Microbacterium hydrocarbonoxydans DSM16089 (AJ698726)	99.70	0.16±0.06	4.55±0.54	0	0	0
658gz01	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468 (AJ277840)	99.77	0	1.51±1.10	0	0	0
653bzr01	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Micrococcus endophyticus YIM 56238 (EU005372)	99.92	0	0.34±0.27	0	0	0
660bzr17	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Paenibacillus barengoltzii SAFN-016 (AY167814)	98.13	0	0	0	0	0
657bzr06	块茎Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Paenibacillus cineris LMG 18439 (AJ575658)	100.00	0	8.12±1.32	0	0	0
663bzr02	块根Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Paenibacillus glycanilyticus DS-1 (AB042938)	99.92	0	0	0	0	0
655bzr04	块茎Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Paenibacillus lautus NRRL NRS-666 (D78473)	99.70	0	0	0	0	0
659bzr04	块根Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Paenibacillus tundrae A10b (EU558284)	99.85	0	0	0	0	0
653gz03	块茎Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Pantoea agglomerans DSM 3493 (AJ233423)	99.93	0	22.21±0.88	0	0	0
657gz07	块茎Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Pantoea anthophila LMG 2558 (EF688010)	100.00	0	28.76±0.79	0	0	0
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	拮抗病原真菌 Antagonism^c (%)
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	MLS1	37402	37438
657gz04	块茎Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Pantoea dispersa LMG 2603 (DQ504305)	100.00	0	3.98±0.88	0	0	0
656gz05	块茎 Tuber	莲藕/北京市场 Lotus/Beijing market	Pantoea rodasii LMG 26273 (JF295053)	98.78	0	23.61±2.43	0	0	0
664gz03	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Pseudomonas azotoformans IAM1603 (D84009)	99.76	0	18.35±0.80	0	0	0
663gz06	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Pseudomonas beteli ATCC 19861 (AB021406)	99.62	0	0	0	0	0
653gz06	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Pseudomonas brassicacearum ATCC 49054 (EU391388)	99.85	0.11±0.01	9.23±0.98	0	0	0
663gz02	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Pseudomonas geniculata ATCC 19374 (AB021404)	99.92	7.93±0.16	28.99±1.03	0	0	0
657gz05	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Pseudomonas hunanensis LV (JX545210)	99.92	0	0	0	0	0
653gz07	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Pseudomonas koreensis Ps 9-14 (AF468452)	99.85	0	20.63±0.76	0	0	0
660gz01	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Pseudomonas parafulva NBRC 16636 (BBIU01000051)	100.00	0	10.22±0.97	0	0	0
652gz02	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Pseudomonas seleniipraecipitans CA5 (FJ422810)	99.92	0	8.53±0.80	0	0	0
658gz06	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Pseudomonas simiae OLi (AJ936933)	100.00	0	0	0	0	0
653gz04	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Pseudomonas syringae KCTC 12500 (KI657453)	100.00	4.32±0.07	8.76±0.73	0	0	0
656gz06	块茎 Tuber	莲藕/北京市场 Lotus/Beijing market	Rahnella aquatilis CIP 78.65 (CP003244)	98.69	0	8.47±1.36	0	0	0
660gz08	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Rhizobium leguminosarum USDA 2370 (JH719379)	98.44	0	8.32±0.80	0	0	0
660gz03	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Rhizobium massiliae 90A (AF531767)	100.00	0	7.26±0.80	0	0	0
651gz02	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Rhizobium radiobacter ATCC 19358 (AJ389904)	100.00	0	11.74±1.14	0	0	0
664gz04	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Sphingobacterium faecium DSM 11690 (AJ438176)	99.31	0	0	0	0	0
657gz10	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Staphylococcus sciuri subsp. sciuri DSM 20345 (AJ421446)	99.92	0	0	0	0	0
652gz05	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Stenotrophomonas rhizophila DSM 14405 (CP007597)	99.64	0	0	0	0	0
658gz05	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Variovorax paradoxus IAM 12373 (D88006)	99.41	8.43± 0.10	0	0	0	0
665bzr02	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Bacillus litoralis SW-211 (AY608605)	99.08	0	1.27±0.27	52	0	0
665bzr05	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Bacillus oceanisediminis H2 (GQ292772)	100.00	0	0.00	47	48	0
665bzr07	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Bacillus idriensis SMC 4352-2 (AY904033)	100.00	0	1.22±0.44	45	0	0
665gz03	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Enterobacter asburiae JCM 6051 (AB004744)	99.48	0	13.03±1.23	43	0	0
665gz04	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Sphingobacterium canadense CR11 (AY787820)	99.78	0	2.56±0.18	0	0	0
665gz06	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Chryseobacterium lactis NCTC 11390 (JX100821)	99.07	0	6.59±0.79	0	0	0
665gz09	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Citrobacter youngae CECT5335 (AJ564736)	98.94	0	9.52±0.97	41	0	0
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	拮抗病原真菌 Antagonism^c (%)
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	MLS1	37402	37438
651bzr01	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus tequilensis KCTC13622 (AYTO01000043)	100.00
651bzr02	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100
651bzr03	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.85
651bzr04	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Fictibacillus barbaricus V2-BIII-A2 (AJ422145)	100.00
651bzr06	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus oceanisediminis H2 (GQ292772)	99.56
651bzr07	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
651bzr08	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus fengqiuensis NPK15 (KC291653)	99.85
651bzr09	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus fengqiuensis NPK15 (KC291653)	99.85
651gz01	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (CP000560)	99.93
651gz04	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus methylotrophicus KACC 13105 (JTKJ01000077)	99.93
651gz05	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Rhizobium radiobacter ATCC 19358 (AJ389904)	100.00
651gz06	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (CP000560)	99.93
651gz07	块茎 Tuber	铁棍山药/河南焦作 Yam Tiegun/Henan field	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	99.93
652bzr01	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Brevibacillus formosus DSM 9885 (LDCNN0100015)	99.77
652bzr02	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
652bzr03	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
652bzr04	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
652gz01	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Pseudomonas koreensis Ps 9-14 (AF468452)	99.78
652gz03	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Chryseobacterium indoltheticum LMG 4025 (AY468448)	100.00
652gz04	块根 Root	胡萝卜/北京市场 Carrot/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
653bzr04	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
653bzr05	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Bacillus circulans ATCC 4513 (AY724690)	100.00
653bzr06	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Bacillus flexus IFO 15715 (AB021185)	100.00
653gz05	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Pseudomonas koreensis Ps 9-14 (AF468452)	99.70
653gz08	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Arthrobacter nicotianae DSM 20123 (X80739)	99.18
653gz09	块茎 Tuber	马铃薯/北京市场 Potato/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
654bzr01	块根 Root	红薯/北京市场 Sweet potato/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	99.93
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	拮抗病原真菌 Antagonism^c (%)
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	MLS1	37402	37438
654gz01	块根 Root	红薯/北京市场 Sweet potato/Beijing market	Pantoea dispersa LMG 2603 (DQ504305)	100.00
655bzr01	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
655bzr02	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	99.85
655bzr03	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
655bzr06	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
655bzr08	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
655bzr09	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
655bzr10	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
655gz01	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Pseudomonas brassicacearum ATCC 49054 (EU391388)	99.78
655gz02	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Acinetobacter harbinensis HITLI 7 (JXBK01000001)	98.22
655gz03	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Pseudomonas brassicacearum ATCC 49054 (EU391388)	99.66
655gz05	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
655gz06	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
655gz09	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Pseudomonas brassicacearum ATCC 49054 (EU391388)	99.77
655gz10	块茎 Tuber	白皮山药/北京市场 White yam/Beijing market	Pseudomonas brassicacearum ATCC 49054 (EU391388)	99.78
656gz02	块茎 Tuber	莲藕/北京市场 Lotus/Beijing market	Pantoea rodasii LMG 26273 (JF295053)	98.73
656gz03	块茎 Tuber	莲藕/北京市场 Lotus/Beijing market	Rahnella aquatilis CIP 78.65 (Cp003244)	98.68
656gz04	块茎 Tuber	莲藕/北京市场 Lotus/Beijing market	Acinetobacter harbinensis HITLi 7 (JXBK01000001)	98.21
656gz07	块茎 Tuber	莲藕/北京市场 Lotus/Beijing market	Pseudomonas simiae OLi (AJ936933)	100.00
656gz09	块茎 Tuber	莲藕/北京市场 Lotus/Beijing market	Pseudomonas simiae OLi (AJ936933)	99.70
656gz10	块茎 Tuber	莲藕/北京市场 Lotus/Beijing market	Pantoea rodasii LMG 26273 (JF295053)	98.77
657bzr02	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.85
657bzr03	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Bacillus licheniformis ATCC 14580 (AE017333)	99.92
657bzr04	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Fictibacillus enclensis NIO-1003 (JF893461)	99.32
657bzr05	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Fictibacillus enclensis NIO-1003 (JF893461)	99.27
657bzr07	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Fictibacillus enclensis NIO-1003 (JF893461)	99.27
657bzr08	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.85
657bzr09	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Bacillus licheniformis ATCC 14580 (AE017333)	99.70
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	拮抗病原真菌 Antagonism^c (%)
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	MLS1	37402	37438
657bzr10	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.58
657gz02	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Acinetobacter harbinensis HITLi 7 (JXBK01000001)	98.36
657gz03	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Pseudomonas hunanensis LV (JX545210)	99.85
657gz06	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
657gz08	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Pantoea dispersa LMG 2603 (DQ504305)	100.00
657gz09	块茎 Tuber	芋头/北京市场 Taro/Beijing market	Pantoea dispersa LMG 2603 (DQ504305)	99.93
658bzr01	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Bacillus fengqiuensis NPK15 (KC291653)	99.85
658bzr02	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Bacillus oceanisediminis H2 (GQ292772)	99.56
658bzr03	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
658bzr04	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Bacillus tequilensis KCTC 13622 (AYTO01000043)	100.00
658bzr05	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Fictibacillus barbaricus V2-BIII-A2 (AJ422145)	99.92
658bzr07	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Bacillus fengqiuensis NPK15 (KC291653)	99.85
658gz07	块茎 Tuber	生姜/北京市场 Ginger/Beijing market	Enterobacter ludwigii EN-119 (NR042349)	99.70
659bzr03	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus tequilensis KCTC 13622 (AYTO01000043)	99.92
659bzr05	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus licheniformis ATCC 14580 (AE017333)	99.85
659bzr07	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.85
659bzr08	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
659bzr10	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	99.62
659gz01	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.85
659gz03	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.85
659gz04	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
659gz05	块根 Root	红皮圆萝卜/北京市场 Red radish/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.54
660bzr01	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Bacillus tequilensis KCTC 13622 (AYTO01000043)	99.92
660bzr02	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Bacillus thaonhiensis NHI-38 (JQ796719)	99.85
660bzr05	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Bacillus tequilensis KCTC 13622 (AYTO01000043)	99.93
660bzr07	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Enterobacter ludwigii EN-119 (NR042349)	99.69
660bzr08	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Arthrobacter bergerei CIP 108036 (AJ609630)	99.30
660bzr11	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Pseudomonas koreensis Ps 9-14 (AF468452)	99.77
660bzr16	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Bacillus licheniformis ATCC 14580 (AE017333)	99.85
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	拮抗病原真菌 Antagonism^c (%)
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	MLS1	37402	37438
660gz04	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Pseudomonas azotoformans IAM1603 (D84009)	99.70
660gz05	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Pseudomonas parafulva NBRC 16636 (BBIU01000051)	100.00
660gz06	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Arthrobacter bergerei CIP 108036 (AJ609630)	99.31
660gz10	块根 Root	绿皮长萝卜/北京市场 Green radish/Beijing market	Chryseobacterium indoltheticum LMG 4025 (AY468448)	100.00
662bzr02	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Bacillus tequilensis KCTC 13622 (AYTO01000043)	100.00
662bzr03	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Fictibacillus enclensis NIO-1003 (JF893461)	99.31
662bzr04	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Bacillus methylotrophicus KACC 13105 (JTKJ01000077)	99.51
662bzr05	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Bacillus thioparans BMP-1 (DQ371431)	99.47
662bzr06	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Paenibacillus cineris LMG 18439 (AJ575658)	99.92
662bzr07	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Fictibacillus enclensis NIO-1003 (JF893461)	99.16
662bzr09	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Bacillus tequilensis KCTC 13622 (AYTO01000043)	100.00
662bzr10	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Brevibacillus nitrificans DA2 (AB507254)	99.85
662bzr11	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Bacillus tequilensis KCTC 13622 (AYTO01000043)	99.92
662gz01	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Pseudomonas geniculata ATCC 19374 (AB021404)	99.85
662gz02	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Rhizobium radiobacter ATCC 19358 (AJ389904)	99.61
662gz03	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Pseudomonas geniculata ATCC 19374 (AB021404)	99.25
662gz04	块根 Root	白萝卜/山东日照 Radish/Shandong field	Stenotrophomonas rhizophila DSM 14405 (CP007597)	99.62
663bzr01	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
663bzr03	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Bacillus thioparans BMP-1 (DQ371431)	99.30
663bzr04	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
663bzr07	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Bacillus marisflavi TF-11 (AF483624)	100.00
663gz01	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Pseudomonas beteli ATCC 19861 (AB021406)	99.54
663gz04	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Pseudomonas azotoformans IAM1603 (D84009)	99.62
663gz05	块根 Root	胡萝卜/山东日照 Carrot/Shandong field	Pseudomonas azotoformans IAM1603 (D84009)	99.54
664bzr01	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Brevibacillus brevis NBRC 100599 (AP008955)	99.22
664bzr02	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Fictibacillus enclensis NIO-1003 (JF893461)	99.16
664gz02	球茎 Bulb	紫色甘蓝/山东日照 Purple cabbage/Shandong field	Arthrobacter bergerei CIP 108036 (AJ609630)	99.16
665bzr01	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
665bzr03	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Fictibacillus barbaricus V2-BIII-A2 (AJ422145)	99.71
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	拮抗病原真菌 Antagonism^c (%)
菌株编号 Strain number	分离部位 Isolate position	样品/来源 Sample/Source	最大相似性模式种 Max ident type strain (accession)	相似性 Similarity (%)	产ACC脱氨酶 ACC deaminase^a	产吲哚乙酸 IAA^b	MLS1	37402	37438
665bzr04	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
665bzr06	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Fictibacillus phosphorivorans Ca7T (JX258924)	99.40
665bzr08	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
665bzr09	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Fictibacillus barbaricus V2-BIII-A2 (AJ422145)	99.70
665bzr10	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Fictibacillus phosphorivorans Ca7T (JX258924)	99.22
665bzr11	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00
665bzr12	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Fictibacillus barbaricus V2-BIII-A2 (AJ422145)	99.78
665bzr13	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Bacillus oceanisediminis H2 (GQ292772)	99.70
665gz01	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Chryseobacterium indoltheticum LMG 4025 (AY468448)	100.00
665gz02	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Stenotrophomonas rhizophila DSM 14405 (CP007597)	99.64
665gz05	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Enterobacter ludwigii EN-119 (NR042349)	99.34
665gz07	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Pseudomonas hunanensis LV (JX545210)	99.71
665gz08	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Sphingobacterium canadense CR11 (AY787820)	99.78
665gz10	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Pantoea rodasii LMG 26273 (JF295053)	98.80
665gz11	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Stenotrophomonas rhizophila DSM 14405 (CP007597)	99.71
665gz12	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Bacillus aryabhattai B8W22 (EF114313)	100.00
665gz13	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Flavimonas oryzihabitans IAM 1568 (D84004)	99.49
665gz14	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Enterobacter mori LMG 25706 (GL890774)	99.71
665gz15	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Enterobacter asburiae JCM 6051 (AB004744)	99.47
665gz16	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Chryseobacterium indoltheticum LMG 4025 (AY468448)	100.00
665gz17	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Arthrobacter nitroguajacolicus G2-1 (AJ512504)	99.61
665gz18	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Arthrobacter nicotianae DSM 20123 (X80739)	99.31
665gz19	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Enterobacter mori LMG 25706 (GL890774)	99.21
665gz20	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Flavimonas oryzihabitans IAM 1568 (D84004)	99.49
665gz21	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Pseudomonas brassicacearum ATCC 49054 (EU391388)	99.77
665gz22	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Enterobacter ludwigii EN-119 (NR042349)	99.77
665gz23	块根 Root	甜菜/内蒙古集宁 Beet/Inner Mongolia field	Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (AM747813)	100.00

^a ACC脱氨酶 ACC: 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase activity (µmol α-ketobutyrate·mg^-1 protein·h^-1);^b 吲哚乙酸 IAA: indole acetic acid production (µg·mL^-1);^c 拮抗病原真菌Antagonism: MLS1= Fusarium xysporum MLS1; 37402= Fusarium sporotrichioides ACCC 37402; 37438= Fusarium xysporum ACCC 37438

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病原真菌靶标菌株拟枝镰孢（Fusarium sporotrichioides）ACCC37402和尖镰孢（Fusarium xysporum）ACCC37438由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所邓晖提供,尖镰孢MLS1由笔者实验室提供。试剂主要购自北京化学试剂公司和Sigma公司。
多碳源低氮培养基（CCM）^[11]：溶液Ⅰ：KH₂PO₄ 0.2 g,NaCl 0.1 g,K₂HPO₄ 0.8 g,Na₂Fe EDTA 28 mg,钼酸钠25 mg,酵母浸膏100 mg,甘露醇5 g,蔗糖5 g,乳酸钠0.5 mL,蒸馏水900 mL。溶液Ⅱ：MgSO₄·7H₂O 0.2 g,CaCl₂·2H₂O 0.06 g,蒸馏水100 mL。将溶液Ⅰ、Ⅱ分别灭菌,冷却至50℃左右混合,加入生物素（5 µg·L^-1）和维生素（10 µg·L^-1）各0.5 mL。无氮培养基^[12]：蔗糖10 g,NaCl 0.12 g,K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g,CaCO₃1 g,MgSO₄·7H₂O 0.2 g,蒸馏水1 L,pH 7.2。LB培养基：酵母膏 5 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 10.0 g,蒸馏水1 L,pH 7.0。

1.2 内生固氮菌分离

采用上述多碳源低氮培养基和无氮培养基,将植物块根块茎样品表面消毒后,切取内部组织块进行分离培养内生细菌,方法参考文献^[13]。

1.3 菌株16S rRNA序列测定与初步鉴定

细菌分离物16S rRNA基因扩增方法同文献^[14],序列测定委托北京博迈德生物技术公司完成,基于16S rRNA基因序列的初步鉴定采用EzTaxon和NCBI数据库在线比对完成。

1.4 菌株nifH基因检测与序列测定

菌株固氮酶nifH基因扩增方法同文献^[15],序列测定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.5 内生固氮菌系统发育分析

在上述16S rRNA基因序列测定和nifH基因检测的基础上,采用Mega软件分析块根块茎类作物内生固氮菌的系统发育^[16]。

1.6 菌株促生特性

测定菌株产生ACC脱氨酶（1-aminocyclopropane- 1-carboxylic acid (ACC) deaminase）、产生植物激素IAA（indole acetic acid）以及拮抗病原真菌的能力。
ACC脱氨酶、IAA以及拮抗病原真菌测定方法同前述^[7,15,17]。拮抗病原真菌定义抑制率（%）=（对照半径r₀-对峙培养病原真菌菌落半径r₁）／对照半径r₀×100。

2 结果

2.1 块根块茎类作物内生固氮菌分离、nifH基因检测及基于16S rRNA基因序列鉴定

从14个块根块茎类作物样品的块根、块茎中共分离到内生细菌219株,全部菌株检测到了固氮酶基因nifH,从而确认这些细菌是固氮菌。经过16S rRNA基因序列分析比对初步确定了菌株的分类地位。新分离菌株的编号、来源及其最大相似性模式种如表1所示。

2.2 块根块茎类作物内生固氮菌的系统发育分析

16S rRNA基因序列比对结果显示,分离到的219株块根块茎类作物内生固氮菌与已知模式种的最大相似性均在98%以上（42号菌株为97.70%）,说明新分离内生固氮菌的科学分类地位比较明确。按照16S rRNA基因序列相似性,219株块根块茎类作物内生固氮菌在系统发育地位上属于24属79种。这24属分别为Acinetobacter、Arthrobacter、Bacillus、Brevibacillus、Brevibacterium、Chryseobacterium、Citrobacter、Delftia、Domibacillus、Enterobacter、Fictibacillus、Flavimonas、Flavobacterium、Microbacterium、Micrococcus、 Paenibacillus、Pantoea、Pseudomonas、Rahnella、Rhizobium、Sphingobacterium、Staphylococcus、Stenotrophomonas、Variovorax。
以79株最大相似性模式种作为代表菌株进行的系统发育分析结果如图1所示。总的来看,新分离的219株块根块茎类作物内生固氮菌在系统发育关系上可以分为5群：第1群包括7个属,分别是Bacillus（其中包含23个种代表77菌株）、Brevibacterium（其中包含1个种代表17菌株）、Fictibacillus（其中包含4个种代表17菌株）、Paenibacillus（其中包含5个种代表6菌株）、Brevibacillus（其中包含3个种代表5菌株）、Domibacillus（其中包含1个种代表1菌株）、Staphylococcus（其中包含1个种代表1菌株）,共计38个种,代表124菌株,分别占分类地位种数和新分离菌株总数的48.10%和56.62%。第2群包括3个属,Microbacterium（其中包含2个种代表2菌株）、Arthrobacter（其中包含5个种代表11菌株）、Micrococcus（其中包含1个种代表1菌株）,共计8个种,代表14菌株,分别占分类地位种数和新分离菌株总数的10.13%和6.39%。第3群只有1个属Rhizobium,包括3个种,代表5菌株,分别占分类地位种数和新分离菌株总数的3.80%和2.28%。第4群包括10个属,Pseudomonas（其中包含10个种代表29菌株）、Stenotrophomonas（其中包含1个种代表4菌株）、Delftia（其中包含1个种代表1菌株）、Variovorax（其中包含1个种代表1菌株）、Flavimonas（其中包含1个种代表3菌株）、Acinetobacter（其中包含1个种代表4菌株）、Rahnella（其中包含1个种代表2菌株）、Pantoea（其中包含4个种代表10菌株）、Citrobacter（其中包含1个种代表1菌株）、Enterobacter（其中包含4个种代表11菌株）,共计25个种,代表66菌株,分别占分类地位种数和新分离菌株总数的31.65%和30.14%。第5群包括3个属,Sphingobacterium（其中包含2个种代表3菌株）、Flavobacterium（其中包含1个种代表1菌株）、Chryseobacterium（其中包含2个种代表6菌株）,共计5个种,代表10菌株,分别占分类地位种数和新分离菌株总数的6.33%和4.57%。

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图1新分离219株块根块茎类作物内生固氮菌系统发育树图中种名后括号中的数字表示新分离菌株在分类地位上属于该种的菌株数
-->Fig. 1Phylogenetic tree of 219 endophytic diazotrophs from tuber and root cropsThe number in the parentheses behind the species name meant the number of newly isolated strains which belonged to this species
-->

2.3 块根块茎类作物内生固氮菌的分类地位及其随寄主植物分布特点

列表分析了新分离的219株块根块茎类作物内生固氮菌的分类地位及其随寄主植物的分布（表2）,发现如下特点：（1）从菌株分类地位来看,Bacillus属菌株最多,有77株,占分离菌株总数的35.16%;Pseudomonas属居第2位,有29株,占分离菌株总数的13.24%;二者合计有106株,占新分离菌株总数的48.40%;（2）包含新分离菌株较多的属Bacillus和Pseudomonas,也是包含细菌种数较多的属,如芽孢杆菌属（Bacillus）包括23个种,分别是Ba. amyloliquefaciens、Ba. aryabhattai、Ba. circulans、Ba. fengqiuensis、Ba. firmus、Ba. flexus、Ba. halosaccharovorans、Ba. idriensis、Ba. licheniformis、Ba. litoralis、Ba. luciferensis、Ba. marisflavi、Ba. megaterium、Ba. methylotrophicus、Ba. oceanisediminis、Ba. safensis、Ba. simplex、Ba. sonorensis、Ba. stratosphericus、Ba. subterraneus、Ba. tequilensis、Ba. thaonhiensis、Ba. thioparans;假单胞菌属（Pseudomonas）包括10个种,分别是Ps. azotoformans、Ps. beteli、Ps. brassicacearum、Ps. geniculata、Ps. hunanensis、Ps. koreensis、Ps. parafulva、Ps. seleniipraecipitans、Ps. simiae、Ps. syringae;这在一定程度上证明了新分离菌株在分类地位上的广泛性和对寄主植物的代表性;（3）新分离块根块茎类作物内生固氮菌在寄主植物的分布上具有广泛性,如分类地位属于Bacillus的77菌株分布在除莲藕之外的其他13个样品中,分类地位属于Pseudomonas的29菌株分布在除铁棍山药、红薯、红皮圆萝卜之外的其他11个样品中,分布相对均匀;（4）从寄主植物来看,分离到菌株最多的是665号样品甜菜,分离到37菌株,占新分离菌株总数的16.89%,在分类地位是分属于12属21种,分布广泛;分离到菌株最少的样品是红薯,只有4株菌。
Table 2
表2
表2新分离内生固氮菌随寄主植物分布特点
Table 2Relationships between taxonomic position of isolated strains and their host plants

分类地位（属） Taxonomic position (Genus)	651 铁棍山药 Yam Tiegun	652 胡萝卜 Carrot	653 马铃薯 Potato	654 红薯 Sweet potato	655白皮山药 White yam	656 莲藕 Lotus	657 芋头 Taro	658 生姜 Ginger	659红皮圆萝卜 Red radish	660绿皮长萝卜 Green radish	662 白萝卜 Radish	663 胡萝卜 Carrot	664 紫色甘蓝 Purple cabbage	665 甜菜 Beet	合计 Total	百分比Percentage (%)
Acinetobacter (1)					2	1	1								4	1.83
Arthrobacter (5)			1				1	1		3			3	2	11	5.02
Bacillus (23)	10	1	4	2	7		6	5	11	8	6	6	2	9	77	35.16
Brevibacillus (3)		1								1	2		1		5	2.28
Brevibacterium (1)	3	3	2		4			1	1					3	17	7.76
Chryseobacterium (2)		1								1			1	3	6	2.74
Citrobacter (1)														1	1	0.46
Delftia (1)										1					1	0.46
Domibacillus (1)	1														1	0.46
Enterobacter (4)				1				2		2				6	11	5.02
Fictibacillus (4)	1						4	2			2	1	2	5	17	7.76
Flavimonas (1)			1											2	3	1.37
Flavobacterium (1)													1		1	0.46
Microbacterium (2)								1		1					2	0.91
Micrococcus (1)			1												1	0.46
Paenibacillus (5)					1		1		1	1	1	1			6	2.74
Pantoea (4)			1	1		3	4							1	10	4.57
Pseudomonas (10)		2	4		5	2	2	1		4	2	5	1	1	29	13.24
Rahnella (1)						2									2	0.91
Rhizobium (3)	2									2	1				5	2.28
Sphingobacterium (2)													1	2	3	1.37
Staphylococcus (1)							1								1	0.46
Stenotrophomonas (1)		1									1			2	4	1.83
Variovorax (1)								1							1	0.46
合计 Total	17	9	14	4	19	8	20	14	13	24	15	13	12	37	219	100.00
百分比Percentage (%)	7.76	4.11	6.39	1.83	8.68	3.65	9.13	6.39	5.94	10.96	6.85	5.94	5.48	16.89	100.00

The number in the parentheses behind the genus name meant the number of species including in this genus属名后括号中的数字表示该属的种数

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2.4 菌株的促生特性

由于分离到的块根块茎类作物内生固氮菌共计219株,全部测定工作量较大,因此选取了79株代表菌株进行了促生特性研究（表1）。结果显示,其中有7株菌检测到了ACC脱氨酶活性,占被测菌株的8.86%,ACC脱氨酶活性为0.026—13.76 µmol α-丁酮酸·mg^-1蛋白·h^-1。51株菌检测到了产IAA,占被测菌株的64.56%,检测到的IAA浓度为0.34—28.99 µg·mL^-1。
拮抗试验显示有11株菌拮抗病原真菌Fusarium xysporum MLS1,抑菌率为41%—63%;6株菌拮抗病原真菌Fusarium sporotrichioides ACCC37402,抑菌率为48%—59%;5株菌拮抗病原真菌Fusarium xysporum ACCC37438,抑菌率为49%—55%。合计有5—11株菌对靶标真菌具有抑制作用,占被测菌株的6.33%—13.92%。菌株651gz03、651gz08、654bzr02、662bzr12和660bzr10 同时对3株靶标真菌具有抑制作用,有较好的应用前景。

2.5 新分离块根块茎类作物内生固氮菌与文献报道其他植物内生固氮菌的比较

笔者尝试对照前人的工作,在种水平上分析菌株的系统发育地位与寄主植物的关系。将219株新分离块根块茎内生固氮菌所属的79种列表,统计每种所含菌株数,就会发现除了Bacillus aryabhattai、Bacillus tequilensis、Bacillus thaonhiensis、Brevibacterium frigoritolerans 4个种所含菌株数相对较多,合计53株,占新分离菌株总数24.20%之外,其他75种代表了166株新分离菌株,平均每种代表2.2株。这些结果显示了块根块茎类作物内生固氮菌极其丰富的种群多样性（表3）^[18-20]。
Table 3
表3
表3新分离块根块茎类作物内生固氮菌与文献报道其他植物内生固氮菌的比较
Table 3Comparison of isolated strains with reported endophytic diazotrophs

菌株分类地位（种） Taxonomic position (species)	块根块茎作物^a Tuber and root crops	其他植物^b Other plants
1.1 Acinetobacter harbinensis	4
2.1 Arthrobacter arilaitensis	1
2.2 Arthrobacter bergerei	4
2.3 Arthrobacter nicotianae	3
2.4 Arthrobacter nicotinovorans	1
2.5 Arthrobacter nitroguajacolicus	2	+ (13)
3.1 Bacillus amyloliquefaciens	1	+ (13,18)
3.2 Bacillus aryabhattai	17	+ (13,19)
3.3 Bacillus circulans	2
3.4 Bacillus fengqiuensis	5
3.5 Bacillus firmus	1
3.6 Bacillus flexus	2
3.7 Bacillus halosaccharovorans	1
3.8 Bacillus idriensis	1
3.9 Bacillus licheniformis	5
3.10 Bacillus litoralis	1
3.11 Bacillus luciferensis	1
3.12 Bacillus marisflavi	2	+ (13)
3.13 Bacillus megaterium	1	+ (19)
3.14 Bacillus methylotrophicus	5
3.15 Bacillus oceanisediminis	5
3.16 Bacillus safensis	1	+ (13)
3.17 Bacillus simplex	1	+ (18)
3.18 Bacillus sonorensis	1
3.19 Bacillus stratosphericus	1
3.20 Bacillus subterraneus	1
3.21 Bacillus tequilensis	9	+ (13)
3.22 Bacillus thaonhiensis	10
3.23 Bacillus thioparans	3
4.1 Brevibacillus brevis	2
4.2 Brevibacillus formosus	1
4.3 Brevibacillus nitrificans	2
5.1 Brevibacterium frigoritolerans	17	+ (13)
6.1 Chryseobacterium indoltheticum	5
6.2 Chryseobacterium lactis	1
7.1 Citrobacter youngae	1
8.1 Delftia lacustris	1
9.1 Domibacillus indicus	1
菌株分类地位（种） Taxonomic position (species)	块根块茎作物^a Tuber and root crops	其他植物^b Other plants
10.1 Enterobacter asburiae	2
10.2 Enterobacter ludwigii	5	+ (13)
10.3 Enterobacter mori	3
10.4 Enterobacter xiangfangensis	1
11.1 Fictibacillus barbaricus	6
11.2 Fictibacillus enclensis	7
11.3 Fictibacillus nanhaiensis	1
11.4 Fictibacillus phosphorivorans	3
12.1 Flavimonas oryzihabitans	3
13.1 Flavobacterium oncorhynchi	1
14.1 Microbacterium hydrocarbonoxydans	1
14.2 Microbacterium phyllosphaerae	1	+ (13)
15.1 Micrococcus endophyticus	1
16.1 Paenibacillus barengoltzii	1
16.2 Paenibacillus cineris	2
16.3 Paenibacillus glycanilyticus	1
16.4 Paenibacillus lautus	1
16.5 Paenibacillus tundrae	1
17.1 Pantoea agglomerans	1	+ (20)
17.2 Pantoea anthophila	1
17.3 Pantoea dispersa	4	+ (18)
17.4 Pantoea rodasii	4
18.1 Pseudomonas azotoformans	4	+ (18)
18.2 Pseudomonas beteli	2
18.3 Pseudomonas brassicacearum	6
18.4 Pseudomonas geniculata	3
18.5 Pseudomonas hunanensis	3
18.6 Pseudomonas koreensis	4
18.7 Pseudomonas parafulva	2
18.8 Pseudomonas seleniipraecipitans	1
18.9 Pseudomonas simiae	3
18.10 Pseudomonas syringae	1
19.1 Rahnella aquatilis	2
20.1 Rhizobium leguminosarum	1
20.2 Rhizobium massiliae	1	+ (13)
20.3 Rhizobium radiobacter	3	+ (13)
21.1 Sphingobacterium canadense	2
21.2 Sphingobacterium faecium	1
22.1 Staphylococcus sciuri	1
23.1 Stenotrophomonas rhizophila	4	+ (18)
24.1 Variovorax paradoxus	1	+ (13)
合计（株）Total	219

^a本文工作,表中数字表示新分离到的分类地位属于该种的菌株数This work. The number in table meant the number of newly isolated strains which belonged to this species;^b文献数据。表中“+”号表示该种有过内生固氮菌报道,括号中数字为参考文献编号Data from references. “+” meant this species had been reported as endophytic diazotroph. The number in parenthese meant corresponding reference

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3 讨论

尽管地球上几乎所有的植物都有内生细菌栖息其中^[21],但当试验结果展示出丰富多样的微生物种群时,我们仍然为块根块茎类作物具有的内生固氮菌多样性感到惊奇。
本研究从14个块根块茎样品分离到的219株内生固氮菌在系统发育地位上属于24个属79个种,从目前检索到的文献资料来看,如此丰富的种群多样性在以往报道过的植物内生固氮菌中未曾有过。以上述79种为参照菌群,查阅文献结果显示,虽然关于植物内生固氮菌的研究报道很多,但只有很少文献能够与此对应,只找到18种与之相同的种群有过作为植物内生固氮菌的记载。此外,一些研究较多的植物内生固氮菌,如Azospirillum^[22]、Herbaspirillum^[23]、Burkholderia^[24-25]、Klebsiella^[26]、Acetobacter^[27]、Gluconacetobacter^[28]、Serratia^[29]、Azoarcus^[30]都没有出现在表3中。原因可能有下列几个方面：一是作为作物内生固氮菌资源研究,这些工作已经处于研究领域的前沿,研究报道相对较少;二是块根块茎类作物内生固氮菌存在自身的种群特异性,在其他植物内生固氮菌中没有出现;三是研究方法的差异导致结果不同,如基于微生物培养技术的研究方法得到的信息只能是样品中真实微生物组成的一小部分。但是,即使考虑到所有这些因素,试验结果仍然显示了块根块茎类作物内生固氮菌具有独有的种群特异性。
本文共用到块根块茎样品14个,涉及胡萝卜、白萝卜、马铃薯、紫甘蓝、山药、莲藕、芋头、红薯、生姜、甜菜10种作物。其中5份样品采自农田,9份样品采自蔬菜市场。但无论来自农田的新鲜样品,还是来自蔬菜市场的贮存样品,每个样品都分离到了内生固氮菌,从4株到37株不等（表2）。分离菌株最少的是红薯,得到4株菌,分类地位分别为Bacillus aryabhattai、Bacillus sonorensis、Enterobacter xiangfangensis、Pantoea dispersa。这些结果说明,正常生长的作物块根块茎中普遍存在大量固氮细菌。另一方面,由于上述作物块根块茎是人们食用多年的常见食材,这从侧面印证了内生固氮菌对于人畜的安全性。
另一个值得讨论的结果是内生固氮菌的促生特性。广义的微生物对植物的促生特性定义不严格,包含内容较多,比如提供营养（固氮、溶磷、解钾、矿化有机质等）,促进生长（分泌植物激素IAA^[31]等）,抑制病害（拮抗病原真菌,营造微生态环境等）,提高抗逆（产生ACC脱氨酶^[32],缓解胁迫^[33],抗寒抗旱抗涝等）等。本研究新分离菌株中8.86%菌株检测到了ACC脱氨酶活性,64.56%菌株检测到产植物激素IAA,6.33%—13.92%菌株拮抗病原真菌,这些结果表明作物内生固氮菌中具有促生特性的菌株比例远高于其他环境。特别是菌株651gz03、651gz08、654bzr02、662bzr12和660bzr10同时抑制3株靶标真菌,值得进一步开发研究。

4 结论

在正常生长的块根块茎类作物的块根块茎内栖息着大量内生固氮菌;块根块茎类作物内生固氮菌在科学分类地位上分布广泛,达到24属79种,显示出巨大的生物多样性;Bacillus和Pseudomonas是块根块茎类作物内生固氮菌优势种群;大约10%—60%的块根块茎类作物内生固氮菌显示出产生ACC脱氨酶、产生植物激素IAA、拮抗病原真菌等促进植物生长特性,这可能是内生固氮菌有益于植物生长的内在原因。
The authors have declared that no competing interests exist.