0 引言
【研究意义】中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）是中国特有的蜂种资源,在山区广泛分布,对生态环境的平衡起着至关重要的作用[1]。但自从中国引进西方蜜蜂（Apis mellifera）以来,中蜂种群数量和分布区域急剧下降[2],因此开展中蜂保护研究是亟需进行的重要工作。在蜂群中,蜂王是唯一具有完整生殖能力的雌性蜂,专职产卵,是蜂群饲养的首要因素。目前在中蜂养殖生产中,每年需定期更换蜂王,但人工培育蜂王仍是难题。大多数蜂农采用自然王台换王,使中蜂的种性难以得到改善,易飞逃,分蜂性强,不易维持强群等,长此以往会导致饲养的蜂群群势越来越弱。因此,研究适合中蜂的蜂王培育方法,提高育王质量,有利于改良中蜂种性,提高生产效益,也对保护、开发和利用中蜂这一宝贵资源具有重要的理论和现实意义。【前人研究进展】自1888年美国DOOLITTLE在《科学育王法》中介绍了人工育王技术以来,单式移虫培育蜂王技术即被普遍采用[3]。20世纪40年代黄子固在单式移虫育王的基础上发明了复式移虫育王法,并被养蜂者广泛应用[4]。目前研究已经发现,在人工移虫育王时,随着移入幼虫日龄的增加,蜂王的初生重、卵巢管数、贮精囊直径、进入贮精囊的精子数等指标都明显下降,即幼虫日龄越小,培育蜂王质量越好[5-7]。育王时王台在育王框的位置对培育的蜂王质量有一定的影响,位于育王框中部的王台出房的蜂王质量较好[8-9]。陈世壁等[10]提出采用大卵育王结合复式移虫,可以培育出优质的处女王。刘光楠等在研究蜂王浆机械化生产中解决了蜂王浆的人工移虫问题[11-13],同时设计了意大利蜜蜂（Apis mellifer ligustica）的免移虫育王生产器[14],利用免移虫育王生产器进行育王,可以节省劳动力,并有效减少因移虫造成的幼虫机械性损伤,幼虫底部的大部分王浆也都被转移至王台内,保证了幼虫被充分哺育,可提高蜂王质量。除了在育王方式上的探索,在王台内添加信息素成分来提高培育蜂王的质量也是研究的一个方向。LE CONTE等研究表明西方蜜蜂幼虫信息素中的甲基亚油酸酯（methyl linoleate,ML）和甲基油酸酯（methyl oleate,MO）可分别促进单个王台内王浆量和王台接受率,而甲基棕榈酸酯（methyl palmitate,MP）可以提高育王过程中单个幼虫质量[15-17]。颜伟玉等[18]研究发现中蜂的幼虫信息素成分与西方蜜蜂的相似,包括甲基棕榈酸酯、甲基亚油酸酯、甲基油酸酯、甲基硬脂酸酯、甲基亚麻酸酯、乙基棕榈酸酯、乙基亚油酸酯、乙基油酸酯、乙基硬脂酸酯和乙基亚麻酸酯;曾云峰等[19]在育王过程中添加信息素,发现0.1%的MP可提高中蜂和意蜂幼虫质量;周冰峰等[20]以中华蜜蜂为试验材料,将保幼激素类似物ZR512注入王台内的蜂王浆让幼虫吸收,发现ZR512可显著提高蜂王初生重。对蜂王质量的评价通常采用初生重、卵巢管数量、胸重、胸宽等指标,对与蜂王卵巢发育相关的基因表达研究较少。CORONA等[21]研究表明卵黄原蛋白基因（Vitellogenin,Vg）的表达量与蜂王卵巢发育等级呈正相关,还与蜂王的寿命相关。KOYWIWATTRAKUL等[22]研究发现Vg和转铁蛋白基因（Transferrin,Trf）在卵巢发育的工蜂表达量显著高于卵巢未发育的工蜂,Vg和Trf表达量的上调将通过一系列下游反应使卵巢活化,刺激工蜂产卵行为。【本研究切入点】由于中蜂嗅觉灵敏,分蜂性强,难以维持强群等特点,在移虫或移卵过程中稍有不慎便会对卵或幼虫造成伤害,进而被工蜂清理,导致蜂王培育难以成功。随着养蜂人员的老龄化,养蜂者的视力明显下降,难以进行正常的移虫,也使得育王变得困难。借鉴意大利蜜蜂免移虫育王的经验,根据中蜂的生物学特性,设计适合中蜂的免移虫育王生产器,并与人工移虫育王进行比较。利用蜜蜂幼虫信息素探索中蜂优质蜂王培育在国内也鲜有相关研究报道,如果在育王时添加幼虫信息素成分能提高蜂王发育质量,那将为中蜂优质蜂王培育开辟一条新的途径。【拟解决的关键问题】研究免移虫育王与人工移虫育王对王台接受率、蜂王初生重、胸重、胸宽、卵巢管数量和Vg、Trf表达水平的影响,并探索在育王过程中分别添加MP和ML对蜂王质量的影响,确定适合中蜂优质蜂王培育的方法。1 材料与方法
试验于2015年4—11月在江西农业大学蜜蜂研究所试验蜂场（28.46°N,115.49°S）完成。1.1 试验蜂群
蜂群为江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中华蜜蜂。选择蜂群群势、蜂王年龄、子脾面积基本一致的健康蜂群3群作为哺育群,群势均为5框,采用郎氏标准蜂箱饲养。另选择一群健康、蜂王产卵性能好的蜂群作为母本群。育王在哺育群中进行,比较免移虫育王和人工移虫育王过程中,每群每种育王方式至少育王3次。幼虫信息素试验组,每种信息素每群至少采用人工移虫法育王3次。试验期间,对蜂群进行奖励饲喂,提高工蜂哺育积极性。
1.2 免移虫育王
免移虫育王是利用自主设计生产的中华蜜蜂免移虫育王生产器[23]进行蜂王培育。中华蜜蜂免移虫育王生产器由人工塑料巢础、无底单个王台、托虫器、配套王台条等几部分组成[24]。王台内径8.0 mm,高度为7.0 mm。中蜂免移虫育王生产器采用塑料材质制造单面塑料巢础,并在单个巢房底部中间预留小孔,用于安装相同孔径的托虫器。将巢础镶嵌于巢框时在巢脾背面加入抽拉式有机玻璃,可防止工蜂进入吐蜡造脾。将巢框放入蜂群中造脾,造脾成功后使用配套隔王装置控制蜂王于巢脾上产卵,待卵孵化成幼虫（即1日龄）时,拔出托虫器安装于配套塑料王台中,置于王台条上,然后转移至哺育群中。王台封盖第5天再将育王框取出,单个王台小心取下至于王笼中,放置恒温恒湿培养箱孵化（T：35℃,RH：70%）（下同）。1.3 人工移虫育王
人工移虫育王采用蘸蜡棒自制蜡质王台,内径8.0 mm,蘸蜡深度为7.0 mm。试验采用人工复式移虫育王,第1天移入非试验用1日龄工蜂幼虫,并在次日中午移出王台内幼虫,采用试验用1日龄工蜂幼虫进行第2次移虫。1.4 信息素处理
试验前用正己烷分别溶解MP和ML,分别配制成浓度为0（纯正己烷,作为对照组）、0.1%、1.0%、10.0%的溶液。控制蜂王产卵4 h,卵经过3 d孵化为1日龄幼虫,采用人工复式移虫育王进行蜂王培育。在幼虫60—63 h时取出育王框,将1 µL不同浓度信息素分别注入王台内的王浆中,并做标记。注射完毕,将育王框小心放回蜂群中。1.5 王台接受率测定
记录移虫数、移虫第3天幼虫接受数和羽化蜂王数,统计分析幼虫接受率和蜂王出房率,公式如下：幼虫接受率=第3天幼虫接受数/第1天移虫数×100%;
蜂王出房率=蜂王出房数/第1天移虫数×100%。
1.6 蜂王外部指标测定
蜂王羽化出房后利用电子天平称取初生重;剪取蜂王胸部、去翅足后称取胸重,采用江南永新光学有限公司CCD观察测试系统测量蜂王胸部宽度。1.7 蜂王卵巢管数量测定
参照甘海燕等[25]的方法,采用石蜡切片法测定蜂王卵巢管数。蜂王羽化出房后饥饿5 h,处死后将蜂王置于10%的甲醛溶液中固定4 h,解剖蜂王,再次将卵巢放回10%的甲醛固定液浸泡12 h左右,经一系列由低到高浓度的乙醇脱水,二甲苯透明后,进行浸蜡处理（具体过程同表1）,石蜡包埋后,在切片机上切成5 µm厚的切片,在摊片机上展开,展好的切片在室温下干燥或置于40℃恒温箱中30 min,苏木精-伊红染色,封片。每个样品观察3个切片,取平均值。Table 1
表1
表1脱水透明具体步骤及浸泡时间
Table 1Specific steps and soaking time of dehydration
| 名称 Name | 步骤 Step | 试剂 Reagent | 浸泡时间 Soak time |
|---|---|---|---|
| 脱水 Dehydration | 1 | 75%乙醇75% ethanol | 1 h |
| 2 | 85%乙醇85% ethanol | 1 h | |
| 3 | 95%乙醇Ⅰ95% ethanolⅠ | 1 h | |
| 4 | 95%乙醇Ⅱ95% ethanolⅡ | 1 h | |
| 5 | 无水乙醇ⅠAbsolute ethyl alcoholⅠ | 45 min | |
| 6 | 无水乙醇ⅡAbsolute ethyl alcoholⅡ | 45 min | |
| 透明 Vifrification | 7 | 二甲苯乙醇混液ⅠXylene ethanol mixture Ⅰ | 8 min |
| 8 | 二甲苯乙醇混液ⅡXylene ethanol mixtureⅡ | 2 min | |
| 9 | 纯二甲苯Ⅰ Pure xyleneⅠ | 10 s | |
| 10 | 纯二甲苯Ⅱ Pure xyleneⅡ | 2 s | |
| 透蜡 Transparent wax | 11 | 软蜡（硬蜡与二甲苯1﹕1混匀）Soft wax (Hard wax﹕xylene=1﹕1) | 1 h |
| 12 | 硬蜡Hard wax | 1 h |
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1.8 荧光定量PCR测定蜂王腹部Vg和Trf表达量
活体解剖初生蜂王腹部,采用去除消化道的蜂王腹部（包含内部的卵巢及卵巢上附着的脂肪组织）,RNA提取和cDNA合成参考秦秋红[26]的方法。根据GenBank中相关序列,采用Primer 5设计引物,由上海生工生物有限公司合成（表2）。荧光定量PCR采Table 2
表2
表2基因引物信息
Table 2The primer sequences of the genes
| 基因名称 Target gene | 上游引物序列 Forward primer sequence (5′-3′) | 下游引物序列 Reverse primer sequence (5′-3′) |
|---|---|---|
| 卵黄原蛋白基因 Vg | CGCATCACGAATACGACTAAGA | AGACGCTCCTCAGGCTCAAC |
| 转铁蛋白基因 Trf | TTGGGAAGAAAGAGGCTGAT | GGTGAGTTTGGTGATGGGTAT |
| 内参基因 β-actin | GGCTCCCGAAGAACATCC | TGCGAAACACCGTCACCC |
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用10 μL体系,各反应成分含量见表3。上下游引物、灭菌水、ROX和SYBR GREENⅡ（TaKaRa公司）计算多孔总量制成混液后添加至单孔中,cDNA最后单独加入八连管中。每个基因预留三孔阴性对照,均加入混液,但用灭菌超纯水代替cDNA。qRT-PCR反应条件：第一步95℃预变性30 s;第二步进行40个PCR循环（95℃,10 s;60℃,1 min）。扩增反应结束后从55℃缓慢加热至95℃,建立熔解曲线。
1.9 数据统计与分析
蜂王外部指标及卵巢管数量的试验数据利用StatView软件“ANOVA and t-test”中的“ANOVA or ANCOVA”进行统计分析。蜂王腹部Vg和Trf表达量利用2-ΔΔCt公式计算。Table 3
表3
表3荧光定量PCR反应体系
Table 3Reaction system of qRT-PCR assay
| 试剂Reagent | 体积Volume (μL) |
|---|---|
| 灭菌超纯水 Sterile water | 3 |
| 上游引物 Forward primer | 0.4 |
| 下游引物 Reverse primer | 0.4 |
| ROX校正液 ROX correction fluid | 0.2 |
| SYBR GREENⅡ | 5 |
| cDNA | 1 |
| 总体积 Total volume | 10 |
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2 结果
2.1 免移虫育王对中蜂蜂王质量的影响
2.1.1 王台接受率 免移虫育王和人工移虫育王的幼虫接受率分别为40.87%和74.38%,差异显著（P<0.05）;蜂王出房率分别为38.52%和69.13%,差异显著（P<0.05）。由于免移虫育王采用的是塑料王台,中蜂不易接受,因此幼虫接受率偏低,导致蜂王出房率也显著偏低（表4）。Table 4
表4
表4育王方式对王台接受率的影响
Table 4The effect of queen rearing method on the acceptance rate of queen cell
| 育王方式 Queen-rearing method | 幼虫接受率 The acceptance rate of the larvae (%) | 蜂王出房率 The emerged rate of the queen (%) |
|---|---|---|
| 免移虫育王Queen-rearing without larvae-grafting | 40.87±7.88a | 38.52±8.30a |
| 人工移虫育王Queen-rearing with larvae-grafting | 74.38±5.47b | 69.13±5.27b |
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2.1.2 蜂王相关指标 免移虫育王和人工移虫育王在蜂王初生重、胸重、胸宽和卵巢管数等指标均差异不显著（P>0.05）,除蜂王初生重外其他各项指标平均值都比较接近。因此,免移虫育王和人工移虫育王培育的蜂王在外部指标上并无显著差异（表5）。
Table 5
表5
表5育王方式对蜂王相关指标的影响
Table 5The effect of queen-rearing method on the index of queens
| 育王方式 Queen-rearing method | 蜂王数量（只） The number of the queens | 蜂王初生重 Newly-emerged weight (mg) | 胸部指标 Thorax index | 单侧卵巢管数（条） One side ovarioles number | |
|---|---|---|---|---|---|
| 胸重 Thorax weight (mg) | 胸宽 Thorax width (mm) | ||||
| 免移虫育王 Queen-rearing without larvae-grafting | 27 | 189.13±6.25a | 53.23±1.74a | 4.34±0.10a | 93.59±8.04a |
| 人工移虫育王 Queen-rearing with larvae-grafting | 27 | 191.78±6.15a | 53.37±2.16a | 4.35±0.07a | 93.24±9.36a |
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2.1.3 蜂王腹部Vg和Trf表达量 免移虫育王培育的蜂王腹部Vg表达量显著高于人工移虫育王的蜂王（图1-A,P<0.05）,但Trf表达量无显著差异（图1-B,P>0.05）（图1）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1免移虫育王和人工移虫育王蜂王腹部Vg和Trf表达量
-->Fig. 1The expression level of Vg and Trf in queen-rearing without and with larvae-grafting
-->
2.2 甲基棕榈酸酯对中蜂蜂王的质量影响
2.2.1 对蜂王相关指标的影响 由表6可知,不同浓度MP对蜂王的初生重、胸重、胸宽和卵巢管数量均无显著影响（P>0.05）。Table 6
表6
表6MP对蜂王相关指标的影响
Table 6The effect of methyl palmitate on the index of queens
| MP浓度 MP concentration (%) | 蜂王初生重 Newly-emerged weight (mg) | 胸部指标 Thorax index | 单侧卵巢小管数（条） One side ovarioles number | |
|---|---|---|---|---|
| 胸重 Thorax weight (mg) | 胸宽 Thorax width (mm) | |||
| 0 | 187.22±4.74a | 52.89±2.21a | 4.37±0.10a | 91.56±11.06a |
| 0.1 | 188.56±4.64a | 52.00±2.24a | 4.36±0.09a | 92.33±7.50a |
| 1.0 | 186.44±5.41a | 52.11±2.32a | 4.33±0.07a | 91.67±8.73a |
| 10.0 | 184.22±6.52a | 50.89±1.90a | 4.34±0.10a | 90.33±11.54a |
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2.2.2 对蜂王腹部Vg和Trf的影响 不同浓度的MP对蜂王腹部Vg（图2-A）和Trf（图2-B）表达水平均无显著影响（P>0.05）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2MP对蜂王腹部Vg和Trf表达量影响
-->Fig. 2The effect of methyl palmitate on the expression level of Vg and Trf in queen’s abdomen
-->
2.3 甲基亚油酸酯对中蜂蜂王质量的影响
2.3.1 对蜂王相关指标的影响 0.1% ML对蜂王初生重、胸部指标等均无显著影响（P>0.05）;1.0%甲基亚油酸酯显著降低了蜂王初生重及胸重（P<0.05）,对胸宽和卵巢管数量无显著影响;10.0%甲基亚油酸酯显著地降低了蜂王的初生重、胸部指标及卵巢管数量（P<0.05）（表7）。
Table 7
表7
表7ML对蜂王相关指标的影响
Table 7The effect of methyl linoleate on the index of queens
| ML浓度 ML concentration (%) | 蜂王初生重 Newly-emerged weight (mg) | 胸部指标Thorax index | 单侧卵巢小管数（条） One side ovarioles number | |
|---|---|---|---|---|
| 胸重 Thorax weight (mg) | 胸宽 Thorax width (mm) | |||
| 0 | 190.44±6.25a | 54.56±1.33a | 4.37±0.10a | 91.90±10.91a |
| 0.1 | 190.67±3.39a | 54.11±1.27a | 4.36±0.09a | 92.56±7.99a |
| 1.0 | 180.22±3.42b | 50.67±1.32b | 4.30±0.08ab | 88.33±8.29a |
| 10.0 | 169.78±5.85c | 48.67±1.12c | 4.26±0.10b | 61.44±11.14b |
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2.3.2 对蜂王腹部Vg和Trf的影响 0.1% ML对蜂王Vg表达量无显著影响（P>0.05）,但1.0%和10.0% ML显著降低了蜂王腹部Vg的表达量（图3-A,P<0.05）;各浓度ML对蜂王腹部Trf表达水平均无显著影响（图3-B,P>0.05）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3ML对蜂王腹部Vg和Trf表达量的影响
-->Fig. 3The effect of methyl linoleate on the expression level of Vg and Trf in queen’s abdomen
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3 讨论
中蜂免移虫育王的幼虫接受率显著低于人工移虫育王的幼虫接受率,这与刘光楠等[14]对意大利蜜蜂的试验结果相似。由于免移虫育王是待卵在巢房中孵化为小幼虫后再将托虫器拔下,插至王台底部,不会对幼虫造成机械性损伤,因此幼虫接受率显著偏低的主要原因是工蜂对塑料王台的排斥。有研究表明中蜂育王时工蜂更易于接受蜡质王台[27],这可能与中蜂灵敏的嗅觉[28-29]有关。在使用免移虫育王生产器时,可使用旧巢脾水浸泡、在塑料台基表面涂一薄层蜂蜡、密集蜂群群势等使蜜蜂适应塑料王台,提高幼虫的接受率,从而提高育王效率。免移虫育王培育的蜂王在初生重、胸部指标、卵巢管数量和Trf表达量等与人工移虫育王的比较并无显著差异,但Vg的表达量更高。Vg是一种多效性基因,与蜜蜂卵巢活性、寿命、免疫力等均具有一定相关性[30]。Vg含量高低可能与蜂王体内的保幼激素滴度或蜕皮激素水平有关,但具体机理尚不清楚。免移虫育王培育的蜂王在交尾后的产卵力、寿命和免疫力方面是否表现更为优越也有待于进一步的研究。一个免移虫育王生产器一次可提供81个用于育王的幼虫,按38%出房率计算,有30只蜂王出房,这基本能满足一个普通蜂场的换王需求。免移虫育王还可以减少劳动强度,对于年龄偏大、视力不佳的养蜂人员来说是一种较佳的育王方式,因此可以用来代替人工移虫育王。但在后期对免移虫育王生产器的改进中也应对塑料材质进行进一步地筛选,使中蜂更易于接受,提高幼虫的接受率。
LE CONTE等[16]以意大利蜜蜂为试验材料,研究发现ML可通过调节工蜂的哺育行为而增加王台内王浆含量。曾云峰等[19]研究表明,0.1%和1.0%的MP对中蜂王台接受率和王台中的王浆质量无显著影响,但单个幼虫的质量显著增加。本试验在中蜂育王过程中添加不同浓度的MP,对蜂王的各项指标及Vg和Trf表达并无显著影响。1.0%的ML显著降低了蜂王的初生重、胸重及Vg的表达;当浓度为10.0%时,蜂王的胸宽与卵巢管数也显著降低,因此过高的浓度可能降低了工蜂的哺育积极性,使蜂王质量下降。因此,在中蜂育王过程中添加MP和ML并不能达到提高蜂王质量的目的。本试验只研究了中蜂幼虫信息素中两种单一酯类对育王质量的影响,幼虫信息素中这两种酯类的释放特点、其他酯类、不同酯类成分组合及10种酯类混和对育王效果的影响,还有待于进一步研究。
4 结论
免移虫育王和人工移虫育王培育的蜂王比较,在外部指标、卵巢管数量和Trf表达量方面均无显著差异,王台接受率显著偏低,但免移虫育王的蜂王Vg表达量显著高于人工移虫育王。在育王过程中使用甲基棕榈酸酯和甲基亚油酸酯不能起到提高蜂王质量的作用。（责任编辑 岳梅）
The authors have declared that no competing interests exist.
