棉花（Gossypium spp.）是全球重要的经济作物,每年产值近120亿美元[1]。伴随生活水平的提高,人们越来越注重追求绿色和健康,天然纯棉制品像绿色食品一样受到越来越多消费者的青睐。但是,中国棉花产量却不断下降,“缺口”逐年加大。2002年,中国进口原棉69万吨,到2007年,进口猛增至543万吨,占当年纺织用棉的41.6%。更为严峻的是中国优质棉产量严重不足,适纺60支以上高档棉纱的优质原棉95%依赖进口。因而,为了保证中国棉花产业可持续发展、维护中国棉花生产安全、满足棉纺织业迅猛发展和国人生活水平提高之需要,提高棉花产量和改良纤维品质成为中国棉花育种的重要目标,而棉纤维发育相关基因的克隆与功能分析是实现这一目标的基础。中国科学家对于棉花纤维发育机制,特别是关键基因的克隆与功能研究方面取得了丰富的成果,已使中国关于棉花纤维发育的研究跻身世界领先行列。
关于棉纤维发育基因的报道最早见于1992年[2]。随着科学技术的迅猛发展,棉纤维发育相关基因的克隆与功能研究获得了长足进步。棉纤维是由胚珠表皮细胞分化而成,其发育过程可分为4个阶段：起始分化（initiation）（-3—3 days post anthesis,DPA）、细胞伸长（cell elongation）或称为初生壁合成（primary cell wall deposition）（2—20 DPA）、次生壁合成（secondary cell wall deposition）（15—45 DPA）以及脱水成熟（dehydration and maturation）（45—50 DPA）[3-5]。棉花的产量和质量主要取决于前几个阶段：决定每个胚珠上纤维数量的分化起始期与决定纤维长度与强度的初生壁和次生壁形成期[5-6]。因而,目前关于棉纤维发育基因的研究主要集中在这几个时期。本文按照基因编码蛋白的生物学功能进行了分类总结（电子附表1）,并综述了这些基因在棉纤维发育中的功能研究进展。
Table 1(1)
附表1(1)
附表1(1)棉花纤维品质改良相关基因
Table 1(1)Major genes related to fiber quality improvement of cotton
| 功能类别 Functional category | 基因名称 Gene name | GenBank登录号 GenBank accession number | 棉纤维发育中的功能 Functions during cotton fiber development | 参考文献 References |
|---|---|---|---|---|
| 转录因子 Transcription factors | GhMYB1-6 | L04497,AF034130-AF034134 | 棉纤维发育过程中优势表达 Preferential expression during cotton fiber development | [11] |
| GaMYB2 | AY626160 | 通过激活RDL1参与早期棉纤维发育 Involving in early cotton fiber development by activating the RDL1 | [7] | |
| GhMYB109 | AJ549758 | 参与棉纤维细胞的起始与伸长 Involving in the initiation and elongation of cotton fiber cells 可能调控的纤维发育基因包括GhACO1、GhACO2、GhTUB1和GhACTIN1 Likely regulating fiber-related genes including GhACO1, GhACO2, GhTUB1 and GhACTIN1 | [13-14] | |
| GhMYB25 | AY464054 | 参与调控纤维伸长、起始分化数量和时间 Involving in regulating fibre elongation, fibre initiation number and timing | [17] | |
| GhMYB25-like | HM134081 | 在纤维细胞分化非常早的时期发挥重要作用 Playing a key role in the very early stages of fibre cell differentiation 作用于GhMYB109和GhMYB25的上游 Acting upstream of GhMYB25 and GhMYB109 | [18] | |
| GhMML3_A12 | XM016848213 XM016876004 | 通过介导mRNA的自我剪切参与短绒发育 Mediating mRNA self-cleavage and involving in fuzz fiber development | [19] | |
| GhMYB7/9 | AY518319/AY518320 | 可能通过转录调控Ltp3基因参与纤维发育 Potentially playing a role in the transcriptional regulation of the Ltp3 gene during fiber development | [20] | |
| GhMYB8/10 | EF421795/EF421796 | 棉纤维发育过程中优势表达 Preferential expression during cotton fiber development | [21] | |
| GhCPC | FJ402930 | 负向调控棉纤维起始和早期伸长 Negatively regulating cotton fiber initiation and early elongation 能够与GhTTG1/4和GhMYC1互作形成复合体,进而可能调控下游基因GhHOX3 Interacting with GhTTG1/4和GhMYC1 to form a complex that might regulate downstream gene GhHOX3 | [19] | |
| GbML1 | 无记录 | 能够与GhMYB25互作,激活具有L1-box顺式元件的基因 Interacting with GbMYB25 to activate L1-box-layer specific genes | [23] | |
| GhHD1 | JN585951/JN585952 | 一个假定同源域亮氨酸拉链转录因子 A putative homeodomain leucine zipper transcription factor 调控纤维起始 Regulating the fibre initiation 作用于GhMYB25-like的下游过程 Acting downstream of GhMYB25-like 可能通过WRKY和钙离子信号通路改变乙烯和活性氧水平,进而激活下游参与细胞扩张与伸长基因的表达 Potentially regulating the levels of ethylene and reactive oxidation species through a WRKY transcription factor and calcium-signaling pathway genes to activate downstream genes necessary for cell expansion and elongation | [24] | |
| GaHOX1 GhHOX1 | EU328266 AF530913 | 在棉纤维细胞起始和伸长早期高表达 High expression in cotton fiber cells during fiber initiation and early elongation stages 可互补拟南芥突变体gl2-2缺陷 Complementation of Arabidopsis thaliana gl2-2 mutant | [26] | |
| GhHOX3 | KJ595847 KJ595848 | 通过转导赤霉素信号促进棉纤维伸长 Transducing gibberellin signal to promote fibre cell elongation 能够与GhHD1互作以提高转录活力 Interacting with GhHD1 and resulting in enhanced transcriptional activity 能够与赤霉素阻遏蛋白GhSLR1互作 Interacting with repressor of gibberellin GhSLR1 | [25] | |
| GhMADS1 GhMADS4-7 GhMADS9 | AF538965 ABM69042-ABM69045 HM187578 | 棉纤维中优势表达 Preferentially expression in cotton fibers | [32-34] | |
| GhMADS11 | HM989877 | 棉纤维中优势表达 Preferentially expression in cotton fibers 超表达促进裂殖酵母细胞伸长 Overexpression promoting typical cell elongation of fission yeast | [35] | |
| GhMADS14 | KC200249 | 在伸长的棉纤维中特异表达 Specific expression in the elongating fibers 可能通过调控GA含量的动态平衡参与棉纤维伸长 Likely contributing to modulating the dynamic balance of gibberellin amounts for fiber elongation of cotton | [36] | |
| GhKNL1 | KC200250 | 在纤维次生壁合成期优势表达 Preferentially expression at the stage of secondary cell wall biosynthesis 可影响纤维细胞长度和细胞壁厚度 Affecting length and cell-wall thickness of fibres 能够与其他转录因子互作,包括OFP4和MYB75 Interacting with other transcription factor,including GhOFP4 and MYB75 | [37] | |
| GbTCP | DQ912941 | 在伸长的棉纤维中优势表达 Preferentially expression in the elongating cotton fibers 能够正向调节JA合成和其他通路,包括活性氧、钙离子通道和乙烯信号通路 Positively regulating jasmonic acid biosynthesis and other pathways, including reactive oxygen species, calcium channel and ethylene signaling | [40] | |
| GhTCP14 | AF165924 | 可能作为一个关键的调控因子参与生长素介导的棉纤维细胞的分化和伸长 Potentially acting as a crucial regulator in auxin-mediated differentiation and elongation of cotton fiber cells | [41] | |
| 激素代谢 Phytohormone metabolism | GhACO1-3 | DQ116442-DQ116444 | 在伸长的纤维细胞中高表达 High expression in elongating fiber cells 可能通过增加乙烯合成促进棉纤维细胞伸长 Potentially promoting fiber cell elongation by increasing ethylene biosynthesis | [6] |
| GhACS2 | ABM66813 | 与CPK1互作提高酯酰辅酶A合成酶活力,进而增加乙烯合成 Significant increasing ACS activity by interacting with CPK1, leading to elevated ethylene production | [43] | |
| GhDET2 | AY141136 | 在棉纤维起始期和快速伸长期高转录 High transcript during the fiber initiation stage and the fiber rapid elongation stage 种皮特异性表达 Seed coat-specific expression 能够影响棉纤维数量和长度 Affecting fiber number and length | [45] | |
| GhBRI1 | BG441661 | 通过调控次生壁发育而影响棉纤维成熟度 Affecting fibers maturity by regulating secondary cell wall development | [44,46-47] | |
| GhPAG1 | 无记录 | 通过调控油菜素内酯含量而影响超长链脂肪酸合成、乙烯信号、钙离子信号、及细胞壁和细胞骨架相关基因表达,进而在棉纤维发育过程中发挥重要作用 Playing a crucial role in regulating fiber development via controlling the level of endogenous brassinosteroids, which may effect on VLCFA biosynthesis, ethylene and cadmium signaling, cell wall- and cytoskeleton-related gene expression | [48] |
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Table 1(2)
附表1(2)
附表1(2)棉花纤维品质改良相关基因
Table 1(2)Major genes related to fiber quality improvement of cotton
| 功能类别 Functional category | 基因名称 Gene name | GenBank登录号 GenBank accession number | 棉纤维发育中的功能 Functions during cotton fiber development | 参考文献 References |
|---|---|---|---|---|
| GbGI | DQ643969 | 编码DELLA蛋白 Encoding DELLA proteins 在棉纤维中有明显的表达 Predominant expression in cotton fibers 在赤霉素信号通路发挥阻遏调控作用 Acting as a repressor of the gibberellin signaling pathway | [50] | |
| GhGAI3a/b GhGAI4a/b | HM034760/HM034761 HM034762/HM034763 | [53] | ||
| GhRGL | AY208992 | [54] | ||
| GhSLR1a/1b | DQ006269/AY208992 | [55] | ||
| GhGA20ox1-3 | FJ623272,FJ623273 FJ623274 | 通过调控赤霉素合成促进棉纤维起始和伸长 Promoting initiation and elongation of cotton fibers by regulating gibberellin synthesis | [51] | |
| GhCKX | FJ644277 | 胚珠表皮中特异表达 Specific expression in the ovule epidermis 通过调控内源激动素含量影响果枝数、棉铃和棉籽体积 Regulating endogenous cytokinins to influence on fruiting branches, bolls and seed size | [57-58] | |
| 细胞壁蛋白 Cell wall proteins | GhPRP3 GhPRP5 | EF095704 EF095706 | 可能作为一个负调控者参与棉纤维发育 Potentially as a negative regulator participating in modulating fiber development of cotton | [66-67] |
| GhFLA1 | EF672627 | 在棉纤维中特异表达 Specific expression in cotton fibers 可能通过影响初生细胞壁中阿拉伯半乳糖蛋白组成和细胞壁完整度参与棉纤维起始分化与伸长 May function in fiber initiation and elongation by affecting arabinogalactan proteins composition and the integrity of the primary cell wall matrix | [68, 70] | |
| GhFLA2/4 GhFLA6/14 GhFLA15/18 | EF672628/EF672630 EF672632/EF672640 EF672641/EF672644 | 特异或主要在棉纤维中表达 Specific or predominant expression in cotton fibers | [68] | |
| GbFLA5 | KC412182 | 在棉纤维中特异表达 Specific expression in cotton fibers | [69] | |
| GhExp1/2 | AF512539/AF512540 | 在伸长的棉纤维中特异表达 Specific expression in elongating cotton fibres | [29] | |
| GhRDL1 | AY072821 | 主要在伸长的棉纤维细胞中表达 Predominate expression in elongating fiber cells 与α-expansin蛋白存在互作 Interacting with α-expansin 与GhEXPA1共表达能够促进棉纤维增产 Co-expression with GhEXPA1 promoting fiber yield | [12, 27] | |
| 细胞骨架蛋白及其结合蛋白 Cytoskeletal proteins and binding proteins | GhTua1-5 | AF106567-AF106571 | 在发育的棉纤维中产生特异性的转录变化 Specific transcript changes in developing cotton fibers | [75] |
| GhTUB1/3 GhTUB5/6 GhTUB7/9 GhTUB12 | AF487511/AF484959 AY345610/AF521240 AY345606/AY345609 DQ023526 | 在棉纤维细胞中优势表达 Preferential expression in cotton fiber cells | [15, 76] | |
| GhACTIN1 | AY305723 | 参与棉纤维伸长 Participating in cotton fiber elongation | [16] | |
| GhWLIM5 | JX290321 | 主要在棉纤维伸长期表达 Predominate expression during cotton fiber elongation 参与调控动态的F-actin网络 Involving in modulating the dynamic F-actin network | [78] | |
| GhCFE1A | DQ073045 | 在纤维发育的起始和快速伸长期优势表达 Preferential expression at initiation and rapid elongation stages during fibre development 可能作为肌动蛋白骨架和内质网网络的动态连接者发挥作用 Probably function as a dynamic linker between the actin cytoskeleton and the endoplasmic reticulum network | [79] | |
| GhPFN2 | GU237487 | 在棉纤维细胞中优势表达 Preferential expression in cotton fiber cells 参与肌动蛋白高级结构的形成 Involving in the formation of the higher actin structure | [80] | |
| GhADF1 | DQ088156 | 调控肌动蛋白骨架的组织结构 Regulating the organization of actin cytoskeleton 在棉纤维发育的伸长和次生壁形成过程中发挥重要作用 Playing a critical role in the processes of elongation and secondary cell wall formation during cotton fibre development | [81] | |
| WLIM1a | JX648310 | 在伸长期和次生壁合成期的纤维细胞中优势表达 Preferential expression during the elongation and secondary wall synthesis stages in developing fiber cells 影响纤维强度和细度 Contributing to improve fiber strength, fineness and quality 可作为转录因子参与苯丙烷合成,建立次生壁 As a transcription factor involving in phenylpropanoid biosynthesis to build up the secondary cell wall | [83] | |
| 糖代谢 Sugar metabolism | GhGT43A1 | KC953865 | 纤维伸长期优势表达 Preferential expression during the fibre elongation stage 过表达能够导致木聚糖含量增加和更多的纤维素沉积 Overexpression leading to xylan content increase and more cellulose deposition | [84] |
| GhUXS1-3 | EU817581,EU791897,EU791898 | 在棉纤维发育过程中优势表达 Preferential expression during cotton fiber development | [85-86] | |
| GhXTH1 | HM749061,D88413 | 主要在伸长的棉纤维细胞中表达 Predominate expression in elongating cotton fiber cells | [87-89] | |
| GhSusA1 | HQ702185 | 超表达可以改善棉纤维长度和强度,这可能与其能够影响棉纤维细胞壁的厚度相关 Overexpression increasing cotton fiber length and strength, with the latter indicated by the enhanced thickening of cell wall | [91] | |
| 脂肪酸代谢 Fatty acids metabolism | GhPAS2 GhECR GhKCS13 GhKCR | KF542906/KF542907 ABV60088/ABV60089 DQ122189 AY902466/AY902467 | 在棉纤维发育过程中优势表达 Preferential expression during cotton fiber development | [96-100] |
| 活性氧 Reactive oxygen species | GhPOX1 | ACJ11763 | 可能通过介导ROS的产生参与调节棉纤维伸长 Playing an important role during cotton fiber cell elongation possibly by mediating production of reactive oxygen species | [103] |
| GhAPX1AT/DT | EF432582 | 纤维伸长期优势表达 Preferential expression during the fibre elongation stage 通过调控合适的H2O2含量而影响纤维伸长 Affecting cotton fiber elongation by regulating optimal H2O2 level | [104-105] | |
| GhFAnnxA | ACJ11719 | 通过调控Ca2+流、ROS稳态和肌动蛋白丝重组影响棉纤维的伸长及次生细胞壁的合成 Affecting cotton fiber elongation and secondary cell wall biosynthesis by regulating Ca2+ influx, ROS homeostasis and actin filament reorganization | [106] | |
| 水通道蛋白Aquaporin | GhPIP1-2 GhPIP2;3/2;4 GhPIP2;5/2;6 | EF470293 EU402412/EU402413 FJ646596/FJ646597 | 通过调控水通道活力参与棉纤维发育 Involving in cotton fibre development by regulating water channel activities | [109-110] |
| 14-3-3蛋白 14-3-3 proteins | Gh14-3-3L Gh14-3-3a/e Gh14-3-3f-h | DQ402076 EU189220/EU189224 GU451708-GU451710 | 可能通过与GhBZR1互作来调节油菜素内酯信号,进而调控纤维起始与伸长 May involving in regulating fibre initiation and elongation through their interacting with GhBZR1 to modulate brassinosteroids signaling | [111-113] |
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1 转录因子
转录因子（transcription factors）在棉纤维细胞发育过程中起重要的调控作用。近年来报道的与棉纤维发育相关的转录因子主要包括MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）、HD-ZIP（homeodomain-leucine zipper）、MADS（MCM1- AGAMOUS-DEFICIENS-SRF）、KNOX（knotted related homeobox）、TCP（teosinte branched1/cycloidea/PCF）等家族成员。拟南芥（Arabidopsis）是目前基因功能解析最为全面的模式植物,其他植物的许多基因功能研究多源于拟南芥同源基因,棉花功能基因的研究也不例外。棉纤维细胞与拟南芥表皮毛一样是高度伸长的单细胞,两者具有表皮毛发育调控的相似机制[7]。在拟南芥中,研究较为深入的表皮毛发育相关的转录因子如R2R3-MYB家族的GLABRA1 （GL1）[8]、R3-MYB家族的CAPRICE（CPC）[9]、GLABRA2（GL2）[10]等,它们的同源基因在棉花中已被成功克隆。MYB转录因子家族在植物内数量庞大,而R2R3类型基因不仅在MYB家族中数量最多,而且关于它们参与棉纤维细胞发育的研究也最为深入。LOGUERICO等[11]从陆地棉（Gossypium hirsutum）开花前3 d的胚珠cDNA文库中筛选到6个R2R3-MYB类型转录因子基因（GhMYB1-GhMYB6）,它们在棉纤维发育的不同时期表达水平有不同的变化,暗示其在调控棉纤维细胞发育中具有不同的功能特异性。之后,WANG等[7]通过酵母单杂交（yeast one hybrid）技术证明其中的MYB2能够调控棉花纤维发育基因RDL1（RD22-like1）[12]的转录。SUO等[13]从棉纤维起始早期胚珠分离到55个包含不同MYB保守域的基因片段,并克隆其中一个R2R3-MYB类型基因GhMYB109,其在初始分化和伸长期的棉纤维细胞中特异表达。通过RNAi和扫描电镜技术进一步证明GhMYB109参与纤维细胞起始与分化[14],其可能调控的与棉纤维发育相关基因包括GhACO1、GhACO2[6]、GhTUB1[15]和GhACT1[16]。通过比较无纤维棉突变体与野生型（wild-type,WT）转录组,MACHADO等[17]分离了另一R2R3-MYB—GhMYB25。通过RNAi和过表达正反向验证,表明GhMYB25不仅参与调控棉纤维伸长,还能够调控纤维起始分化数量和时间。GhMYB25-like与GhMYB25有69%氨基酸序列相似性,并且二者在棉纤维中的转录水平变化和趋势一样。RNAi研究进一步证明GhMYB25-like对棉纤维发育具有重要的调节功能,很可能在GhMYB109和GhMYB25上游发挥作用[18]。最近,WAN等[19]首次通过图位克隆获得了一个调控棉花短绒发育的关键基因GhMML3_A12（MYBMIXTA-like transcription factor 3/GhMYB25-like in chromosome A12）。GhMML3_A12在光子突变体N1中的表达极低,这与其反义启动子驱动产生的NAT（natural antisense transcripts）密切相关。小RNA深度测序结果进一步表明GhMML3_A12的双向转录可能会形成dsRNA,进而产生21—22 nt的小RNA。GhMML3_A12可能通过这些小RNA进行自我剪切而实现表达下调,从而影响棉纤维发育[19]。此外,其他报道的参与棉纤维发育调控的R2R3类型MYB基因如GhMYB7和GhMYB9,它们在棉纤维伸长期优势表达并潜在调控脂转移蛋白LTP3（lipid transfer protein）[20],以及GhMYB8和GhMYB10[21]等。
在拟南芥中,GL1、bHLH（basic helix-loop-helix）蛋白GL3（GLABRA3）、TTG1（TRANSPARENT TESTA GLABRA1）三者能够结合,形成的复合体正向调控表皮毛发育[22]。CPC是一个含不完全重复区域R3类型的MYB,与GL1之间存在互作竞争,可阻止复合体形成,从而负向调控表皮毛发育[9]。LIU等[19]从陆地棉中克隆一个GhCPC,其过表达不仅导致棉纤维起始分化发生延迟,而且导致纤维长度显著降低。酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2H）试验表明,棉花GhCPC同样与GhTTG1/4、GhMYC1（GL3）之间存在互作。由此可推测拟南芥CPC与GL1-GL3-TTG复合体之间互作调控表皮毛发育的模式在棉花纤维调控中同样存在。GhMYC1能够与GhHOX3启动子中的顺式元件E-box结合,因而推测这个互作调控的下游基因可能为GhHOX3[19]。
拟南芥GL2是HD-ZIP IV家族转录因子。已报道的参与棉纤维发育的GL2同源性基因包括GbML1（meristem layer 1）[23]、GhHD1[24]及HOX[25-26]。GbML1在棉纤维发育中不仅具有与GhMYB25相似的表达方式,而且过量表达GbML1使拟南芥叶片和茎上的表皮毛数量显著增加。GbML1能够结合L-box顺式元件,因而具有调控其他棉纤维发育基因的可能,如RDL1[12,27]。GbML1与GhMYB25之间通过START- domain（GbML1）和SAD-domain（GhMYB25）可以形成物理互作,因此,GbML1可能作为伴侣分子增强GhMYB25对棉纤维发育的调控[23]。GhHD1与GbML1具有较高同源性,其沉默不仅使棉纤维细胞起始分化数量减少,而且时间延后。GhHD1超表达显著增加棉纤维细胞起始分化的数量。GhHD1可能作用于GhMYB25-like调控的下游过程,但不在GhMYB25和GhMYB109调控的下游。利用基因芯片（microarray）对GhHD1沉默和超表达棉株进行分析,表明GhHD1可能通过WRKY和钙离子信号通路（calcium-signaling pathway）改变乙烯（ethylene,ETH）和活性氧（reactive oxidation species,ROS）水平,进而影响其他参与细胞扩张与伸长基因的表达[24]。中国科学院上海生命科学研究院陈晓亚院士团队先后在棉花中克隆了3个GL2同源基因—HOX1、HOX2、HOX3。其中,HOX1和HOX3显示出与棉花纤维发育相关[25-26]。来自于亚洲棉（Gossypium arboreum）的GaHOX1与拟南芥AtGL2具有较高同源性,主要在发育早期的棉纤维细胞中表达。GaHOX1可互补拟南芥突变体gl2-2缺陷,即使其重新长出表皮毛[26]。超表达GhHOX3能够使棉纤维变得更长,而将该基因沉默则导致棉纤维长度缩短超过80%。通过数字化基因表达分析（digital gene expression analysis）,发现了300多个可能受GhHOX3调控表达的差异基因 [25]。在拟南芥中,L1-box被证明是HD-ZIP类转录因子结合的顺式元件[28]。据此,18个启动子中具有该元件的基因被推测是受GhHOX3调控的下游基因,其中,包括2个具有使细胞壁松弛功能的基因—GhRDL1[12,27]和GhEXPA1[29]。GhHOX3不仅与GhHD1存在互作,还与受赤霉素（gibberellin,GA）调控的DELLA蛋白GhSLR1存在互作[30]。因而,总结出GhHOX3介导的棉纤维发育的机制为棉纤维细胞内GA水平正常或较低时,HOX3与其阻遏蛋白GhSLR1结合;当GA水平升高后,GhSLR1被蛋白酶降解,使HOX3构象改变,并与调控增强子GhHD1结合,进而调控启动子序列含有L1-box的棉纤维发育相关基因表达,最终使棉纤维变长[25]。
MADS蛋白家族都含有一个保守的MADS-box结构域,是植物内另外一个大的转录因子家族[31]。在棉花中已经发现几个MADS,其中与棉纤维发育相关的如GhMADS1[32]、GhMADS4-7[33]、GhMADS9[34]、GhMADS11[35]、GhMADS14[36]等。除在转录水平表明这些基因参与棉纤维的发育外,进一步的超表达试验表明GhMADS11可促进酵母细胞伸长[35],但GhMADS14则使拟南芥下胚轴长度显著降低,且GA相关合成基因的表达量显著下降,表明GhMADS14可能通过调控GA合成参与棉纤维发育[36]。
GONG等[37]克隆了一个棉花KNOX（knotted related homeobox）Ⅱ型转录因子—KNL1（KNOTTED1- LIKE）,它在纤维次生壁加厚期优势表达。GhKNL1显著抑制棉株的纤维长度和细胞壁厚度,比WT显著降低。在拟南芥中,GhKNL1过量表达和基因抑制都可导致植株茎基部细胞壁厚度降低。GhKNL1具有转录因子的序列特征和互补拟南芥转录因子KNAT7的功能,却不具有转录激活功能。然而,GhKNL1能够与其他参与细胞壁形成相关的转录因子如OFP4（OVATE FAMILY PROTEIN4）[38]和MYB75[39]等发生互作,所以其可能是通过调节其他转录因子活力而影响棉纤维的发育[37]。
HAO等[40]克隆了一个海岛棉Ⅰ型TCP基因—GbTCP,它在棉纤维伸长期优势表达。GbTCP沉默后,棉纤维长度和品质显著降低。Solexa测序、Affymetrix基因芯片分析及JA含量测定等试验结果表明,GbTCP正向调控JA合成,进而影响其他下游基因参与棉纤维伸长。之后WANG等[41]从陆地棉中也克隆了一个TCP家族Ⅰ型基因—GhTCP14,该基因主要在起始及伸长阶段的纤维细胞中高表达。在拟南芥中异源表达GhTCP14促进了茎和花序等部位表皮毛以及根毛的起始和伸长,以及改变了生长素在拟南芥体内的分布。进一步的凝胶阻滞电泳（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）试验显示,GhTCP14蛋白能够直接与AUX1、IAA3和PIN2等生长素途径关键基因的启动子结合。这些结果表明TCP是通过激素调控棉纤维发育的。
2 激素代谢相关基因
激素在调节植物生长发育和抗逆过程中具有核心重要性。目前,可作为植物激素的共有10种结构不相关的小分子[42]。其中,被报道对棉纤维发育具有明显影响的有ETH、油菜素内酯（brassinosteroid,BR）、GA、细胞激动素（cytokinin,CK）、生长素（auxin,AUX）及脱落酸（abscisic acid,ABA）。2.1 ETH
在棉花胚珠培养中,外源添加乙烯能够显著促进棉纤维细胞伸长,而添加乙烯合成抑制剂硫代硫酸银则显著抑制棉纤维伸长。此外,棉纤维cDNA文库测序和基因芯片分析等分子试验结果也证明乙烯及其代谢途径在棉花纤维细胞伸长过程中发挥非常重要的作用[6]。SHI等[6]从陆地棉纤维cDNA文库中克隆到编码乙烯合成途径的最后一个酶ACO（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶）的3个同源基因ACO1-3,它们在纤维快速伸长期特异高效表达。特别是在体外试验中,胚珠释放乙烯量、ACO表达水平、纤维伸长速度三者保持一致,进一步表明ACO是通过控制乙烯合成参与调控棉纤维细胞发育。虽然ACS（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid synthase,1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶）是乙烯合成的限速酶,但其并不像ACO一样通过上调转录参与乙烯合成进而影响棉纤维发育。ACS活力增强可能是由于转录后修饰,即受CPK1（Ca2+-dependent protein kinase 1）作用而发生磷酸化[43]。2.2 BR
体外试验中,应用浓度非常低的BR能显著促进棉纤维细胞的生长,而添加BR合成抑制则导致纤维细胞的发育受到抑制[44],这表明BR在棉花纤维细胞伸长过程中发挥重要的作用。类固醇5α还原酶（steroid 5α-reductase）是BR合成中的主要限速酶。LUO等[45]从陆地棉中克隆到一个具有编码类固醇5α还原酶活力的基因—GhDET2,它在棉纤维细胞起始分化和伸长阶段高表达。反义RNA抑制GhDET2的表达和类固醇5α还原酶抑制剂处理胚珠的结果一致,均导致纤维细胞伸长受到抑制。种皮特异表达GhDET2能够使棉纤维数量和长度显著增加。编码棉花BR受体蛋白BRI1（brassinosteroid insensitive 1）的基因GhBRI1早在2004年就已经被克隆,并在转录水平初步证明其参与棉纤维发育[44, 46]。近来,SUN等[47]通过过表达和基因沉默进一步分析了GhBRI1在棉纤维发育中的功能。过表达GhBRI1对纤维长度几乎没有影响,但却使纤维素显著积累。沉默GhBRI1使细胞次生壁的发育受到强烈抑制,导致纤维成熟度降低。这表明GhBRI1介导的BR信号是通过调控纤维素在次生壁中的沉积,进而影响棉纤维的成熟度。YANG等[48]从棉花中克隆到一个编码细胞色素P450的基因—PAG1,其编码蛋白与拟南芥CYP734A1同源。pag1突变体不仅导致棉株表现BR缺少的典型症状,即植株矮小和叶片黑绿,而且棉纤维长度显著变短。应用RNA-Seq分析,推测PAG1可能是通过调控BR信号通路而影响乙烯信号、钙离子信号、及细胞壁和细胞骨架相关基因表达,进而影响棉纤维发育。2.3 GA
外施GA确实能够促进棉纤维细胞的伸长[49]。检测表明,棉花开花当天胚珠中的内源GA浓度有一个显著提升,并在纤维细胞伸长过程中保持较高含量;而叶片中的GA浓度无明显变化[50],说明GA在棉花纤维细胞伸长过程中发挥重要的正向调控作用。GA-20氧化酶是重要的GA生物合成和调控酶。XIAO等[51]从陆地棉中克隆到3个GA-20氧化酶同源基因,即GhGA20ox1、GhGA20ox2和GhGA20ox3。GhGA20ox1主要在正在伸长的棉纤维细胞中表达,而GhGA20ox2和GhGA20ox3的转录更多是发生在胚珠中。过量表达GhGA20ox1的转基因棉,不但表现为棉纤维和胚珠中GA含量的增加,而且每个胚珠上棉纤维的初始数量和纤维长度显著增加。DELLA作为阻遏蛋白,是GA信号传导途径中重要的负调控因子[52]。目前,在棉花中共有8个含有DELLA保守域的编码基因被报道,包括GbGI[50]、GhGAI3a、GhGAI3b、GhGAI4a、GhGAI4b[53]、GhRGL[54]、GhSLR1a和GhSLR1b[55]。虽然转录水平上的变化初步表明这些DELLA基因参与棉纤维的发育,但还需进一步在转基因棉花中进行功能验证与机制解析。2.4 CK
CK能促进体外培养的胚珠发育,但阻碍纤维细胞的发育[49]。开花前,CK能够刺激纤维起始发育,而开花后CK对棉纤维发育产生抑制作用[56]。细胞激动素脱氢酶（cytokinin dehydrogenase,CKX）是植物内源CK合成的关键负调控因子。ZENG等[57]成功克隆了一个具有CKX活力的陆地棉基因GhCKX,其在胚珠表皮中特异表达;超表达GhCKX能使棉花胚珠内CK含量显著降低,从而导致棉纤维起始分化数量明显减少。该实验室进一步研究发现,抑制GhCKX表达可使棉纤维细胞内CK含量提高,其中CK含量提高20.4%和55.5%的转基因棉株表现出叶片衰老推迟、光合作用升高、果枝增加、棉铃和棉籽增大,从而使皮棉产量相应提高了15.4%和20.0%,但CKX表达变化导致CK含量的变化对棉纤维品质没有产生显著影响[58]。2.5 AUX
外施吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA,AUX）或利用FBP7表皮特异启动子将外源IAA合成基因（如来源于农杆菌的iaaM）转入棉花,不仅能够推动棉纤维起始,还能增加纤维数量[59-60]。YANG等[61]对来源于棉花胚珠的32 798个ESTs进行了表达分析,并富集了许多与IAA合成（YUCCAs、CYP83B1s、SIR1和NIT2)、信号传导（ARFs、AUX1、TIR1和PIN1）及转运（AUX1和PIN1）相关的ESTs。虽然IAA对棉纤维发育的调控具有重要作用,但目前还未见关于这些基因的克隆与调控棉纤维发育功能等方面的深入报道。2.6 ABA
目前,虽然关于ABA在棉纤维发育中的研究还不够深入,但其参与棉纤维发育调控的重要作用早已被证实[62]。随着棉铃发育,ABA的含量从10 DPA开始增加,到20 DPA逐渐降低,而到30—50 DPA时含量又有所增加[62]。高浓度的ABA对棉纤维发育具有明显的抑制作用。在不同棉种中的研究发现,内源ABA含量高的品种其棉纤维会较短[63]。3 细胞壁蛋白
在植物细胞生长过程中,许多蛋白在细胞壁中积累,如各种结构蛋白,包括富含脯氨酸蛋白（proline- rich protein,PRP）、阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan protein,AGP）、伸展蛋白（extensin,EXT）,还有与多糖作用的扩展蛋白（expansin,EXPA或Exp）及各种酶[64]。FENG等[65]利用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）方法在快速伸长的棉纤维细胞中分离到5个基因家族,其中就包括PRP、AGP和EXPA。许文亮等[66]从棉花cDNA文库中分离了5个PRP基因,其中GhPRP3和GhPRP5表达受纤维发育调节。进一步分析显示,抑制GhPRP5导致棉纤维发育相关基因表达发生了显著变化,并促进棉花纤维细胞伸长。据此推测GhPRP5是棉纤维发育的负向调控因子[67]。HUANG等[68]在陆地棉中克隆到19个类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白（Fasciclin-like arabinogalactan protein,FLA）基因,GhFLA1、GhFLA2和GhFLA4特异性的或主要在10 DPA棉纤维细胞中表达,而GhFLA6、GhFLA14、GhFLA15和GhFLA18虽不仅仅在纤维中表达,但其水平也相对较高。LIU等[69]从海岛棉中也克隆到一个FLA基因—GbFLA5,转录水平上的变化表明其参与棉纤维发育。GhFLA1过量表达能够促进棉纤维细胞伸长,并促进其他初生细胞壁合成基因的表达显著升高。相反,抑制GhFLA1表达则显著降低棉纤维起始分化和伸长,且导致其他初生细胞壁合成基因表达显著降低。不仅如此,GhFLA1的过表达和沉默还影响棉纤维初生细胞壁中葡萄糖（glucose）、阿拉伯糖（arabinose）及半乳糖（galactose）含量。由此表明GhFLA1可能通过影响初生细胞壁中AGP组成和完整度参与棉纤维起始分化与伸长[70]。HARMER等[29]从陆地棉中克隆到6个α-expansin基因（GhExp1-GhExp6）,其中GhExp1和GhExp2在纤维中特异性表达,暗示它们参与棉纤维发育。此外,还有一些其他参与棉纤维发育的蛋白定位于细胞壁,如GhRDL1,其编码蛋白含有BURP（BNM2/USP-like/RD22/PG1b）域,主要在伸长的棉纤维细胞中表达[12, 27]。过量表达GhRDL1不仅显著提高了棉纤维长度,还可使棉花种子明显增大。GhRDL1与另一个参与棉纤维发育的细胞壁蛋白GhEXPA1之间存在蛋白互作。将这两个基因共同超表达,除了能够使棉铃显著增大及棉产量明显提高外,还能显著改善棉纤维品质,包括纤维长度、强度和马克隆值（micronaire）[27]。4 细胞骨架蛋白及其结合蛋白
植物细胞骨架主要由微管（microtubule）和肌动蛋白微丝（actin filament）组成[71]。在高等植物中,微管能够指导纤维素微纤丝在细胞壁中的沉积方向,从而参与细胞形态的建成。早在20世纪90年代,微管就已经被证实参与棉纤维发育[72-74]。微管的主要结构组成是一种异源二聚体蛋白——微管蛋白（tubulin,TUB）,它由α和β 2个保守的亚基组成。WHITTAKER等[75]通过基因特异性探针检测到5个α-TUB基因在棉纤维细胞中的表达发生积累。LI等[15]克隆到一个编码β亚基的陆地棉基因——GhTUB1,其在棉纤维中优势表达。HE等[76]在陆地棉中鉴定到795个微管蛋白ESTs（expressed sequence tags）,其中19个β-TUB基因被克隆。通过比较WT和无绒无絮突变体（fuzzless-lintless,fl）转录组,明确其中9个β-TUB基因参与棉花纤维发育。肌动蛋白微丝由肌动蛋白（actin）分子螺旋状聚合成。LI等[16]在陆地棉中发现了15个编码肌动蛋白的基因—GhACT1—GhACT15,其中GhACT1主要在棉纤维细胞中表达。抑制GhACT1表达会破坏棉纤维细胞骨架网络,进而影响棉纤维伸长。通过酵母双杂交和体外F-actin结合试验,一些肌动蛋白结合蛋白（actin binding protein,ABP）被鉴定,如GhPLIM1[77]、GhWLIM5[78]、GhCFE1A[79]、GhPFN2[80]、ADF1（actin depolymerizing factor）[81-82]、WLIM1a[83]等。转录水平上的显著变化表明它们参与棉纤维发育,且可能通过与肌动蛋白互作参与调节棉纤维细胞骨架。体外试验表明GhPLIM1与GhWLIM5能够保护F-actin不被微丝解聚素B（Latrunculin B）解聚[77-78]。过量表达GhCFE1A或GhPFN2能够显著抑制棉纤维细胞伸长,可能是ABPs的过量表达打乱了肌动蛋白骨架网络,从而导致纤维细胞伸长的终止[79-80]。下调ADF1表达显著增加了棉纤维细胞中肌动蛋白微丝的丰度、细胞壁厚度和纤维素含量,使棉纤维长度和强度显著提高[81],而在烟草中过表达ADF1则显著降低其下胚轴长度和根毛数量,这表明ADF1可能在棉纤维发育中起重要的负调控作用。但过量表达WLIM1a,棉纤维细胞壁变得更薄和紧密,纤维长度、强度和细度得到改善。这可能与WLIM1a在陆地棉纤维发育中的双重作用有关。WLIM1a不仅是肌动蛋白的成束者,还可作为转录因子激活苯丙氨酸脱氨酶-box（Phe ammonia lyase-box）类基因的表达,通过苯丙烷合成途径参与棉纤维细胞壁木质素（lignin）的合成[83]。5 糖代谢相关基因
木聚糖（xylan）是棉纤维细胞壁的一种重要的半纤维素（hemicellulose）组成成分。LI等[84]在棉纤维中鉴定了2个编码糖基转移酶（glycosyltransferases）的基因—GhGT43A1和GhGT43C1,其中GhGT43A1在15 DPA和20 DPA棉纤维中特异表达。在拟南芥中分别过量表达这两个基因,均能显著增加木聚糖的积累,表明这两个糖基转移酶基因可能通过调节棉纤维细胞壁中木聚糖积累来影响棉纤维发育。尿苷二磷酸木糖（uridine diphosphatexylose,UDP-Xyl）是合成半纤维素（hemicellulose）和果胶多糖（pectic polysaccharide）等非纤维素物质的重要底物。在陆地棉中,PAN等[85-86]成功克隆了3个合成UDP-Xyl的重要基因—GhUXS1-3（UDP-glucuronate decarboxylase,尿苷二磷酸葡萄醛酸脱羧酶）,转录水平上的变化表明它们参与棉纤维发育,但功能分析与调节机制还有待进一步的研究。木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase,XTH）是植物细胞壁重构过程中的关键酶,拥有使细胞壁松弛的功能,因而具有通过调节棉纤维细胞壁的可塑性参与棉纤维发育的潜在性[87-89]。MICHAILIDIS等[87]在陆地棉中发现2个GhXTH1,但只有GhXTH1-1在棉纤维伸长期特异表达。LEE等[88]通过将GhXTH1在棉花中超表达进一步证实了该基因参与棉纤维伸长。SHAO等[89]通过短纤维棉突变体（li1li1）进一步明确9—15DPA是XTH活力增加和上调棉纤维伸长的关键时期。通过转基因的方法,RUAN等[90]证明了蔗糖合酶（sucrose synthase,Sus）在棉纤维细胞起始和伸长过程中发挥重要作用。之后,JIANG等[91]从陆地棉中克隆了一个Sus基因GhSusA1,发现过量表达GhSusA1能够改善棉纤维长度和强度,这可能与其增加了棉纤维细胞壁的厚度相关。另外,半乳糖醛酸转移酶（galacturonosyltransferase）[92]、果胶裂解酶（pectate lyase）[93]、磷脂酰肌醇4-激酶（phosphatidylinositol 4-kinase）[94]等也被报道参与棉纤维的发育。
6 脂肪酸代谢相关基因
脂肪酸不仅是棉籽作为油料作物的主要成分,其代谢也影响着棉纤维的发育,特别是极长链脂肪酸（very long-chain fatty acid,VLCFA）,它具有显著促进棉纤维发育的作用[95]。通过应用乙烯合成抑制剂和检测ACO转录水平,QIN等[95]初步推测VLCFA合成在乙烯合成的上游,意味着VLCFA是通过调控乙烯合成促进棉纤维伸长。WANG等[96]通过同位素标记相对和绝对定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术和RNA-Seq技术,在陆地棉胚珠蛋白组中发现2 005个蛋白参与花期棉纤维发育过程,其中很多基因/蛋白富集到脂肪酸代谢路径。目前,已经有几个参与棉纤维发育的脂肪酸合成基因被报道,如VLCFA合成第3步反应的GhPAS2（3-hydroxyacyl-CoA dehydratase,3-酮酯酰-CoA脱水酶）[96]、脂肪酸延长第4步反应的GhECR（Trans-2- enoyl-CoA reductase,反式烯脂酰-CoA还原酶）[97]、KCS（3-ketoacyl-CoA synthase,3-酮酯酰乙酰辅酶A合成酶）[6, 98-99]及KCR（3-ketoacyl-CoA reductase,3-酮酯酰乙酰辅酶A还原酶）[100]等。利用酵母遗传互补法很好地确定了这些棉花基因的脂肪酸合成功能,但关于这些基因参与棉纤维发育的研究还仅限于转录水平。因而,关于脂肪酸代谢及其相关基因调控棉纤维发育的机制还有待进一步研究。7 活性氧
活性氧（reactive oxygen species,ROS）是氧分子的活跃形态,包括羟自由基（HO-）、超氧阴离子（O2·-）、过氧化氢（H2O2）、单态氧（1O2）[101],其在棉纤维发育过程中具有重要作用。1999年,POTIKHA等[102]首次发现H2O2在棉纤维次生细胞壁分化过程中可作为发育信号分子。MEI等[103]从陆地棉中克隆到一个编码第三类过氧化物酶（peroxidase）的基因GhPOX,其主要在快速伸长的棉纤维细胞中表达,可能通过影响ROS的产生参与调节棉纤维伸长。APX（ascorbate peroxidase）是另一种重要的ROS清除酶。GhAPX1AT/DT在棉纤维伸长期优势表达[104] GhAPX1AT/DT,其对H2O2含量的调节被认为是棉花纤维伸长发育的关键调控机制之一[105]。最近,ZHANG等[106]发现,GhFAnnxA的表达与棉花纤维品质显著相关,并证明了GhFAnnxA能够通过调控Ca2+流、ROS稳态等影响棉纤维的伸长及次生细胞壁的合成。8 其他功能基因
8.1 水通道蛋白（aquaporin）
NAOUMKINA等[107]利用RNA-seq技术对陆地棉单基因显性突变体Li1（Ligon lintless-1）和Li2（Ligon lintless-2）的研究中发现,水通道蛋白是这两个突变体中下调表达最显著的基因家族之一,由此表明该家族在棉纤维发育过程中发挥重要作用。陆地棉中至少包含71个编码水通道蛋白的基因[108],但目前被进一步证明与棉纤维发育相关的有5个PIPs（plasma- membrane intrinsic proteins）基因,其中GhPIP1-2属于GhPIP1亚组[109],其余4个属于GhPIP2亚组[110],根据在棉纤维中的优先或特异表达推测它们参与棉纤维的发育。在棉花中敲除GhPIP2亚组基因能够显著抑制棉纤维的伸长,而在酵母中过量表达这些基因则可使宿主细胞纵向显著伸长。酵母双杂交等试验表明,GhPIP2;3能够与GhPIP2;4和GhPIP2;6相互作用,推测这些棉花PIP2组蛋白通过选择性地形成异源寡聚体参与棉纤维的快速伸长[110]。8.2 14-3-3蛋白
在植物中,14-3-3蛋白是一种能够与其他蛋白发生互作的、具有调节功能的酸性蛋白。目前,已报道的与棉纤维发育相关的编码14-3-3蛋白的基因共6个,分别是Gh14-3-3L[111]、Gh14-3-3a、Gh14-3-3e、Gh14-3-3f、Gh14-3-3g和Gh14-3-3h[112]。Q-PCR表明它们在棉纤维快速伸长期高水平表达。在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中分别表达Gh14-3-3L、Gh14-3-3a和Gh14-3-3e 3个基因,均能促进酵母细胞纵向生长[112]。在棉花中过表达Gh14-3-3L能够促进棉纤维伸长,而抑制Gh14-3-3L、Gh14-3-3e和Gh14-3-3h则导致棉纤维细胞起始分化和伸长减缓[113]。这进一步表明Gh14-3-3在棉纤维细胞发育中发挥重要作用。此外,在转Gh14-3-3（L、e和h）棉花内,GhBZR1、GhBIN2、GhXTH1、GhEXP、GhCesA5和GhTUB1等基因的表达也受到了显著影响。蛋白互作试验证明Gh14-3-3L与GhBZR1间能够互作,并且GhBIN2对GhBZR1的磷酸化可增强这种作用。酵母单杂交表明GhBZR1能够与GhXTH1和GhEXP启动子发生结合。综合这些结果,推测Gh14-3-3可能通过作用于GhBZR1使其调控下游基因转录而参与棉纤维细胞发育[113]。9 问题与展望
目前,中国科研工作者已经率先完成了A、D 2个二倍体棉,四倍体陆地棉和海岛棉的基因组测序工作[114-119]。如果把基因比作一个个文字,那么基因组就像一本厚厚的字典,今后的工作就是为这些“字”加上注释,并最终付诸于育种应用。全基因组生物信息学分析和转录组测序技术可以更快和更系统地发现目的基因,但棉花的转基因不仅费时费力,而且许多基因型并不适合遗传转化,这使得棉花基因功能的验证工作进展缓慢。虽然模式生物酵母细胞的伸长和拟南芥表皮毛的发育模型使研究棉纤维发育相关基因变得简单,但这毕竟不能替代在棉花上进行基因功能验证,而VIGS技术的出现为快速验证棉纤维发育基因功能带来了希望,因为该技术不需要棉花遗传转化,而且似乎不受棉种的基因型影响[120]。虽然在棉纤维发育相关基因的研究方面已经取得了可喜的成绩,但与Bt转基因抗虫棉相比,棉纤维品质遗传改良还需要更扎实的理论积累和技术开发。The authors have declared that no competing interests exist.
